Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取酸棗多糖工藝研究

賈東升，崔施展，謝曉亮，溫春秀，李榮喬，劉銘

（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

Box-Benhnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取酸棗多糖工藝研究

賈東升，崔施展，謝曉亮*，溫春秀，李榮喬，劉銘

（河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，藥用植物研究中心，河北石家莊050051）

利用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)超聲波輔助提取酸棗多糖工藝進(jìn)行優(yōu)化。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇超聲波功率、超聲時(shí)間和液料比為考察因素，以酸棗多糖提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用Box-Behnken響應(yīng)面法考察各個(gè)因素及其交互作用對(duì)酸棗多糖提取得率的影響。最佳提取工藝為：超聲波功率為360W，超聲時(shí)間為23 min，液料比為45∶1（mL/g）。在優(yōu)化提取工藝參數(shù)條件下提取3批酸棗，平均提取得率為（4.8±0.69）%（n＝3）。利用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波輔助提取酸棗多糖工藝，方法簡便，預(yù)測(cè)性良好。

超聲波輔助提??；酸棗多糖；Box-Behnken響應(yīng)面法

酸棗為鼠李科植物酸棗的干燥成熟果實(shí)，原產(chǎn)于中國，多分布于北方。酸棗仁是常用的中藥食材，酸棗除去果核的果肉部分仍具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和保健功能，但酸棗果肉的利用程度較低，造成大量資源浪費(fèi)。近年來對(duì)植物多糖的研究報(bào)道日趨增多，多糖具有多種生物活性。目前大量的藥理實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，酸棗多糖具有提高機(jī)體免疫力、降血糖、降血脂、抗衰老、抗?jié)?、抗血栓形成、抗突變，改善睡眠，增?qiáng)機(jī)體耐缺氧能力，清除自由基，抑制腫瘤等多種活性[1-2]，是現(xiàn)代養(yǎng)生的重要食材。

超聲波輔助提取作為一種先進(jìn)的提取方法，通過超聲波對(duì)細(xì)胞壁產(chǎn)生的破碎效應(yīng)，從而可以提高了提取成分的效率。由于超聲波提取工藝較傳統(tǒng)的熱提取工藝具有提取效率高、操作方便、無需加熱等優(yōu)點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于植物多糖的提取[3-5]。本試驗(yàn)以酸棗多糖提取得率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在超聲功率、超聲時(shí)間和液料比3個(gè)單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面法優(yōu)化超聲波提取酸棗多糖的工藝參數(shù)，為開發(fā)利用酸棗果肉資源及工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

JY92-Ⅱ超聲細(xì)胞破碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；BP-211D電子天平：德國賽多利斯公司；DL-6000B離心機(jī)：湖南賽特湘儀離心機(jī)儀器有限公司；UV-3紫外可見分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司；CFB高速萬能粉碎機(jī)：北京市長風(fēng)儀器儀表公司。

1.2 材料與試劑

酸棗（產(chǎn)地：河北邢臺(tái)）；無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（批號(hào)：20140506）：中國藥品生物制品檢定所；苯酚（分析純）：華東醫(yī)藥股份有限公司；硫酸（分析純）：華東醫(yī)藥股份有限公司；苯酚（分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水（自制）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取105℃烘干至恒重的無水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品2.0 g，精密稱定，蒸餾水定容至100 mL，配制成含20.0 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。精密移取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.5、1、2.0、5.0 mL 置于 100 mL 容量瓶，加蒸餾水定容，配制成含 0.02、0.04、0.1、0.2、0.4、1.0 mg/mL 系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別移取上述系列葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液各2 mL，另取2 mL蒸餾水作空白試驗(yàn)，置20 mL具塞玻璃試管中，分別加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，充分渦旋，冷卻至室溫，在490 nm波長處測(cè)定溶液的吸光度值。得回歸方程：A＝0.008 3C-0.0031，r＝0.9999，表明葡萄糖在 0.005mg/mL～0.25mg/mL范圍內(nèi)濃度與吸光度值呈良好的線性關(guān)系。

1.3.2 酸棗多糖的超聲波輔助提取工藝

取干燥去核酸棗果肉，粉碎后過100目篩，得到酸棗果肉干粉。稱取適量酸棗干粉，加入到適量純化水浸泡2 h，轉(zhuǎn)移到超聲波提取器中，按照不同條件進(jìn)行超聲波輔助提取。將提取后的樣品溶液轉(zhuǎn)移到離心機(jī)3 000 r/min，離心10 min進(jìn)行分離，得到酸棗多糖提取液。

1.3.3 酸棗多糖含量測(cè)定

參照文獻(xiàn)[6]采用苯酚-硫酸法測(cè)定酸棗中多糖含量。具體步驟如下：取2 mL酸棗多糖提取液置20 mL具塞玻璃試管中，加入5%苯酚溶液1 mL，迅速加入濃硫酸5 mL，充分渦旋，冷卻至室溫，在490 nm波長處測(cè)定溶液的吸光度值。將測(cè)得的吸光值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算得到酸棗多糖濃度，將酸棗多糖濃度帶入下式計(jì)算得酸棗多糖提取得率。

酸棗多糖提取得率/%＝（CV×稀釋倍數(shù)）/M×100

式中：C為測(cè)得吸光度對(duì)應(yīng)的濃度，mg/mL；V為提取液的體積，mL；M為酸棗干粉重量，mg。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

按照“1.3.2”項(xiàng)下提取工藝進(jìn)行酸棗多糖提取，以酸棗多糖提取得率為考察指標(biāo)，分別對(duì)影響提取工藝的因素（超聲波功率、超聲時(shí)間、液料比）進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察提取工藝中的各因素對(duì)酸棗多糖提取得率的影響。其中，超聲波功率選取 100、200、300、400、500、600 W 6 個(gè)水平，超聲時(shí)間選取 5、10、15、20、25、30、35、40、45 min 9 個(gè)水平，液料比選取 20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）6 個(gè)水平。

1.3.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取超聲波功率（X1，W）、超聲時(shí)間（X2，min）和液料比（X3，mL/g）為自變量，酸棗多糖提取得率（Y，%）為響應(yīng)值，采用 Box-Benhnken響應(yīng)面法對(duì)酸棗多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并且按最佳提取條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。因素水平見表1，工藝優(yōu)化試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)水平表Table 1 Variables in the Box-Behnken design

2 結(jié)果與討論

2.1 超聲波輔助提取酸棗多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲波功率對(duì)酸棗多糖提取得率的影響

固定液料比為40∶1（mL/g），超聲波提取時(shí)間為25 min的條件下，分別按超聲波功率為100、200、300、400、500、600 W 6個(gè)水平提取酸棗多糖，計(jì)算酸棗多糖提取得率，結(jié)果如圖1所示。

圖1 超聲波功率對(duì)酸棗多糖提取得率的影響Fig.1 Effects of ultrasonic power on extraction rate of Wild jujube Polysaccharides

由超聲波功率對(duì)酸棗多糖提取得率的影響結(jié)果表明，隨著超聲功率的增大，酸棗多糖提取得率呈逐漸增加趨勢(shì)，在400 W時(shí)多糖提取得率出現(xiàn)峰值。繼續(xù)增加超聲功率，多糖提取得率反而下降，因此需要對(duì)超聲功率進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)酸棗多糖提取得率的影響

固定液料比為40∶1（mL/g），超聲波功率為400 W的條件下，分別按超聲時(shí)間為 5、10、15、20、25、30、35、40、45 min 9個(gè)水平提取酸棗多糖，計(jì)算酸棗多糖提取得率，結(jié)果如圖2所示。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)酸棗多糖提取得率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on extraction rate of Wild jujube Polysaccharides

由超聲時(shí)間對(duì)酸棗多糖提取得率的影響結(jié)果表明，隨著超聲提取時(shí)間的增加，酸棗多糖提取得率呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)，在20 min時(shí)多糖提取得率出現(xiàn)峰值。繼續(xù)延長超聲時(shí)間，多糖提取得率幾乎不變。

2.1.3 液料比對(duì)酸棗多糖提取得率的影響

固定超聲波功率為400 W，超聲波提取時(shí)間為25 min 的條件下，分別按液料比選取20∶1、30∶1、40∶1、50 ∶1、60 ∶1、70 ∶1（mL/g）6 個(gè)水平提取酸棗多糖，計(jì)算酸棗多糖提取得率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 液料比對(duì)酸棗多糖提取得率的影響Fig.3 Effects of liquid-solid ratio on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

由液料比對(duì)酸棗多糖提取得率的影響結(jié)果表明，隨著液料比的降低，酸棗多糖提取得率出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在液料比為40∶1（mL/g）時(shí)，酸棗多糖提取得率出現(xiàn)峰值，因此需要對(duì)液料比進(jìn)一步優(yōu)化。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以酸棗多糖提取得率（Y，%）為因變量，選取超聲波功率（X1，W）、超聲時(shí)間（X2，min）和液料比（X3，mL/g）為自變量，采用三因素三水平的Box-Benhnken響應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化酸棗多糖提取得率（Y，%），試驗(yàn)設(shè)計(jì)及響應(yīng)值結(jié)果見表2。

采用“Design expert 7.0”試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件，對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，以評(píng)價(jià)因變量分別對(duì)各自變量進(jìn)行方程回歸擬合及方差分析，結(jié)果見表3。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)表與響應(yīng)值Table 2 Box-Behnken experiment design independent（X）and dependent variables（Y）

表3 回歸方程中系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)Table 3 Significance test of coefficient in regression equation

對(duì)表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到酸棗多糖提取得率對(duì)所選3個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸方程為：Y＝4.67-0.11X1+0.076X2+0.063X3+0.20X1X2-0.025X1X3+0.050X2X3-1.17X12-0.70X22-0.73X32

對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果表明，方程的模型顯著（P＜0.05），說明模型有意義；失擬差不顯著（P＞0.05），說明模型與試驗(yàn)值的差異較小，該模型擬合程度良好，可以用回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。表3中一次項(xiàng)X1、X2和X3水平均顯著（P＜0.05）；交互作用項(xiàng) X1X2、X1X3和 X2X3水平不顯著（P＜0.05）；二次項(xiàng) X12、X22、X32水平均極顯著（P＜0.01）。

2.2.2 響應(yīng)面分析圖

考察所擬合的響應(yīng)曲面的形狀，分析超聲功率、超聲時(shí)間和液料比對(duì)酸棗多糖提取得率的影響，等高線的形狀可反映出交互效應(yīng)的強(qiáng)弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反。各因素之間的交互作用對(duì)酸棗多糖提取得率影響的等高線見圖4～圖6。

圖4 自變量X1，X2與因變量Y的等高線圖Fig.4 Contour plot showing the effect of the X1and X2on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

圖5 自變量X1，X3與因變量Y的等高線圖Fig.5 Contour plot showing the effect of the X1and X3on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

由圖4可知，表明超聲波功率和超聲時(shí)間的交互作用對(duì)酸棗多糖提取得率影響較大。從等高線形狀可以看出，在液料比為恒定值的條件下，隨著超聲波功率的增加，多糖提取得率先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值；隨著超聲時(shí)間的增加，多糖提取得率先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值。

圖6 自變量X2，X3與因變量Y的等高線圖Fig.6 Contour plot showing the effect of the X2and X3on extraction rate of Wild jujube Polysaccharide

由圖5可知，表明超聲波功率和液料比的交互作用對(duì)酸棗多糖提取得率影響較大。從等高線形狀可以看出，在超聲時(shí)間為恒定值的條件下，隨著超聲波功率的增加，多糖提取得率先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值；隨著液料比的增加，多糖提取得率先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值。

由圖6可知，表明超聲時(shí)間和液料比的交互作用對(duì)酸棗多糖提取得率影響較大。從等高線形狀可以看出，在超聲波功率為恒定值的條件下，隨著超聲時(shí)間的增加，多糖提取得率先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值；隨著液料比的增加，多糖提取得率先增大后減小，在中心點(diǎn)處出現(xiàn)峰值。

2.2.3 優(yōu)化工藝參數(shù)驗(yàn)證

以酸棗多糖提取得率最大值為目標(biāo)，根據(jù)“Design Expert 7.0”試驗(yàn)設(shè)計(jì)軟件得最優(yōu)超聲波輔助提取工藝參數(shù)為：超聲波功率360 W，超聲時(shí)間23 min，液料比45∶1（mL/g）。按照“1.3.2”項(xiàng)下超聲波輔助提取工藝，以優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取酸棗多糖。3批酸棗多糖平均提取得率為（4.8±0.69）%（n＝3），試驗(yàn)觀測(cè)值與模型預(yù)測(cè)值偏差為3.69%，可知，試驗(yàn)觀察值和模型預(yù)測(cè)值比較接近，說明模型預(yù)測(cè)性良好。

3 結(jié)論

以酸棗多糖提取得率為考察指標(biāo)，通過對(duì)酸棗多糖提取條件的單因素考察和響應(yīng)面分析，得到超聲波提取酸棗多糖的最佳工藝條件為：超聲波功率360 W，超聲時(shí)間 23 min，液料比 45∶1（mL/g），以優(yōu)化后的工藝參數(shù)提取酸棗多糖。結(jié)果顯示，3批酸棗多糖平均提取得率為 4.8%±0.69%（n＝3）。

超聲波的作用機(jī)制主要包括機(jī)械破碎和空化作用[7-8]。超聲波在介質(zhì)傳播過程中，引起介質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的交替壓縮和伸張，這種作用能顯著地增大溶劑進(jìn)入提取物細(xì)胞的滲透性，加強(qiáng)傳質(zhì)過程，從而強(qiáng)化了提取效率；當(dāng)介質(zhì)處于稀疏狀態(tài)時(shí)，介質(zhì)會(huì)被撕裂成很多小的空穴，這些空穴一瞬間閉合，閉合時(shí)產(chǎn)生瞬間高壓，即稱為空化效應(yīng)，這種空化效應(yīng)可加速待測(cè)物中的有效成分進(jìn)入到提取液中，增加有效成分的溶出。

超聲波提取技術(shù)應(yīng)用于酸棗多糖的提取，具有提取效率高、提取時(shí)間短，更重要的是提取過程避免加熱，從而防止因高溫對(duì)酸棗多糖分子結(jié)構(gòu)的破壞，是酸棗多糖實(shí)現(xiàn)工業(yè)化提取較為理想的一種提取新工藝，對(duì)充分利用酸棗資源有現(xiàn)實(shí)參考意義。

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Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction Process of Wild jujube Polysaccharide Based on Box-Benhnken Response Surface Methodology

JIA Dong-sheng，CUI Shi-zhan，XIE Xiao-liang*，WEN Chun-xiu，LI Rong-qiao，LIU Ming
（Institute of Cash Crops of Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences，Centre of Medicinal Plant Research，Shijiazhuang 050051，Hebei，China）

To optimize the process of ultrasonic-assisted extraction technology of Polysaccharide from Wild jujube using Box-Benhnken response surface methodology.The single-factor extraction tests and response surfaceanalysis were employed to optimize the technological conditions，including ultrasonic power，ultrasonic time and liquid/solid ratios.The experiment results indicated that the optimal extraction conditions were ultrasonic power of 360 W，ultrasonic time 23 min，liquid/solid ratios 45 ∶1（mL/g），respectively.Under these conditions，3 batchs Polysaccharide from Wild jujube were extracted.The average extraction rate of Wild jujube Polysaccharides was （4.8±0.69）%（n＝3）.The ultrasonic-assisted extraction process of Wild jujube Polysaccharides using Box-Behnken response surface methodology was simple and good predictability.

ultrasonic-assisted extraction；Wild jujube Polysaccharides；Box-Behnken response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.14.010

河北太行山區(qū)特色功能保健食品的開發(fā)研究（11231005D）

賈東升（1982—），男（漢），副研究員，碩士研究生，主要從事中藥功能食品研究。

*通信作者：謝曉亮（1962—），男，研究員，博士，主要從事中藥資源、中藥加工研究。

2015-03-30