申玉 楊璞 郝晉 經(jīng)典 唐舸 趙志河

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院正畸科（四川大學(xué)），成都 610041

·綜述·

DNA 甲基化在調(diào)節(jié)干細(xì)胞成骨分化中的作用

申玉 楊璞 郝晉 經(jīng)典 唐舸 趙志河

口腔疾病研究國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 華西口腔醫(yī)院正畸科（四川大學(xué)），成都 610041

DNA甲基化和去甲基化是表觀遺傳學(xué)的重要機(jī)制之一，在細(xì)胞分化、增殖、衰老等方面具有重要的調(diào)控作用。干細(xì)胞在成骨分化過程中成骨特異性基因發(fā)生去甲基化進(jìn)而表達(dá)上調(diào)，而與干細(xì)胞多能分化潛能相關(guān)的基因發(fā)生高甲基化進(jìn)而表達(dá)抑制。DNA甲基化和去甲基化的動態(tài)變化和平衡，對于協(xié)調(diào)基因表達(dá)的時(shí)序性和抑制不和諧的分化表型具有重要作用，是干細(xì)胞成骨分化的重要保證。成骨分化中甲基化修飾機(jī)制的異常不僅會影響干細(xì)胞的正常成骨分化功能，并且與多種骨骼常見疾病的發(fā)生發(fā)展具有密切的關(guān)系。本文綜述了干細(xì)胞成骨分化過程中受DNA甲基化修飾調(diào)控的相關(guān)基因和調(diào)控機(jī)制的新進(jìn)展，以及DNA甲基化修飾異?？赡軐?dǎo)致的骨骼疾病。

DNA甲基化； DNA去甲基化； 成骨分化； 表觀遺傳學(xué)

表觀遺傳學(xué)是指在沒有改變細(xì)胞核內(nèi)DNA序列的情況下，發(fā)生的基因表達(dá)的可逆的、可遺傳的變化，其中包括DNA甲基化、組蛋白甲基化、組蛋白乙酰化、微小RNA（microRNA，miRNA）和非編碼長鏈RNA等。DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)調(diào)控的重要機(jī)制之一，是一種由DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferases，DNMTs）介導(dǎo)的，將具有活性的甲基轉(zhuǎn)移至胞嘧啶-鳥嘌呤（CpG）雙核苷酸中胞嘧啶的C5位點(diǎn)上的酶促反應(yīng)[1]。目前普遍認(rèn)為，DNA序列的高甲基化狀態(tài)與基因表達(dá)的抑制相關(guān)聯(lián)。DNA的去甲基化與DNA甲基化的作用相反，特定序列發(fā)生去甲基化引起的DNA甲基化程度降低，往往導(dǎo)致基因表達(dá)水平上升。然而近年發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化程度與基因表達(dá)的反向調(diào)節(jié)關(guān)系并不絕對成立。DNA去甲基化參與多種細(xì)胞進(jìn)程，但是對于DNA去甲基化的具體機(jī)制和通路仍有諸多爭議[2]。

以往對于DNA甲基化修飾的研究[3]多集中于胚胎干細(xì)胞，DNA甲基化修飾對于胚胎干細(xì)胞的自我更新能力、多向分化能力和衰老等都具有至關(guān)重要的作用；而DNA甲基化修飾對成體干細(xì)胞的功能影響，尤其是細(xì)胞分化的影響，目前尚未完全明確，屬于研究的熱點(diǎn)問題。DNA的甲基化和去甲基化具有時(shí)間性和空間性，在增強(qiáng)子和啟動子區(qū)域的甲基化修飾的動態(tài)變化可調(diào)控有序的基因表達(dá)。干細(xì)胞的正常分化不僅需要通過DNA甲基化等機(jī)制沉默多余基因、抑制不和諧的分化表型的出現(xiàn)，更需要DNA去甲基化等機(jī)制來促進(jìn)組織特異性基因的選擇性表達(dá)。DNA的甲基化修飾出現(xiàn)異常，不僅影響細(xì)胞的正常分化功能，更與疾病的發(fā)生發(fā)展以及治療策略密切相關(guān)。多種骨骼疾病的發(fā)生，包括骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎等，都與干細(xì)胞成骨分化的DNA甲基化修飾機(jī)制出現(xiàn)障礙密切相關(guān)[4]。研究表觀遺傳學(xué)在干細(xì)胞成骨分化中的作用機(jī)制不僅有利于闡明相關(guān)骨骼疾病的發(fā)生機(jī)制，更有利于骨再生相關(guān)的組織工程學(xué)的發(fā)展。本文將綜述近年來對于DNA甲基化修飾的新進(jìn)展，以及DNA甲基化修飾在干細(xì)胞成骨分化過程中的調(diào)控機(jī)制。

1 DNA甲基化和去甲基化調(diào)控基因表達(dá)的基本機(jī)制

DNA甲基化由DNMTs催化發(fā)生。根據(jù)反應(yīng)中參與的酶的不同以及反應(yīng)過程的差異，DNA甲基化可以分為從頭甲基化和維持甲基化。在DNA的半保留復(fù)制過程中，只有親代鏈?zhǔn)羌谆?，維持甲基化酶DNMT1催化新合成的DNA鏈進(jìn)行甲基化修飾，這個(gè)過程稱為維持甲基化。從頭甲基化是指不依賴于已有的甲基化DNA鏈，而在一個(gè)新位點(diǎn)將DNA鏈中胞嘧啶C5位點(diǎn)甲基化，由從頭甲基化酶DNMT3a 和DNMT3b催化發(fā)生。然而，有研究[5]采用DNMTs基因靶向抑制與全基因組測繪的方法，進(jìn)一步分析每種DNMTs的功能特異性，發(fā)現(xiàn)DNMT1與DNMT3a/ 3b的功能存在部分重疊，從頭甲基化酶DNMT3a/3b也具有一定的維持甲基化酶的作用。實(shí)驗(yàn)[5]證實(shí)，DNMT3a/3b在DNA去甲基化的早期被招募，提示DNMT3a/3b還可能參與了去甲基化的過程。此外，DNA甲基化酶還包括兩種特殊的類型：DNMT3L和DNMT2。DNMT2具有相對較低的催化活性，缺失DNMT2后不會對全基因組的甲基化狀態(tài)和細(xì)胞分化表型有明顯影響。DNMT3L本身不具有催化DNA甲基化的活性，但它可以與DNMT3a或者DNMT3b相結(jié)合，不僅可以促進(jìn)DNMT3a或者DNMT3b的催化活性，而且可以增加DNMT3a或者DNMT3b對于DNA鏈的親和性。除通過DNMT3L途徑，還有學(xué)者[6]應(yīng)用質(zhì)譜分析的研究方法發(fā)現(xiàn)，即使沒有DNMT3L的存在，DNMT3a與DNMT3b也可以在體內(nèi)外直接結(jié)合形成復(fù)合物，相互促進(jìn)催化活性。當(dāng)DNMT3a與DNA結(jié)合后，組蛋白的H3尾部也參與調(diào)節(jié)DNMT3a的活化，組蛋白的H3尾部與DNMT3a的植物同源結(jié)構(gòu)域（plant homeodomain，PHD）相結(jié)合，引起了DNMT3a的化學(xué)變構(gòu)，從而活化DNMT3a[7]。

相對于DNA甲基化機(jī)制，關(guān)于DNA去甲基化的研究相對較少，但近年來越來越多地受到學(xué)者的關(guān)注。DNA去甲基化可分為主動去甲基化與被動去甲基化。在DNA半保留復(fù)制過程中，DNMT1的催化活性受到抑制，導(dǎo)致子鏈DNA的維持甲基化進(jìn)程出現(xiàn)障礙，進(jìn)而導(dǎo)致甲基化胞嘧啶的水平降低，該過程稱為被動去甲基化。而主動去甲基化過程不依賴于DNA的復(fù)制過程，主要分為兩種形式，其一是通過Ten eleven translocation（Tet）酶家族氧化C5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）轉(zhuǎn)化為5-羥甲基胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）[1]。另一種則是通過胞嘧啶脫氨基酶將甲基化修飾的胞嘧啶轉(zhuǎn)化為腺嘌呤或者胸腺嘧啶，不配對的堿基被切除，導(dǎo)致去甲基化的發(fā)生[8]。2009年，Tahiliani等[9]證實(shí)小鼠胚胎干細(xì)胞中有5hmC的存在，并驗(yàn)證了Tet酶通過催化5mC轉(zhuǎn)化為5hmC從而參與了表觀遺傳學(xué)的調(diào)控。其后許多研究陸續(xù)開始關(guān)注Tet蛋白家族對基因表達(dá)和細(xì)胞功能的影響。Tet蛋白為DNA甲基化的主要去除酶，它的氧化產(chǎn)物可作為去甲基化發(fā)生的中間產(chǎn)物被進(jìn)一步清除，同時(shí)5hmC也可直接與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，作為獨(dú)立的表觀遺傳標(biāo)志物發(fā)揮作用[10]。Tet蛋白家族包括Tet1、Tet2和Tet3，無論單獨(dú)敲除還是聯(lián)合敲除3種Tet蛋白基因，胚胎發(fā)育和干細(xì)胞分化都會出現(xiàn)不同程度的障礙，說明Tet蛋白酶對于正常的發(fā)育和分化具有至關(guān)重要的作用[5,10-12]。

雖然DNA的高甲基化普遍被認(rèn)為與基因抑制相關(guān)聯(lián)，但越來越多的研究發(fā)現(xiàn)這一關(guān)聯(lián)并不絕對，DNA甲基化程度與基因表達(dá)的關(guān)系可能取決于序列中CpG的含量，發(fā)生甲基化修飾的位點(diǎn)等多種因素。大約70%的人類基因的啟動子區(qū)域都擁有CpG密集的區(qū)域既CpG島，可根據(jù)CpG比例、GC含量和CpG富集區(qū)域的長度，將啟動子分為3個(gè)等級，即高CpG啟動子（high-CpG promoters，HCPs）、低CpG啟動子（low-CpG promoters，LCPs）和中等CpG啟動子（intermediate-CpG promoters，ICPs）。HCPs即使在基因表達(dá)抑制時(shí)仍然處于低甲基化，而LCPs則一般處于高甲基化狀態(tài)，ICPs相對特殊，它的甲基化可隨著發(fā)育和分化出現(xiàn)動態(tài)變化，大多數(shù)的組織特異性甲基化都發(fā)生在ICPs。有研究[13]發(fā)現(xiàn)，dlx5基因的CpG島岸區(qū)域而非CpG島的甲基化水平降低，導(dǎo)致dlx5表達(dá)的上調(diào)，提示CpG島岸區(qū)域也是調(diào)控基因表達(dá)差異的關(guān)鍵區(qū)域。近年來DNA甲基化修飾對于增強(qiáng)子區(qū)域的調(diào)控作用也開始逐漸引起關(guān)注和研究。增強(qiáng)子區(qū)域有含量較高的5hmC存在，而Tet家族參與了增強(qiáng)子區(qū)域的5hmC的動態(tài)變化[14]。另有研究[15]發(fā)現(xiàn)，DNMT1也與基因增強(qiáng)子區(qū)域的甲基化狀態(tài)密切相關(guān)，增強(qiáng)子的正常甲基化狀態(tài)受到干擾后出現(xiàn)基因表達(dá)時(shí)序上的錯(cuò)亂，從而引起分化的延遲。DNA甲基化可通過多種機(jī)制抑制基因的表達(dá)：甲基化的CpG可阻礙轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合；通過改變?nèi)旧|(zhì)的構(gòu)象間接介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄抑制；甲基化的DNA位點(diǎn)還可結(jié)合轉(zhuǎn)錄抑制因子，如甲基CpG結(jié)合蛋白（methyl-CpG binding proteins，MBPs）等[16]。這種調(diào)節(jié)模式在多種細(xì)胞中被普遍證實(shí)但并不絕對，轉(zhuǎn)錄因子亦可與甲基化的序列進(jìn)行交互作用，非啟動子甲基化與組織特異性基因的轉(zhuǎn)錄也可成正相關(guān)[2]。

2 DNA甲基化和去甲基化調(diào)控成骨分化相關(guān)基因

在干細(xì)胞的成骨分化過程中，DNA甲基化和去甲基化通過上述基本機(jī)制參與調(diào)節(jié)多種相關(guān)基因的表達(dá)。干細(xì)胞向特定表型分化時(shí)，相應(yīng)的組織特異性基因表達(dá)上調(diào)，并伴隨著其他分化方向基因的沉默，從而抑制不和諧表型的表達(dá)，同時(shí)與干細(xì)胞多向分化能力相關(guān)的基因也發(fā)生下調(diào)，這對維護(hù)干細(xì)胞正常分化功能具有重要意義。具體到成骨分化過程中，DNA甲基化機(jī)制參與調(diào)控的成骨標(biāo)志基因發(fā)生高表達(dá)，并與DNA序列發(fā)生去甲基化相一致[13,17-22]（表1），而干細(xì)胞多向分化潛能相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生抑制，并與相應(yīng)基因啟動子區(qū)域的甲基化程度升高相關(guān)聯(lián)[23-25]（表2）。例如在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過程中，可以檢測到成骨特異性基因Dlx5、Runx2、Bglap和Osterix的表達(dá)均發(fā)生上調(diào)，DNA甲基化測序進(jìn)一步證實(shí)Dlx5、Runx2、Bglap和Osterix的促進(jìn)子區(qū)域DNA甲基化水平發(fā)生明顯下降，DNA的甲基化水平與其基因的表達(dá)呈明顯的相關(guān)性；抑制DNA去甲基化酶的作用后，這些基因的表達(dá)隨之發(fā)生逆轉(zhuǎn)，由此可以推斷：Dlx5、Runx2、Bglap和Osterix在脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化中主要受到DNA甲基化機(jī)制的調(diào)控[18]。與成骨特異性基因相反，同樣在脂肪來源的間充質(zhì)干細(xì)胞中，多能分化潛能相關(guān)基因NANOG的甲基化水平則隨著成骨分化的發(fā)生而上調(diào)，伴隨NANOG表達(dá)量明顯下降[23]。

表 1 受DNA甲基化修飾調(diào)控的成骨分化標(biāo)志基因Tab 1 Osteogenic differentiation marker gene regulated by DNA methylation modification

表 2 成骨分化中受DNA甲基化修飾調(diào)控的多能分化相關(guān)基因Tab 2 Multiple differentiation related genes regulated by DNA methylation in osteogenic differentiation

干細(xì)胞的成骨分化受到多種信號通路的調(diào)節(jié)，其中Wnt通路起到至關(guān)重要的作用。目前為止，在哺乳動物中至少發(fā)現(xiàn)了19個(gè)Wnt蛋白。Wnt通路中的關(guān)鍵信號分子亦受到DNA甲基化的調(diào)控，通過影響Wnt通路的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，DNA甲基化間接調(diào)控干細(xì)胞的成骨向分化表型。受體酪氨酸激酶樣孤核受體2（receptor tyrosine kinase like orphan receptor 2，Ror2）作為非經(jīng)典Wnt信號通路的共受體，已被證明在經(jīng)典和非經(jīng)典的Wnt信號通路中均起到重要作用。Ror2在形態(tài)發(fā)育中不可或缺，特別是骨骼發(fā)育，可以通過誘導(dǎo)成骨轉(zhuǎn)錄因子Osterix而改變干細(xì)胞的分化表型，在向成骨細(xì)胞分化中Ror2表達(dá)不斷增加，然后隨著細(xì)胞分化為骨細(xì)胞而下調(diào)。Ror2啟動子的去甲基化過程開始于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的第8天，并持續(xù)到第21天成骨分化完成[26]。另外，DNA甲基化修飾還參與調(diào)節(jié)Wnt5a和Wnt8a的表達(dá)，DNA甲基化調(diào)節(jié)機(jī)制異常可擾亂Wnt通路信號分子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化障礙[27-28]。

3 DNA的甲基化修飾與骨骼疾病

DNA甲基化參與調(diào)節(jié)多種成骨相關(guān)基因的表達(dá)，而這些調(diào)控機(jī)制出現(xiàn)異常則可能是導(dǎo)致相關(guān)骨骼疾病的發(fā)病機(jī)制之一。骨質(zhì)疏松癥和骨關(guān)節(jié)炎是常見的骨骼疾病。骨質(zhì)疏松癥表現(xiàn)為系統(tǒng)性的骨礦物質(zhì)含量（bone mineral content，BMC）和骨礦物質(zhì)密度（bone mineral density，BMD）降低，而骨關(guān)節(jié)炎患者則表現(xiàn)為關(guān)節(jié)周圍的骨形成增加，還可能呈現(xiàn)普遍的骨量增高。骨質(zhì)疏松所導(dǎo)致的骨密度和強(qiáng)度的改變，同樣也表現(xiàn)在頜骨之中。牙槽骨的BMC 和BMD隨著骨質(zhì)疏松的進(jìn)展而逐漸降低[29]。BMC和BMD的下降，是口腔常見的疾病——牙周炎的危險(xiǎn)因子之一，與牙周疾病的嚴(yán)重程度之間存在明顯的相關(guān)性[30]。除此之外，骨骼系統(tǒng)性疾病也間接影響到多種口腔診療技術(shù)的治療效果。在骨質(zhì)疏松模型中，正畸矯治力導(dǎo)致的牙齒移動速度明顯加快，并且在正畸治療結(jié)束后的復(fù)發(fā)概率較對照組增加[31]。通過動物模型研究[32]發(fā)現(xiàn)，骨質(zhì)疏松癥還影響種植體植入后的骨整合過程。因此，研究系統(tǒng)性骨骼疾病的發(fā)病機(jī)制具有重要的臨床意義。

DNA甲基化機(jī)制可能是一些常見骨骼疾病的發(fā)病機(jī)制之一。García-Ibarbia等[27]將骨質(zhì)疏松伴隨髖部骨折患者的骨組織樣品與骨關(guān)節(jié)炎患者相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前者成骨細(xì)胞的Wnt信號通路的活性降低，并發(fā)現(xiàn)Wnt信號相關(guān)基因Fzd10、Tbl1x、Csnk1e、Wnt8A、Csnk1a1l、Sfrp4的甲基化狀態(tài)存在差異，這可能有助于解釋骨質(zhì)疏松和骨關(guān)節(jié)炎的表觀遺傳學(xué)機(jī)制。另一項(xiàng)研究[13]利用DNA甲基化芯片技術(shù)檢測了髖部骨關(guān)節(jié)炎和髖部骨質(zhì)疏松骨折患者的骨樣本，探討全基因的DNA甲基化模式在兩種疾病中的差異，結(jié)果顯示，共有241個(gè)Cpg位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)出現(xiàn)明顯的差異；生物信息學(xué)分析表明，差異的位點(diǎn)多與細(xì)胞成骨分化和骨骼胚胎發(fā)育相關(guān)，尤其是Homeobox家族基因。脊柱韌帶骨化?。╫ssifications of the yellow ligaments，OYL）的病理學(xué)機(jī)制表現(xiàn)為脊柱韌帶的異位骨化，間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨分化的趨勢增加。有學(xué)者從OYL患者的脊柱韌帶中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，與具有正常分化能力的間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行全基因組的基因表達(dá)對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OYL的間充質(zhì)干細(xì)胞中Wnt5A和膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（glial cell derived neurotrophic factor，GDNF）基因的表達(dá)量增高，并且伴隨啟動子區(qū)域明顯的去甲基化改變。這些結(jié)果提示，OYL患者的間充質(zhì)干細(xì)胞通過啟動子的去甲基化修飾促進(jìn)Wnt5A和GDNF基因的表達(dá)從而造成成骨分化亢進(jìn)[28]。另外，長期服用類固醇激素可導(dǎo)致骨壞死，分離檢測患者的間充質(zhì)干細(xì)胞顯示成骨分化趨勢減弱；進(jìn)一步研究表明，三磷酸腺苷結(jié)合盒蛋白B亞家族成員1基因的高甲基化狀態(tài)可能與間充質(zhì)干細(xì)胞分化趨勢偏移有相關(guān)性[33]。

DNA甲基化和去甲基化的動態(tài)平衡是干細(xì)胞成骨分化的重要保證，DNA甲基化修飾的表觀遺傳學(xué)機(jī)制出現(xiàn)異常不僅會影響到干細(xì)胞成骨分化功能，而且與許多常見骨骼疾病的發(fā)生發(fā)展有密不可分的關(guān)系。因此，探究DNA甲基化修飾在成骨分化中的作用，不僅對于骨組織工程學(xué)具有重要的意義，而且可以為多種相關(guān)疾病的治療提供可能的靶點(diǎn)。

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（本文編輯 吳愛華）

Role of DNA methylation in regulation of osteogenic differentiation of stem cells

Shen Yu, Yang Pu, Hao Jin, Jing Dian, Tang Ge, Zhao Zhihe.
(State Key Laboratory of Oral Diseases, Dept. of Orthodontics, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Supported by: National Natural Science Foundation of China (31470904); Science and Technology Project of Sichuan Province (2013SZ0057). Correspondence: Zhao Zhihe, E-mail: zhzhao@scu.edu.cn.

DNA methylation and demethylation are two important mechanisms of epigenetics, which is important in the study of cell differentiation, proliferation, and senescence. During osteogenic differentiation of stem cells, the expression of osteogenic specific genes and demethylated promoters is upregulated, whereas the expression of pluripotent genes and hypermethylated promoters is downregulated. The dynamic changes and balance between DNA methylation and demethylation are important for the coordination of gene expression and the inhibition of improper phenotypes. Abnormal changes in the methylation modification mechanism in osteogenic differentiation not only affect the normal function of stem cells but are also associated with the occurrence and development of many common skeletal diseases. This paper reviews the new progress of DNA methylation and demethylation in regulating osteogenic differentiation. The possible skeletal diseases caused by abnormal DNA methylation are also presented.

DNA methylation; DNA demethylation; osteogenic differentiation; epigenetics

Q 75

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.019

2016-02-25；

2016-05-21

國家自然科學(xué)基金（31470904）；四川省科技計(jì)劃（20-13SZ0057）

申玉，碩士，E-mail：dentistshenyu@foxmail.com

趙志河，教授，博士，E-mail：zhzhao@scu.edu.cn