許立俠 徐紅梅 朱曉英 孫麗梅

武警總醫(yī)院口腔科，北京 100039

3D 激光掃描顯微鏡下牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)的觀察和分析

許立俠 徐紅梅 朱曉英 孫麗梅

武警總醫(yī)院口腔科，北京 100039

目的 通過3D激光掃描顯微鏡觀察牙本質(zhì)齲的微結(jié)構(gòu)，為臨床上齲病的防治及相關(guān)研究提供形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。方法 收集6顆新鮮拔除的有齲壞的第三磨牙，均制備成橫剖面標(biāo)本，在3D激光掃描顯微鏡下進(jìn)行光學(xué)、激光彩色及3D形貌圖的觀察。結(jié)果 在樣本整體結(jié)構(gòu)中，光鏡下可見病變組織的輪廓，激光彩色鏡下較清晰分辨兩層牙本質(zhì)病變；在微結(jié)構(gòu)中，激光彩色圖下可以觀察到透明層牙本質(zhì)小管部分閉合，脫礦層管周和管間牙本質(zhì)數(shù)目較少，細(xì)菌侵入層管周和管間牙本質(zhì)均破壞，相鄰小管融合，呈串珠樣和橢圓形病灶，壞死崩解層無正常牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)。3D形貌圖下可根據(jù)顏色的不同觀察到四層結(jié)構(gòu)。結(jié)論 3D激光掃描顯微鏡能夠分辨牙本質(zhì)齲的兩層病變組織結(jié)構(gòu)，觀察到牙本質(zhì)四層結(jié)構(gòu)中牙本質(zhì)小管、管周、管間牙本質(zhì)的不同改變，是觀察牙本質(zhì)微結(jié)構(gòu)的有力工具。同時(shí)牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)的形態(tài)對(duì)臨床上齲病的防治及相關(guān)研究具有理論指導(dǎo)意義。

牙本質(zhì)齲； 3D激光掃描顯微鏡； 小管； 微結(jié)構(gòu)

牙本質(zhì)是位于釉質(zhì)和牙髓之間的夾層結(jié)構(gòu)，富含牙本質(zhì)小管，當(dāng)牙本質(zhì)齲壞病變時(shí)，小管結(jié)構(gòu)的改變尤為突出。研究者們根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)方法的不同將牙本質(zhì)齲壞分為不同層次。Ogushi等[1]將牙本質(zhì)齲分為內(nèi)外兩層：外層為細(xì)菌感染層，無機(jī)物脫礦，有機(jī)物分解，不能再礦化，臨床上應(yīng)該徹底去除；內(nèi)層無細(xì)菌，無機(jī)物稍微脫礦，有機(jī)物未分解，可以再礦化，臨床上可以保留。而現(xiàn)在多數(shù)學(xué)者[2]將牙本質(zhì)齲的病變?cè)诮M織學(xué)上由病損深部向表面分為透明層、脫礦層、細(xì)菌侵入層和壞死崩解層。還有的學(xué)者[3]將牙本質(zhì)齲變層描述為粉色、淡粉色、透明色和基本正常。但每一層的微結(jié)構(gòu)變化均不同。早期對(duì)于牙本質(zhì)齲病結(jié)構(gòu)的觀察是通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）[4]，近年來原子力顯微鏡的應(yīng)用較為普遍，但這些方法均有不足。TEM觀察前需對(duì)標(biāo)本脫水及真空處理會(huì)導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的改變，且僅能以黑白色進(jìn)行觀察，不能夠反映樣本的真實(shí)結(jié)構(gòu)。原子力顯微鏡雖能夠反映樣本的真實(shí)結(jié)構(gòu)，但要求標(biāo)本的表面光滑細(xì)致，且掃描圖貌耗時(shí)長(zhǎng)。3D激光掃描顯微鏡作為微納米科學(xué)研究的重要工具之一，近年來在口腔生物材料的研究領(lǐng)域中獲得了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的青睞[5]。本文運(yùn)用3D激光掃描顯微鏡對(duì)牙本質(zhì)齲整體和局部微結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，為研究牙本質(zhì)齲的相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，也對(duì)臨床上牙本質(zhì)淺齲的再礦化治療提供一定的形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和設(shè)備

Hank’s平衡鹽溶液[6]（Hanks balanced salt solution，HBSS）：400 mg·L-1KCl、60 mg·L-1KH2PO4、8 000 mg·L-1NaCl、1 000 mg·L-1葡萄糖、90 mg·L-1Na2HPO4·7H2O、350 mg·L-1NaHCO3、140 mg·L-1CaCl2、100 mg·L-1MgSO4·7H2O和100 mg·L-1MgCl2· 6H2O；3D激光掃描顯微鏡（Keyence公司，日本）。

1.2 離體牙的收集

收集武警總醫(yī)院口腔頜面外科拔出的新鮮第三磨牙，從中挑選出6顆平滑面齲（圖1）。

圖 1 牙體切割示意圖Fig 1 The abirdged general view of tooth cutting

齲壞均為白堊色，患者年齡20～35歲，患者均知情同意并簽署同意書。去離子水下用潔牙機(jī)超聲清洗表面軟組織和牙石，沖洗干凈后置于HBSS溶液中4 ℃保存?zhèn)溆茫?周內(nèi)使用。

1.3 牙齒標(biāo)本的制備

將收集的離體牙用硬組織切割機(jī)將牙體組織通過病變區(qū)域沿中線縱切，暴露出牙本質(zhì)齲變橫剖面（圖1）。然后用環(huán)氧自凝樹脂包埋各牙齒并標(biāo)記，拋光機(jī)及240、320、600、800、1 000號(hào)碳化硅砂紙?jiān)诹魉乱来文テ?、拋光后，超聲下振蕩清? min，沖洗吹干后在3D激光掃描顯微鏡下進(jìn)行光學(xué)顯微、激光彩色及3D形貌圖的觀察比較。

2 結(jié)果

2.1 牙本質(zhì)齲整體結(jié)構(gòu)的形貌觀察圖

在光學(xué)顯微形貌圖中（200倍和400倍）可以觀察到病變組織由釉質(zhì)齲沿釉牙本質(zhì)界擴(kuò)展而來的牙本質(zhì)齲的大體輪廓，外層顏色較深，而內(nèi)層顏色稍淡。但在1 000倍下形貌分層模糊不清。在激光彩色形貌圖中可清晰地觀察到齲壞病變分為兩層，1 000倍下分層明確，牙本質(zhì)小管也清晰可見，牙本質(zhì)小管大多管腔開口，散落在整個(gè)牙本質(zhì)中；也有呈管束狀的牙本質(zhì)小管（圖2）。

2.2 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)的激光彩色圖

在3 000倍下的激光彩色圖中可以觀察到牙本質(zhì)齲四層微結(jié)構(gòu)的變化（圖3）。正常牙本質(zhì)小管管腔清晰，管周牙本質(zhì)明顯，管間牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)完整（圖3a）。位于牙本質(zhì)齲最深層的透明層，牙本質(zhì)小管變窄，有的完全阻塞（圖3b）；透明層表面的脫礦層，牙本質(zhì)小管形態(tài)較完整，管周牙本質(zhì)和管間牙本質(zhì)數(shù)目減少，管周可見較大的白色礦物質(zhì)沉積物（圖3c）；近脫礦層的細(xì)菌侵入層，局部小管管壁膨脹，擴(kuò)張變形，管周牙本質(zhì)被壓迫，管間牙本質(zhì)破壞，相鄰小管相互融合，呈串珠樣結(jié)構(gòu)。病變進(jìn)一步進(jìn)展，被破壞的小管進(jìn)一步融合，形成橢圓形的液化壞死灶（紅色彎曲箭頭所示）；釉牙本質(zhì)界處的壞死崩解層，幾乎無正常牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)，完全崩解破壞，為全黑色空隙，齲洞從釉牙本質(zhì)界處形成。

2.3 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)全貌3D形貌圖

1 000倍下以3D格式顯示激光彩色形貌圖，以不同顏色顯示3D圖像的色階，左側(cè)顏色條顯示與顏色對(duì)應(yīng)的高度值，紅色光標(biāo)（用于上限）和藍(lán)色光標(biāo)（用于下限）。牙本質(zhì)從釉牙本質(zhì)界處到健康牙本質(zhì)組織的顏色由藍(lán)色向紅色過渡，即高度由低向高過渡；釉質(zhì)牙本質(zhì)界處組織凹陷，以藍(lán)色居多，高度較低（圖4）。

2.4 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)局部3D形貌圖

3 000倍下以3D格式顯示的激光彩色形貌圖更立體形象地顯示了各層牙本質(zhì)齲變及微結(jié)構(gòu)的形態(tài)變化。同樣以不同顏色顯示3D圖像的色階，紅色區(qū)域可代表正常牙本質(zhì)，淡紅色和橙黃色區(qū)域可代表牙本質(zhì)齲的內(nèi)層即透明層和脫礦層，黃綠色區(qū)域和藍(lán)色及尖峰狀區(qū)域可代表牙本質(zhì)齲的外層即細(xì)菌侵入層和壞死崩解層（圖5）。

圖 2 牙本質(zhì)齲的整體結(jié)構(gòu)形貌圖Fig 2 Topography of the whole structure in dentin caries lesions

圖 3 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)激光彩色圖 3D激光掃描顯微鏡 × 3 000Fig 3 Laser color topography of the microstructure in dentin caries lesions 3D laser scanning microscope × 3 000

圖 4 牙本質(zhì)齲全貌3D圖 3D激光掃描顯微鏡 × 1 000Fig 4 Three-dimensional observation of the whole structure in dentin caries lesions 3D laser scanning microscope × 1 000

圖 5 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)局部3D形貌圖 3D激光掃描顯微鏡 × 3 000Fig 5 Three-dimensional observation of the microstructure in dentin caries lesions 3D laser scanning microscope × 3 000

3 討論

3.1 3D激光掃描顯微鏡的成像原理

3D激光掃描顯微鏡以微納米尺度對(duì)樣品三維表面形貌進(jìn)行測(cè)量，測(cè)量精度可達(dá)到0.001 μm。其成像原理采用了“激光光源”和“白色光源”2路光源方式。通過這2個(gè)光源獲得構(gòu)建彩色全焦點(diǎn)圖像、激光全焦點(diǎn)圖像、高低圖像所必要的色彩、光量、高度的信息。首先通過短波長(zhǎng)激光檢測(cè)反射光量和高度。從激光顯微系統(tǒng)的激光光源發(fā)出的光線經(jīng)由XY掃描光學(xué)系統(tǒng)、接物透鏡聚光至對(duì)象物體上。聚光后的點(diǎn)光源通過XY掃描光學(xué)系統(tǒng)在觀察視野內(nèi)進(jìn)行面掃描。在觀察視野內(nèi)分割成1 024×768像素運(yùn)行掃描，并由受光組件檢測(cè)各像素的反射光。將接物透鏡在Z軸方向上驅(qū)動(dòng)，反復(fù)運(yùn)行面掃描，獲得各像素的各Z軸位置處的反射光量。將反射光量最高的Z軸位置設(shè)為焦點(diǎn)，檢測(cè)高度信息和反射光量。這樣便可獲得整體對(duì)焦的光量全焦圖像和高低圖像信息。其次，使用彩色電荷耦合器件（Charge Coupled Device，簡(jiǎn)稱CCD攝像機(jī)）檢測(cè)白光源的發(fā)射光。CCD攝像機(jī)在每個(gè)像素的基礎(chǔ)上，使用激光束獲取焦點(diǎn)位置的顏色信息。前期實(shí)驗(yàn)應(yīng)用3D激光顯微鏡觀察到早期釉質(zhì)齲的納米結(jié)構(gòu)，釉柱頭部晶體變大，釉質(zhì)間隙增寬，釉柱鞘連續(xù)性中斷等顯著變化[7]。

3.2 牙本質(zhì)齲微結(jié)構(gòu)形態(tài)的分析

由于點(diǎn)隙窩溝解剖結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，會(huì)干擾齲變的形態(tài)學(xué)研究，所以本實(shí)驗(yàn)以平滑面齲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。牙本質(zhì)齲多是由釉質(zhì)齲進(jìn)一步向深層發(fā)展而來，部分也可由牙根部牙骨質(zhì)齲發(fā)展所致。牙本質(zhì)全層存在牙本質(zhì)小管，齲損沿釉牙本質(zhì)界擴(kuò)散，同時(shí)沿牙本質(zhì)小管進(jìn)展，病程較快。牙本質(zhì)齲中小管的改變較為突出，是研究牙本質(zhì)齲病變的主要分析對(duì)象。

在整體結(jié)構(gòu)中，光學(xué)顯微鏡下僅能在低倍鏡下觀察到病變組織的大體輪廓，高倍鏡下分層結(jié)構(gòu)模糊不清，微結(jié)構(gòu)改變更是難以辨識(shí)。而在激光彩色圖貌中，不僅低倍鏡下病變組織分層明確，高倍鏡下牙本質(zhì)小管清晰可見，病變組織處的牙本質(zhì)小管數(shù)目減少，釉牙本質(zhì)界處齲損也很明確。

在微結(jié)構(gòu)中，激光彩色形貌圖可清晰地觀察到牙本質(zhì)小管、管周牙本質(zhì)、管間牙本質(zhì)等微結(jié)構(gòu)的變化。接近正常組織的透明層牙本質(zhì)小管管腔變窄，部分小管完全阻塞。而近透明層處仍可見正常牙本質(zhì)小管，管周牙本質(zhì)明顯，管間牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)完整。透明層又稱為硬化層，是牙本質(zhì)齲最早出現(xiàn)的改變，由于牙本質(zhì)小管管腔中有礦物質(zhì)沉積，使小管管腔變窄，隨著礦物質(zhì)沉積增多，最終將牙本質(zhì)小管管腔完全阻塞。Ogawa等[8]在顯微硬度分析中發(fā)現(xiàn)，此層硬度和正常牙本質(zhì)相比較低，表明透明層存在一定的脫礦。本實(shí)驗(yàn)觀察到管周和管間牙本質(zhì)的無機(jī)物降解現(xiàn)象，而激光彩色（光學(xué)）形貌圖是一種在測(cè)量后用激光強(qiáng)度圖像和光學(xué)圖像合成的全幅對(duì)焦光學(xué)圖像，用顏色對(duì)各高度像素進(jìn)行標(biāo)示，由CCD相機(jī)按每1像素分別提取，再轉(zhuǎn)換成激光高分辨率圖像。牙體組織的脫礦、礦物質(zhì)溶解等可能導(dǎo)致牙本質(zhì)表面高度的改變，從而在激光彩色形貌圖中體現(xiàn)出顏色的改變。脫礦層中牙本質(zhì)小管的形態(tài)較完整，但直徑相對(duì)變大，管周和管間牙本質(zhì)數(shù)目減少，說明存在脫礦現(xiàn)象。有部分管周牙本質(zhì)小管有白色較大礦物質(zhì)沉積，表明同時(shí)存在再礦化現(xiàn)象[9]。而在臨床上洞型制備時(shí)是否保留此層深部質(zhì)硬的牙本質(zhì)一直存在爭(zhēng)議。Iwami等[10]研究表明脫礦層雖已脫礦軟化，但部分軟化牙本質(zhì)是無菌的。Besinis等[11]研究也表明軟化牙本質(zhì)可再礦化。此外，保存此層牙本質(zhì)并隨后充填，即使存在一些受感染的牙本質(zhì)，只要充填物保持完整，病變即不會(huì)進(jìn)展。因此在脫礦層軟化牙本質(zhì)深方質(zhì)硬且著色的牙本質(zhì)在洞型制備時(shí)不需去除。而馮希平[12]在牙體充填后繼發(fā)齲的產(chǎn)生和預(yù)防中總結(jié)出絕大多數(shù)充填體再次充填是因?yàn)樵l(fā)性齲病，因此認(rèn)為應(yīng)將這些軟化牙本質(zhì)徹底去除。細(xì)菌侵入層可觀察到小管管壁腫脹、擴(kuò)張變形，相鄰小管相互融合，呈串珠樣外觀等破壞輕微的現(xiàn)象。同時(shí)可看到被破壞的小管進(jìn)一步融合，形成橢圓形壞死灶等破壞較嚴(yán)重的階段。造成細(xì)菌侵入層現(xiàn)象的原因是由于細(xì)菌侵入，小管內(nèi)細(xì)菌大量繁殖，小管壁脫礦，蛋白溶解，局部小管由于細(xì)菌團(tuán)塊的增加，管壁膨脹擴(kuò)張變形，管周牙本質(zhì)首先被壓迫，隨后壓迫管間牙本質(zhì)，隨著管周和管間牙本質(zhì)的脫礦加劇，膠原纖維變性分解，管周牙本質(zhì)破壞，相鄰小管融合呈串珠樣外觀。病變進(jìn)一步發(fā)展，被破壞的小管持續(xù)融合，形成橢圓形的壞死灶。此層內(nèi)有細(xì)菌感染，臨床上應(yīng)該徹底清除。在壞死崩解層，幾乎無正常牙本質(zhì)結(jié)構(gòu)，釉牙本質(zhì)界處齲洞形成。

透明層、脫礦層、細(xì)菌侵入層、壞死崩解層的形成是一種動(dòng)態(tài)的過程，很難具體劃分界限，而3D激光掃描顯微鏡記錄一個(gè)樣品在最大光強(qiáng)度時(shí)每個(gè)像素的光電倍增管激光強(qiáng)度數(shù)據(jù)和實(shí)際高度數(shù)據(jù)（一種內(nèi)置光學(xué)線性刻度值）。以不同顏色顯示3D圖像的色階，顏色色階對(duì)應(yīng)相應(yīng)的高度值。3D顯示時(shí)，能夠以立體鏡方式查看圖像。牙本質(zhì)齲中礦物質(zhì)溶解，可能會(huì)使牙本質(zhì)表面高低發(fā)生改變。因此在3D形貌圖中，可以通過顏色的不同大體區(qū)分不同組織病變，而且立體形象。紅色區(qū)域可代表正常牙本質(zhì)；牙本質(zhì)齲的內(nèi)層即透明層和脫礦層，脫礦程度較輕微，可呈現(xiàn)出淡紅色和橙黃色；黃綠色區(qū)域和藍(lán)色及尖峰狀區(qū)域可代表牙本質(zhì)齲的外層即細(xì)菌侵入層和壞死崩解層，齲壞脫礦較嚴(yán)重。

綜上所述，本研究應(yīng)用3D激光掃描顯微鏡可以觀察到牙本質(zhì)齲四層牙本質(zhì)小管、管周和管間牙本質(zhì)等微結(jié)構(gòu)的不同改變，進(jìn)一步驗(yàn)證了內(nèi)層即透明層和脫礦層，雖有少量微結(jié)構(gòu)脫礦，但存在再礦化現(xiàn)象，為進(jìn)一步研究牙本質(zhì)齲的相關(guān)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，也對(duì)臨床上牙本質(zhì)淺齲的再礦化治療提供了形態(tài)學(xué)理論依據(jù)。

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（本文編輯 杜冰）

Observation and analysis of microstructure of dentin caries lesions through 3D laser scanning microscope

Xu Lixia, Xu Hongmei, Zhu Xiaoying, Sun Limei.
(Dept. of Stomatology, The General Hospital of Armed Police Force, Beijing 100039, China)

Supported by: The Second Kind Foundation of General Hospital of Armed Police Force(WZ201024). Correspondence: Xu Hongmei, E-mail: hmxu@163.com.

Objective Microstructural changes in dentin carious lesions were investigated using a 3D laser scanning microscope, which has a morphological theoretical foundation in the further study of clinical caries disease prevention and treatments. Methods Six fresh extracted caries molars were prepared into cross-section specimens. The sections were examined by 3D and laser measuring morphology. Results Zones were identified in the lesions on the basis of their optical appearance. Two zones were identified in the lesions on the basis of their laser appearance. The microstructure showed that the tubular was partly closed in transparent dentin; peritubular and intertubular dentin were reduced in the zone of demineralization; peritubular and intertubular dentin were damaged and fused; a beaded sample and oval lesions formed in the zone of bacterial invasion; and abnormal dentin structure was present in the zone of destruction on the basis of their laser appearance. Four zones were identified in the lesions according to their colors, as determined from their 3D appearance. Conclusion 3D laser scanning microscope may be a powerful, accessible, and non-destructive technique, as it identified the lesion and tubular zones, as well as peritubular and intertubular dentin in the four zones’ lesions. The microstructure of dentin caries lesions may have significant merit in the evaluation of clinical prevention and treatment.

dentin caries; 3D laser scanning microscope; tubular; microstructure

R 781.1

A [doi] 10.7518/hxkq.2016.05.017

2016-03-25；

2016-07-12

武警總醫(yī)院院內(nèi)資助項(xiàng)目二類（WZ201024）

許立俠，住院醫(yī)師，碩士，E-mail：xulixia2007@126.com

徐紅梅，副主任醫(yī)師，碩士，E-mail：h_m_xu@163.com