濃香型白酒窖泥變質(zhì)前后真菌群落差異分析

于春濤，劉超，陳瑞玲，朱鳳林，劉振江

（1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001；2.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責(zé)任公司，河北石家莊054000）

濃香型白酒窖泥變質(zhì)前后真菌群落差異分析

于春濤1，劉超1，陳瑞玲1，朱鳳林1，劉振江2

（1.滄州醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北滄州061001；2.河北省寧晉縣泥坑酒業(yè)有限責(zé)任公司，河北石家莊054000）

窖泥變質(zhì)是北方酒廠面臨的重大難題，通過直接提取窖泥真菌總DNA，利用高通量測(cè)序的方法擴(kuò)增18S rDNA并構(gòu)建基因文庫(kù)，分析窖泥變質(zhì)前后真菌群落組成。結(jié)果表明，窖泥變質(zhì)前基因序列數(shù)為9737條，歸為2個(gè)門，優(yōu)勢(shì)真菌主要為：小囊菌屬（74.21%）、青霉菌屬（10.03%）、假裸囊菌屬（9.99%）等；窖泥變質(zhì)后基因序列數(shù)達(dá)到了78322條，歸為19個(gè)門，優(yōu)勢(shì)真菌主要為：青霉菌屬（76.56%）、假裸囊菌屬（6.73%）、纖孔菌屬（5.96%）、絲蓋傘屬（2.93%）等。窖泥變質(zhì)前后真菌的種類和豐度均有顯著差異，為全面了解窖泥變質(zhì)提供了理論依據(jù)。

窖泥；變質(zhì)；真菌群落；差異分析；高通量測(cè)序

濃香型白酒的生產(chǎn)以窖池中的窖泥為基礎(chǔ)，窖池中龐大的微生物群落在發(fā)酵過程進(jìn)行著復(fù)雜的物質(zhì)代謝和能量代謝，從而促進(jìn)了窖泥老熟和酒質(zhì)的提高［1］。法國(guó)人A.Calmette較早開展酒類微生物的研究，建立了可以利用淀粉發(fā)酵生產(chǎn)酒精的“阿米露法”［2］。我國(guó)濃香型白酒廠分布廣、數(shù)量多，關(guān)于菌群結(jié)構(gòu)及其變化規(guī)律的研究成果更為豐富。廖建民等［3］對(duì)多個(gè)國(guó)家名優(yōu)酒廠不同季節(jié)、不同貯存期的樣本進(jìn)行了研究，獲得真菌94株，其中霉菌69株、酵母菌25株。窖泥中功能真菌具有產(chǎn)酒精、產(chǎn)酶及產(chǎn)香作用［4］。為了揭示“窖泥產(chǎn)香”的奧秘，我國(guó)學(xué)者對(duì)窖泥功能微生物進(jìn)行了大量的分離、純化和鑒定工作，目前從窖泥中分離的微生物以細(xì)菌為主，對(duì)真菌研究很少。然而如果對(duì)窖泥管理不善，窖泥中微生態(tài)平衡被破壞，微生物代謝出現(xiàn)異常，致使窖泥出現(xiàn)板結(jié)變硬、腐敗氣味等變質(zhì)現(xiàn)象［5-7］，導(dǎo)致酒質(zhì)下降，沒有窖香，不具有濃香型白酒的風(fēng)格，會(huì)給酒廠帶來很大的經(jīng)濟(jì)損失。因此研究窖泥真菌群落的動(dòng)態(tài)變化，檢測(cè)出窖泥變質(zhì)前后主要優(yōu)勢(shì)真菌，對(duì)人工窖泥培養(yǎng)和提高濃香型白酒質(zhì)量尤為重要。

由于自然界中只有0.1%～10%的微生物可以直接培養(yǎng)，傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法難以全面準(zhǔn)確地反映窖泥生態(tài)系統(tǒng)微生物的真實(shí)情況［8-9］。近年來隨著微生物生態(tài)學(xué)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)越來越多的應(yīng)用于窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化規(guī)律的研究，不少學(xué)者研究分析窖泥的群落組成，如羅惠波［10］、黃治國(guó)［11］等通過PCR-SSCP結(jié)合聚類分析技術(shù)比較瀘州老窖不同的窖齡的窖泥中細(xì)菌和古菌的群落差異。鄧依等［12］通過細(xì)菌rDNA ITSAFLP結(jié)合聚類分析技術(shù)比較了多糧發(fā)酵新老窖池間的細(xì)菌群落差異。但是對(duì)窖泥變質(zhì)前后具體的真菌群落結(jié)構(gòu)的報(bào)道比較少。

Illumina Solexa合成測(cè)序是近幾年發(fā)展起來的一項(xiàng)全新的高通量DNA測(cè)序技術(shù)，具有高準(zhǔn)確性、高通量、高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)，可以同時(shí)完成傳統(tǒng)基因組學(xué)研究（測(cè)序和注釋）以及功能基因組學(xué)（基因表達(dá)及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究，已廣泛應(yīng)用于探索土壤、海洋和濕地，以及食品發(fā)酵和廢水處理反應(yīng)器等微生物區(qū)系研究，并取得了豐碩的研究成果［13-14］。目前，利用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)窖泥中真菌群落結(jié)構(gòu)的研究還未見文獻(xiàn)報(bào)道。本研究利用該方法對(duì)窖泥變質(zhì)前后真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析，為全面、系統(tǒng)地揭示窖泥變質(zhì)前后微生物群落結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

樣品采集：窖泥樣品取自河北某知名酒廠釀酒車間優(yōu)質(zhì)窖泥（FNK1）和變質(zhì)窖泥（PNK1）。取樣方法是FNK1從優(yōu)質(zhì)窖池的窖壁和窖底各取3點(diǎn)樣共100 g，PNK1從變質(zhì)窖池的窖壁和窖底各取3點(diǎn)樣共100 g，分裝后密封冷凍保存。

主要試劑：E.Z.N.A.Soil DNA Kit（OMEGA）、Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒（Life）、Taq DNA Polymerase（Thermo）、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒（上海生工）。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1窖泥預(yù)處理及總DNA提?。?5］

稱取0.2 g樣品放入含有0.5 g磁珠的5 mL離心管中，加入1 mL SLX-mLus Buffer，漩渦2 min。經(jīng)OMEGA土壤DNA提取試劑盒，反復(fù)凍融、離心，收集上清液。粗提的窖泥DNA通過PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，純化后的窖泥DNAPCR擴(kuò)增效果良好。

1.2.2PCR擴(kuò)增及對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳

利用Qubit2.0 DNA檢測(cè)試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)應(yīng)加入的DNA量。PCR所用的已經(jīng)融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)的NS1-Fung通用引物：NS1引物：CCTACACGACGCTCTTCCGATCTN（barcode）GTAGTCATATGCTTGTCTC，F(xiàn)ung引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAATTCCCCGTTACCCGTTG。PCR體系按照如下進(jìn)行：10×PCR buffer 5 μL，dNTP（10 mM each）0.5 μL，Genomic DNA 10 ng，Bar-PCR primer F（50 uM）0.5 μL，Primer R（50 uM）0.5 μL，Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL，H20 add to 50 μL。配制好的PCR體系按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增：94℃變性3 min，接下來進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，分別是94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s；再接著25個(gè)循環(huán)，分別是94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，72℃延伸5 min，然后進(jìn)行第2輪擴(kuò)增，引入lllumina橋式PCR兼容引物。PCR結(jié)束后，產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，對(duì)DNA進(jìn)行回收。

1.2.318S rDNA擴(kuò)增片段的測(cè)序、質(zhì)控和聚類［16-18］

采用lllumina Miseq測(cè)序平臺(tái)對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)得的基因序列經(jīng)質(zhì)量控制軟件Prinsep處理，去除barcode、兩端primer以及部分低質(zhì)量基因序列。

對(duì)測(cè)得的基因序列采用uclust軟件進(jìn)行OTU聚類，通常域值的序列相似性定位0.97，操作分類單元被認(rèn)為可能屬于屬。

1.2.4對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類，比較窖泥變質(zhì)前后真菌結(jié)構(gòu)差異

物種分類采用的軟件為RDP classifier，基于OTU聚類的結(jié)果，獲取每一個(gè)OTU聚類的代表序列，分別是長(zhǎng)度最長(zhǎng)序列（length）、豐度最大序列（abundance）和所有序列（ALL）形成3份結(jié)果，并對(duì)各類RDP分析。本文所有的展示，均使用OTU_ALL中的數(shù)據(jù)，genus水平進(jìn)行展示，采用柱形圖及表格的形式對(duì)比窖泥變質(zhì)前后群落結(jié)構(gòu)差異。

1.2.5MEGAN分析

使用MEGAN軟件，通過交互式搜索NCBI中的分類數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以樹狀圖形式表現(xiàn)物質(zhì)豐度情況與菌落結(jié)構(gòu)，反應(yīng)窖泥變質(zhì)前后真菌的組成情況。

2　結(jié)果與分析

2.1窖泥變質(zhì)前后真菌18SrDNANS1-Fung電泳圖譜（圖1）

圖1　真菌18S rDNANS1-Fung電泳圖譜

由圖1所示，3條泳道對(duì)比得知，泳道1和泳道2有較清晰的條帶，DNA提取時(shí)一般都通過試劑盒過柱提取，這種柱子有固定孔徑，從而決定了基因組片段的大小。泳道1比泳道2亮，說明窖泥變質(zhì)后真菌數(shù)量和豐度均有所提高?；蛐蛄虚L(zhǎng)度大部分分布在400～600 bp之間，基本滿足分析需要。

2.2窖泥變質(zhì)前后18S rDNA多樣性分析

2.2.118S rDNA處理后序列數(shù)

擴(kuò)增后的PCR產(chǎn)物去除嵌合體和靶區(qū)域序列，得到的基因序列數(shù)見表1。

表1　處理后基因序列統(tǒng)計(jì)表

綜合表1處理后的基因序列數(shù)表明，窖泥變質(zhì)后的序列數(shù)顯著高于變質(zhì)前，說明窖泥變質(zhì)后真菌的種類和豐度有明顯的增多。

2.2.2OTU聚類分析

將多條序列按其序列間的距離對(duì)它們進(jìn)行聚類后，根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元（OTU），通過OTU數(shù)目變化與uclust參數(shù)similarity值之間的數(shù)據(jù)對(duì)比，從中選擇最佳的similarity值為0.97，操作分類單元被認(rèn)為屬于屬。采用OTU VENN軟件分析樣本中PNK1有861個(gè)OTUs，F(xiàn)NK1有229個(gè)OTUs，兩者同時(shí)有228個(gè)OTUs（圖2）。PNK1增加了633個(gè)OTUs，表明它們可能是在釀酒過程中，由于操作不當(dāng)而新進(jìn)的菌種。這些真菌群落可能與窖泥變質(zhì)有關(guān)。

圖2　FNK1和PNK1 OTUS對(duì)比

2.3真菌群落結(jié)構(gòu)分析

對(duì)處理后序列進(jìn)行物種分類，采用RDP classifier軟件對(duì)每條序列在genus水平上計(jì)算其分配到此rank中的概率值，一般概率值大于0.8，即RDP分類域值［19-21］。根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果，可以得知樣品在屬分類水平的數(shù)據(jù)（表2、表3）。

結(jié)合表2、表3所示，窖泥變質(zhì)前后真菌群落結(jié)構(gòu)、豐度差異較大，選擇優(yōu)勢(shì)菌群進(jìn)行比較。窖泥變質(zhì)前絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬為小囊菌屬（Microascus），窖泥變質(zhì)后青霉菌屬（Penicillium）成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬。Thomton［22］在前人研究的基礎(chǔ)上，得出結(jié)論：在未經(jīng)擾動(dòng)的土地上，小部分優(yōu)勢(shì)菌種是特定有利環(huán)境的結(jié)果，這個(gè)結(jié)論被普遍接受。每個(gè)研究的小生境內(nèi)環(huán)境是相似的，其中窖泥真菌區(qū)系也相似，大量事實(shí)證實(shí)了窖泥真菌組成與生境類型有明顯的對(duì)應(yīng)性。影響生境選擇的可能因子很復(fù)雜，Widden［23］通過多變量分析的方法（多元回歸，典型相關(guān)分析，因子分析，分類排序等），證實(shí)了真菌種類的出現(xiàn)與生物及非生物環(huán)境之間有復(fù)雜的多重關(guān)系。非生物因子如Ca2+、溫度、濕度、K+、窖泥的形成過程等，可能是少數(shù)或幾個(gè)主要真菌種出現(xiàn)的首要調(diào)節(jié)者。但有更多的證據(jù)證實(shí)生物因子有可能是主要的調(diào)節(jié)者。Gochenaur［24］研究后得出結(jié)論：種間競(jìng)爭(zhēng)在調(diào)節(jié)種的豐富性方面是最主要的因子。窖泥中的真菌群落在經(jīng)歷一個(gè)長(zhǎng)期馴化、變化過程中，由于窖泥化學(xué)特性和窖泥生物的改變，再加上外來生物因素的影響，窖泥中的真菌群落種類組成發(fā)生改變，新的真菌群落更能適應(yīng)新的環(huán)境。窖泥變質(zhì)后青霉菌屬為主要調(diào)節(jié)者，通過種間相互競(jìng)爭(zhēng)得到了如表3所示的真菌群落結(jié)構(gòu)。

表2　FNK1真菌種類及豐度值

表3　PNK1真菌種類及豐度值

2.4窖泥變質(zhì)前后真菌分類樹

使用MEGAN軟件，通過交互式搜集NCBI中的分類數(shù)據(jù)庫(kù)信息，以樹狀圖形式在門水平表現(xiàn)窖泥變質(zhì)前后真菌群落結(jié)構(gòu)（圖3、圖4）。

圖3　FNK1門水平MEGANF豐度圖

如圖3所示，窖泥變質(zhì)前真菌群落結(jié)構(gòu)只有子囊菌門（99.99%）和擔(dān)子菌門（0.01%），來源于原始窖泥和人工馴化。窖泥中的真菌除了能起到釀酒產(chǎn)香的作用外，在微生態(tài)系統(tǒng)中也發(fā)揮著多種多樣的功能，如降解纖維素、半纖維素、木質(zhì)素、膠質(zhì)、還原氮、溶解磷、螯合金屬離子、產(chǎn)生青霉素等。然而在Dobranic和Zak［25］1999年提出FungiLog理論框架和方法學(xué)之前，土壤真菌的功能多樣性研究?jī)H僅停留在個(gè)別真菌種類和類群功能的研究方面，缺乏系統(tǒng)性和理論性。由于存在分離和檢測(cè)技術(shù)的限制，迄今為止僅有少數(shù)窖泥真菌被報(bào)道，窖泥真菌群落之間的理化特性也就不得而知。根據(jù)Gochenaur［24］所提出的理論，土壤中優(yōu)勢(shì)菌屬是微生態(tài)的主要調(diào)節(jié)者，因此在窖泥變質(zhì)前建立了以子囊菌門中的小囊菌屬為主要調(diào)節(jié)者的真菌群落結(jié)構(gòu)。如果小囊菌屬發(fā)生變化，則整個(gè)真菌群落結(jié)構(gòu)將發(fā)生變化。

圖4　PNK1門水平MEGANF豐度圖

由圖4所示，窖泥變質(zhì)后微生態(tài)發(fā)生了很大變化。共鑒定出10個(gè)真菌門、3個(gè)藻類門和其他后鞭毛生物界的6個(gè)門。其中子囊菌門（89.36%）和擔(dān)子菌門（9.62%）為主要優(yōu)勢(shì)真菌。窖泥真菌群落組成與生長(zhǎng)環(huán)境有明顯的對(duì)應(yīng)性，隨著釀造周期的增加，窖泥中真菌的生長(zhǎng)環(huán)境（如溫度、濕度、營(yíng)養(yǎng)等）發(fā)生變化，從而對(duì)應(yīng)的真菌群落也將發(fā)生變化。20世紀(jì)60年代以前，少有關(guān)于土壤真菌與環(huán)境演替關(guān)系的報(bào)道，較早的如Mallik［26］研究了俄克拉荷馬代表森林植被不同演替階段區(qū)域的土壤真菌。隨著演替的進(jìn)行，窖泥濕度、有機(jī)碳、Ca2+、K+等因子都逐漸升高，真菌的種類也增多。

3　討論

隨著真菌研究的不斷深入，傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)和顯微鏡觀察方法已經(jīng)不能適應(yīng)研究的需要，Hawksworth［27］研究表明，自然界中約有150萬真菌種類，但僅有0.7%能被分離和培養(yǎng)。隨著分子生態(tài)學(xué)方法的建立和不斷改進(jìn)，采用Lllumina Miseq測(cè)序平臺(tái)的高通量DNA測(cè)序技術(shù)，對(duì)窖泥變質(zhì)前后真菌群落組成、結(jié)構(gòu)、動(dòng)態(tài)方面有了更深入的了解，為研究窖泥功能真菌及窖泥變質(zhì)的真菌影響提供有利支持。此種方法還能夠分析真菌群落和環(huán)境因子之間的關(guān)系，為將來通過檢測(cè)真菌群落結(jié)構(gòu)推測(cè)環(huán)境因子打下基礎(chǔ)。

通過18S rDNA序列分析表明，窖泥變質(zhì)前后18S rDNA擴(kuò)增序列為9137條和78332條，聚類結(jié)果為229個(gè)OTUs和861個(gè)OTUs，說明真菌的種類和豐度在窖泥變質(zhì)后均有較大的提高。窖泥的物理環(huán)境條件如土壤質(zhì)地、pH值、C/N值、光照、水分、溫度等因素對(duì)真菌群落產(chǎn)生一定的影響，它們或是單個(gè)因子或是多個(gè)因子共同起作用影響著窖泥真菌的群落組成。有研究報(bào)道，土壤真菌數(shù)量隨水分的增加而增加［28］，巨天珍等［29］研究認(rèn)為，影響土壤真菌數(shù)量和多樣性的最主要因素是pH值，其次是土壤中的有機(jī)質(zhì)和水分含量。Paul等［30］主張對(duì)土壤真菌群落變化有關(guān)的是總C/N值，次要的因素是土壤pH值。Sabine［31］認(rèn)為，土壤真菌群落組成更多的是依賴于所在生境的有效性，因?yàn)橛行У纳秤欣诜稚⒌逆咦雍头敝丑w在土地利用方式改變后容易定植。吳敏娜等［32］研究表明，細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)也會(huì)影響真菌的生長(zhǎng)，隨著土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)越來越偏離自然清潔土壤，其抑制真菌作用逐漸降低，表明細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與土壤抑制真菌作用之間的相關(guān)性更為密切。

采用RDP classifier軟件對(duì)18S rDNA序列分析得知，窖泥變質(zhì)前優(yōu)勢(shì)菌屬為小囊菌屬（74.21%），窖泥變質(zhì)后優(yōu)勢(shì)菌屬為青霉屬（76.56%）。青霉屬［33］成員廣泛存在于自然界，有多種多樣的代謝產(chǎn)物，能產(chǎn)生有機(jī)酸、青霉素等，青霉菌也可以使食品、水果、飼料、種子、煙草、藥材發(fā)生酶腐變質(zhì)，腐蝕工業(yè)器材、儀器設(shè)備和原料是工業(yè)和實(shí)驗(yàn)室污染源之一。自然界中已發(fā)現(xiàn)的青霉絕大多數(shù)以無性繁殖的方式繁衍后代，分生孢子萌發(fā)菌絲體，氣生菌絲產(chǎn)生分生孢子梗，然后生出許多分生孢子，分生孢子在適宜環(huán)境中又萌發(fā)為菌絲體，以此循環(huán)反復(fù)，導(dǎo)致變質(zhì)后窖泥中青霉屬成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌屬，青霉屬是否在窖泥變質(zhì)過程中起到直接或間接作用，有待于認(rèn)識(shí)窖泥微生物全貌再作綜合分析。

真菌作為窖泥重要的生物類群，對(duì)白酒釀造及窖泥微生態(tài)都起著重要作用。由于真菌個(gè)體小、數(shù)量多，其多變的類型和強(qiáng)大的適應(yīng)環(huán)境能力為我們了解窖泥真菌全貌帶來障礙。通過高通量DNA測(cè)序技術(shù)可以快速直觀地得到窖泥真菌的多樣性并且獲得大量未知種類，顯示出分子生物技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，然而作為一種實(shí)驗(yàn)手段，此種技術(shù)并不是萬能的，因?yàn)橛绊慞CR的因素限制了其應(yīng)用，因此應(yīng)保留傳統(tǒng)培養(yǎng)方式。研究窖泥真菌群落結(jié)構(gòu)及其生理生化特性、形態(tài)結(jié)構(gòu)，必須將傳統(tǒng)培養(yǎng)方法和現(xiàn)代分子生物學(xué)方法結(jié)合起來。

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Differences of Fungal Communities in Nongxiang Baijiu Pit Mud before and after the Deterioration

YU Chuntao1，LIU Chao1，CHEN Ruiling1，ZHU Fenglin1and LIU Zhenjiang2
（1.Cangzhou Medical College，Cangzhou，Hebei 061001；2.Nikeng Distillery Co.Ltd.，Shijiazhuang，Hebei 054000，China）

Pit mud deterioration is a major problem for distilleries in North China.In this study，total DNA of fungi in pit mud was extracted directly and high throughput sequencing method was used to amplify 18S rDNA and to construct gene library to analyze the composition of fungal communities in pit mud before and after the deterioration.The results suggested that，there were 9737 sequences belonging to 2 phylums before the deterioration，and the dominant fungi included Microascus（74.21%），Penicillium（10.03%），Pseudogymnoascus（9.99%），etc.There were 78322 sequences belonging to 19 phylums after the deterioration，and the dominant fungi included Penicillium（76.56%），Pseudogymnoascus（6.73%），Inonotus（5.96%），Inocybe（2.93%），etc.There were significant differences in fungi varieties and abundance before and after the deterioration.This study provided a theoretical base for the comprehensive understanding of pit mud deterioration.

pit mud；deterioration；fungal community；analysis of the difference；high throughput sequencing

TS262.3；TS261.4；TS261.1

A

1001-9286（2016）10-0040-05

10.13746/j.njkj.2016159

2016-05-09；

2016-06-16

于春濤（1979-），男，河北省滄州市人，碩士研究生，主要從事微生物發(fā)酵研究。

優(yōu)先數(shù)字出版時(shí)間：2016-07-11；地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.1051.TS.20160711.1103.005.html。