基于抗氧化活性的豆豉多糖提取工藝優(yōu)化

吳蘭芳，蔣愛民，鄭開顏，林敏浩，黃洪媛

（1.河北中醫(yī)學院藥學院，河北石家莊050200；2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642；3.貴州輕工職業(yè)技術學院輕工化工系，貴州貴陽550025）

基于抗氧化活性的豆豉多糖提取工藝優(yōu)化

吳蘭芳1，2，蔣愛民2，鄭開顏1，林敏浩2，黃洪媛3，*

（1.河北中醫(yī)學院藥學院，河北石家莊050200；2.華南農(nóng)業(yè)大學食品學院，廣東廣州510642；3.貴州輕工職業(yè)技術學院輕工化工系，貴州貴陽550025）

以DPPH自由基清除能力為評價指標，對米曲霉型豆豉多糖的提取工藝進行優(yōu)化，并利用苯酚硫酸法對其糖含量進行測定。利用單因素試驗和正交試驗對米曲霉型豆豉多糖提取工藝進行優(yōu)化，確定其最優(yōu)提取條件為：提取溫度90℃，提取時間1 h，料液比1∶10（g/mL），乙醇沉淀濃度70%。在此條件下，豆豉多糖的抗氧化能力最強，對DPPH自由基的清除率達64.21%，糖含量為88.93%。

米曲霉型豆豉；多糖；提取工藝；抗氧化

豆豉是我國傳統(tǒng)的大豆的發(fā)酵制品，以黑褐色或黃褐色、鮮美可口、咸淡適中、回甜化渣、具豆豉特有豉香氣者為佳。豆豉含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪和碳水化合物，還含有多種礦物質(zhì)和維生素等營養(yǎng)物質(zhì)［1-2］。豆豉按制曲發(fā)酵時所參與的主要微生物種類的不同，豆豉可分為米曲霉型、毛霉型、根霉型、細菌型。本文所采用的原料為陽江豆豉，其為米曲霉型豆豉的典型代表［3］。

多糖又稱多聚糖，由存在于自然界的醛糖或酮糖通過糖苷鍵連接而成的天然高分子多聚物，是一切有生命的有機體必不可少的成分［4］。許多研究證明許多天然食品中的多糖是具有清除自由基和代謝調(diào)節(jié)作用的天然物質(zhì)［5］。目前對于米曲霉型豆豉的研究集中于菌株的分離與鑒定、發(fā)酵工藝的研究、活性成分的提取等方面［6-8］，而對于以抗氧化為指標，優(yōu)化米曲霉型豆豉多糖的提取工藝鮮見報道，因此本試驗擬以米曲霉型豆豉為原料，以DPPH自由基的清除率為評價指標，在單因素試驗的基礎上，利用正交試驗篩選陽江豆豉多糖的最優(yōu)提取工藝，以期為豆豉作為保健品的開發(fā)提供理論基礎及科學參考。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豆豉：廣東陽江市陽帆豆豉廠；硫酸（分析純）、鹽酸（分析純）、氫氧化鈉（分析純）、無水乙醇（分析純）：廣州化學試劑廠；維生素C（分析純）：國藥集團化學試劑有限公司；二苯代苦味基肼自由基（DPPH）（分析純）：百靈威公司；其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2儀器與設備

PL203型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3精密pH計：上海精密科學儀器有限公司；UV-1800紫外可見分光光度計：島津儀器有限公司；冷凍高速離心機5804R：德國艾本德儀器公司。

1.3方法

1.3.1豆豉多糖的提?。?］

豆豉粉碎過60目篩于60℃烘箱烘干，干粉用80%乙醇溶液回流提取2次，減壓濃縮回收乙醇后，殘渣風干得脫脂豆豉干粉，保存?zhèn)溆谩?/p>

取經(jīng)預處理的脫脂豆豉干粉，加入蒸餾水后水浴加熱提取。提取后于4 000 r/min離心15 min，收集上清液，殘渣按上述方法重復提取2次。合并上清液減壓濃縮至一定體積，向濃縮液中加入一定濃度的乙醇，沉淀完全后過濾，真空干燥后得到粗多糖。

1.3.2抗氧化活性評價［10-11］

選取DPPH自由基清除能力為評價指標，對豆豉多糖進行抗氧化活性評價。取0.1 g豆豉多糖，加入10 mL蒸餾水，取3 mL溶液，向樣液中加入3 mL 0.16 mmol/L DPPH溶液，于25℃水浴中放置15 min后，在517 nm測得試樣吸光度（Ai），取3 mL蒸餾水代替樣品測得空白吸光度（A0），向3 mL樣品中加入3 mL蒸餾水測得樣品本底吸光度（Aj），其中（Ai）每個樣品質(zhì)量濃度做3個平行，取平均值。以維生素C作陽性對照，按下列公式計算清除率。清除率/%=［A0-（Ai-Aj）］/ A0×100。

1.3.3基于抗氧化活性的米曲霉型豆豉多糖的單因素試驗［12］

以對DPPH自由基清除率為指標，分別考察多糖沉淀所用的乙醇濃度、提取溫度、提取時間、料液比4個因素對米曲霉型豆豉多糖抗氧化能力影響，為正交試驗提供有意義的因素及水平。

1.3.3.1乙醇濃度對米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸餾水，在70℃的恒溫水浴中提取2 h。棄去濾渣，收集上清液，上清液分別以60%、70%、80%、90%的乙醇沉淀，考察不同濃度乙醇沉淀所得的豆豉多糖對DPPH自由基清除率的影響。

1.3.3.2提取溫度對米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸餾水，分別在60、70、80、90、100℃的恒溫水浴中提取2 h。過濾，棄去濾渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥。

1.3.3.3提取時間對米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，加入100 mL蒸餾水，在80℃的恒溫水浴中分別提取1、2、3、4 h。過濾，棄去濾渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥。

1.3.3.4料液比對米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

稱取10 g豆豉干粉，分別加入50、100、150、200 mL蒸餾水，在80℃的恒溫水浴中提取2 h。過濾，棄去濾渣，收集上清液，上清液用70%乙醇沉淀，沉淀真空干燥，以考察不同料液比對豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。

1.3.4正交試驗

在單因素試驗的基礎上，選擇提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）為三因素，以DPPH自由基清除率為評價指標，采用L4（93）進行正交試驗，因素水平表如表1所示。

表1　豆豉多糖提取正交試驗因素水平表Table 1Orthogonal experiment factors and levels of douchi polysaccharide extraction

1.3.5多糖含量的測定方法［13］

采用硫酸-苯酚法測定。

1.3.6數(shù)據(jù)處理

采用spss16.0、Origin8.0、正交設計助手V3.1等軟件對試驗結果進行處理分析。

2　結果與分析

2.1豆豉多糖抗氧化性測定的單因素試驗

2.1.1乙醇濃度對米曲霉型豆豉多糖DPPH自由基清除率的影響

設定料液比為1∶10（g/mL），提取溫度為70℃，反應時間為2 h，考察沉淀多糖所用的乙醇濃度（60%、70%、80%、90%）對豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結果見圖1。

圖1　乙醇濃度對DPPH自由基清除率的影響Fig.1Effect of alcohol concentration in precipitation on DPPH radical scavenging activity

由圖1可見，利用70%的乙醇沉淀得到的多糖對DPPH自由基的清除率最好，且通過方差分析表明，用60%的乙醇沉淀與70%、80%之間存在顯著差異，70%和80%的乙醇沉淀不存在顯著差異，因此在后續(xù)的試驗中采用70%的乙醇進行沉淀。

2.1.2提取溫度對米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

設定料液比為1∶10（g/mL），乙醇濃度為70%，反應時間為2 h，考察提取溫度（60、70、80、90、100℃）對豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結果見圖2。

圖2　提取溫度對DPPH自由基清除率的影響Fig.2Effect of extraction temperature on DPPH radical scavenging activity

由圖2可見，80℃提取的豆豉多糖對DPPH自由基的清除作用與其它溫度提取均存在顯著差異，且80℃對DPPH自由基的清除效果最好。因此，在后續(xù)試驗中選用80℃作為正交設計的中心點。

2.1.3提取時間對豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

設定料液比為1∶10（g/mL），酒精濃度為70%，反應溫度為80℃，研究提取時間（1、2、3、4 h）對豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結果見圖3。

圖3　提取時間對DPPH自由基清除率的影響Fig.3Effect of extraction time on DPPH radical scavenging activity

由圖3可見，2 h提取的豆豉多糖對DPPH自由基的清除效果最好，經(jīng)方差分析表明，各組均存在顯著差異，因此，在后續(xù)實驗中選用2 h為正交設計的中心點。2.1.4料液比對豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響

設定沉淀多糖乙醇濃度70%，反應溫度80℃，提取時間2 h，研究料液比對米曲霉型豆豉多糖的DPPH自由基清除率的影響。結果見圖4。

圖4　料液比對DPPH自由基清除率的影響Fig.4Effect of ratio of material to water on DPPH radical scavenging activity

由圖4可見，料液比為1∶10（g/mL）時，豆豉多糖對DPPH自由基的清除率最高，經(jīng)方差分析表明，各組之間存在顯著差異，因此，在后續(xù)試驗中選用料液比1∶10（g/mL）作為正交設計的中心點。

2.2豆豉多糖抗氧化性測定正交試驗結果

正交試驗設計及結果見表2。

極差的大小反應各個因素對指標影響程度的大小，由表2中的極差值R可以看出，3個因素中對米曲霉型豆豉多糖DPPH自由基清除率影響的大小順序為：提取溫度＞料液比＞提取時間。最優(yōu)的提取條件的水平組合為A3B1C2，即提取溫度90℃，提取時間1 h，料液比1∶10（g/mL）。由極差分析得出的最優(yōu)水平組合并未出現(xiàn)在正交試驗組合中，因此進行了驗證性試驗，結果表明，在最優(yōu)提取條件下，多糖對DPPH自由基的清除率為64.21%，結果大于正交表中的最大值。因此A3B1C2為本試驗的最優(yōu)組合。

表2　正交試驗設計及結果Table 2The design and results of orthogonal experiment

2.3米曲霉型豆豉粗多糖中的糖含量測定結果

標準曲線以葡萄糖濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，其回歸方程為Y=17.315X+0.021，R2=0.999 1。最優(yōu)提取工藝所得的粗多糖中糖含量為88.93%（以葡萄糖計）。

3　結論

利用熱水浸提法提取米曲霉型豆豉多糖，以抗氧化活性中清除DPPH自由基能力為評價指標，其最佳工藝條件為：提取溫度90℃，提取時間1 h，料液比1∶10（g/mL），乙醇沉淀濃度為70%，在此條件下得到的米曲霉型豆豉多糖對DPPH自由基的清除率64.21%，粗多糖中的糖含量為88.93%（以葡萄糖計）。

本文的研究可為米曲霉型豆豉多糖的研究提供一定的理論基礎，同時為保健食品的開發(fā)提供科學參考，對于拓寬豆豉的應用范圍也有一定的幫助。但本文僅以抗氧化活性中的DPPH自由基的清除活力為評價指標，而其它的抗氧化活性指標有待于進一步研究。

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Optimization of Extraction Process of Polysaccharide from Douchi Based on Antioxidant Activity

WU Lan-fang1，2，JIANG Ai-min2，ZHENG Kai-yan1，LIN Min-hao2，HUANG Hong-yuan3，*
（1.College of Pharmacology，Hebei University of Chinese Medicine，Shijiazhuang 050200，Hebei，China；2.College of Food Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642，Guangdong，China；3.Department of Light Industry and Chemical Engineering，Guizhou Light Industry Technical College，Guiyang 550025，Guizhou，China）

DPPH radical scavenging activity as a evaluation index，the extraction process of Aspergillus oryzae douchi polysaccharide was optimized.Using single factor test and orthogonal test to determine the extraction method and the optimum extraction conditions which were that extraction temperature 90℃，extraction time 1 h，ratio of raw material to water 1∶10（g/mL），70%ethanol precipitation.Under this condition，the DPPH radical scavenging activity was 64.21%，and the content of polysaccharide was 88.93%.

Aspergillus oryzae douchi；polysaccharide；extraction process；antioxidant activity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.010

河北省教育廳青年基金項目（QN2016187）；河北省大學生創(chuàng)新項目（201514432025）

吳蘭芳（1985—），女（漢），講師，博士研究生，研究方向：藥食兩用資源開發(fā)與利用。

黃洪媛（1986—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：食品營養(yǎng)、微生物。

2015-12-13