戴梓茹，張晨曉，林美芳，李全，利世輝

（欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535011）

響應(yīng)曲面法優(yōu)化中華鱟卵蛋白多肽制備工藝

戴梓茹，張晨曉，林美芳，李全，利世輝

（欽州學(xué)院食品工程學(xué)院，廣西北部灣特色海產(chǎn)品資源開發(fā)與高值化利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西欽州535011）

以中華鱟卵蛋白為試驗(yàn)材料，以蛋白質(zhì)水解度為考核指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)曲面法優(yōu)化中華鱟卵蛋白酶解的工藝條件。結(jié)果表明，中華鱟卵蛋白的最佳酶解條件為：酶解時(shí)間7 h，酶解溫度45℃，酶解pH 11.0，加酶量30 000U/g，液料比70∶1（mL/g），在此條件下中華鱟卵蛋白水解度可達(dá)32.60%。

中華鱟卵；酶解；多肽；響應(yīng)曲面

人體不能直接吸收外源蛋白質(zhì)，必須先將蛋白質(zhì)消化成小分子的多肽或氨基酸后吸收。而近年研究表明，機(jī)體對蛋白質(zhì)的最佳吸收形式是小分子多肽，同時(shí)，多肽還具有抑菌、抗氧化、降血壓血脂等多種生理活性功能［1］。因此，將蛋白質(zhì)水解為小分子多肽，是提高蛋白質(zhì)資源利用率和功用的重要途徑。中華鱟是廣泛分布于我國北部灣沿海海域具有“活化石”之稱的節(jié)肢動(dòng)物，具有重要的藥用和食用價(jià)值，民間常有將鱟卵用于治療眼疾、肝病的偏方［2-4］。研究表明，鱟卵含有16種氨基酸，7種必需氨基酸［5］，是營養(yǎng)豐富的食用蛋白資源。隨著鱟養(yǎng)殖技術(shù)的日漸成熟，可供食用的鱟將會批量增加，而鱟卵蛋白可以做為優(yōu)質(zhì)蛋白資源的重要來源。酶法制備蛋白質(zhì)多肽具有減少化學(xué)試劑污染、縮短水解時(shí)間、減少機(jī)械設(shè)備成本、提高功能多肽含量等優(yōu)點(diǎn)，是目前食品相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)［6-9］。本研究以中華鱟卵蛋白為試驗(yàn)材料，采用響應(yīng)曲面法設(shè)計(jì)試驗(yàn)，以蛋白質(zhì)水解度為響應(yīng)值，考察鱟卵蛋白酶解pH值、加酶量和液料比這3個(gè)因素對中華鱟卵蛋白質(zhì)酶解工藝的影響，通過建立回歸模型，預(yù)測優(yōu)化酶解工藝條件，并加以驗(yàn)證，最終獲得最佳酶解工藝，為中華鱟卵蛋白多肽液的開發(fā)利用提供了科學(xué)的理論參考。

1　材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1主要材料

中華鱟卵：從欽州三娘灣海域采集成年中華鱟，并通過人工催產(chǎn)得到鱟卵。

1.1.2主要試劑

胰蛋白酶（5 000 U/g）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；中性蛋白酶（100000U/g）、木瓜蛋白酶（60000U/g）：南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；堿性蛋白酶（200 000 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.3主要儀器

BCD-539WT冰箱：海爾集團(tuán)；JT3101N電子天平：上海精天電子儀器設(shè)備有限公司；PHS-25PH計(jì)：上海圣科儀器設(shè)備有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市科析儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1鱟卵蛋白提取

中華鱟卵真空冷凍干燥→粉碎（過40目篩）脫脂→提?。?.00%NaOH溶液、液料比為40∶1（mL/g）、恒溫40℃條件和提取時(shí)間110 min］→離心分離（8 000 r/min，10 min）→上層清液加酸至pH值為5.0沉淀→離心分離（8 000 r/min，10 min）→沉淀→乙醇洗滌→真空冷凍干燥→粉碎過篩→鱟卵蛋白粉。

1.2.2酶解工藝

工藝流程：中國鱟卵蛋白粉→恒溫振蕩酶解→沸水浴滅酶10 min→酶解液→調(diào)節(jié)至初始pH→pH-Stat法測定蛋白水解度記錄消耗的氫氧化鈉的體積（mL）。

1.2.3蛋白水解度（DH）的測定［10］

磷酸緩沖溶液調(diào)節(jié)初始反應(yīng)體系的pH值，待反應(yīng)結(jié)束后再用0.5 mol/L的氫氧化鈉將反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)至初始pH值，記錄反應(yīng)消耗的氫氧化鈉的體積（mL），按下式計(jì)算蛋白水解度：

式中：V為消耗氫氧化鈉的體積，mL；N為氫氧化鈉的濃度，mol/L；α為鱟卵蛋白的平均解離度，α=；m為樣品中鱟卵蛋白的質(zhì)量，g；htot為每克原料蛋白質(zhì)中肽鍵的毫摩爾數(shù)，mmol/g。其值取決于底物蛋白的氨基酸組成［5］。本次試驗(yàn)經(jīng)計(jì)算鱟卵蛋白的htot取值為7.5 mmol/g。

1.2.4蛋白酶酶種類的篩選

準(zhǔn)確稱取0.10 g鱟卵蛋白分別在各蛋白酶最適宜的酶解條件下水解，做平行試驗(yàn)，反應(yīng)結(jié)束用氫氧化鈉將反應(yīng)體系pH值調(diào)節(jié)至初始pH值，記錄消耗的氫氧化鈉的量，根據(jù)水解度計(jì)算公式計(jì)算蛋白水解度DH（%）的大小。

1.2.5單因素試驗(yàn)

蛋白質(zhì)水解受到較多因素的影響，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，選取了影響較大的5個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對鱟卵中蛋白質(zhì)的水解度的影響。

1.2.6酶解工藝優(yōu)化試驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 8.05b軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以蛋白水解度為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)需要，選取酶解pH值、加酶量和液料比三因素進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)和試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1　響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factor level table of response surface methodology

2　結(jié)果與分析

2.1各種蛋白酶的篩選

同一種底物蛋白被不同蛋白酶水解將會得到不同氨基酸組成和不同分子量的多肽［11］。本試驗(yàn)選用4種常用蛋白酶對中華鱟卵蛋白進(jìn)行酶解，以篩選出制備多肽的最適蛋白酶，結(jié)果見表2。

表2　各種酶設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果Table 2Design of experiment and results

從表2可知，木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對中國鱟卵蛋白水解度的影響最顯著的是胰蛋白酶，最大水解度17.90%。其余的均低于15%，這可能與不同蛋白酶的不同酶切位點(diǎn)有關(guān)［12］。因此，確定后面的試驗(yàn)選取胰蛋白酶作為水解中國鱟卵蛋白的最佳蛋白酶。

2.2單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1加酶量對蛋白水解度的影響

根據(jù)酶種類篩選試驗(yàn)結(jié)果，選擇胰蛋白酶酶解中國鱟卵蛋白。準(zhǔn)確稱取0.10 g鱟卵蛋白，分別添加10 000、20 000、30 000、40 000、50 000 U/g的胰蛋白酶，并將其它條件設(shè)定為：pH值為8.0，液料比為50∶1（mL/g），酶解溫度為50℃，酶解時(shí)間4 h。酶解后測定蛋白水解度（DH），選取水解度最大的加酶量進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)，結(jié)果見圖1。

結(jié)果顯示，加酶量從10 000 U/g增加到50 000 U/g，蛋白水解度先上升到峰值后下降。當(dāng)加酶量大于30 000 U/g時(shí)，水解度最大，為15.33%。因此，初步確定最適加酶量為30 000 U/g。

圖1　加酶量對蛋白水解度的影響Fig.1Effect of enzyme addition amount on degree of hydrolysis

2.2.2酶解pH值對蛋白水解度的影響

準(zhǔn)確稱取0.10 g鱟卵蛋白，選擇pH值分別為8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，其它水解條件為：液料比50∶1（mL/g），加酶量30 000 U/g，酶解溫度50℃，酶解時(shí)為4 h，以蛋白水解度（DH）為指標(biāo)，確定胰蛋白酶酶解中國鱟卵蛋白的最佳酶解pH值，結(jié)果見圖2。

從圖2可知，pH值從8.0升至12.0，鱟卵蛋白的水解度先增大后下降。當(dāng)pH值為11.0時(shí)，水解度最大，為21.60%。因此，確定最適酶解pH值為11.0。

2.2.3液料比對蛋白水解度的影響

準(zhǔn)確稱取0.10 g鱟卵蛋白，液料比分別為50∶1、60∶1、70∶1、80∶1、90∶1（mL/g），其它水解條件設(shè)定為：酶解pH值為11.0，加酶量30 000 U/g，酶解溫度50℃，酶解時(shí)間4 h，以蛋白水解度（DH）為指標(biāo)，確定胰蛋白酶酶解中國鱟卵蛋白的最佳液料比，結(jié)果見圖3。

圖3　液料比對蛋白水解度的影響Fig.3Effect of liquid-solid ratio on degree of hydrolysis

液料比從50∶1（mL/g）至90∶1（mL/g），蛋白水解度先升高后下降，峰值為26.00%，此時(shí)液料比為70∶ 1（mL/g），因此，選擇70∶1（mL/g）為最適液料比。

2.2.4酶解時(shí)間對蛋白水解度的影響

準(zhǔn)確稱取0.10 g鱟卵蛋白，選擇酶解時(shí)間分別為4、5、6、7、8 h，其它水解條件為：酶解pH值為11.0，液料比70∶1（mL/g），加酶量30 000 U/g，酶解溫度50℃，以蛋白水解度（DH）為指標(biāo)，確定胰蛋白酶酶解中國鱟卵蛋白的最佳酶解時(shí)間，結(jié)果見圖4。

圖4　酶解時(shí)間對蛋白水解度的影響Fig.4Effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis

試驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著水解時(shí)間從4 h延長到8 h，蛋白水解度從24.8%升高至30.14%后，下降至28.00%。因此，選擇蛋白水解度峰值對應(yīng)的7 h為最適酶解時(shí)間。

2.2.5酶解溫度對蛋白水解度的影響

準(zhǔn)確稱取0.10g鱟卵蛋白，選擇酶解溫度分別為40、45、50、55、60℃，其它水解條件為：加酶量30 000 U/g，pH值為11.0，料液比為70∶1（mL/g），酶解時(shí)間為7 h，以蛋白水解度（DH）為指標(biāo)，確定胰蛋白酶酶解中國鱟卵蛋白的最佳酶解溫度，結(jié)果見圖5。

圖5　酶解溫度對蛋白水解度的影響Fig.5Effect of enzymolysis temperature on degree of hydrolysis

酶解溫度從40℃上升到60℃的酶解過程中，蛋白水解度呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí)，蛋白水解度達(dá)到峰值，為31.07%。因此，確定最佳酶解溫度為45℃。

2.3酶解工藝的優(yōu)化結(jié)果與分析

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以蛋白水解度為考核指標(biāo)，選擇對蛋白水解度影響較大的3個(gè)可控工藝參數(shù)做為響應(yīng)面試驗(yàn)的因子，每個(gè)因子取3個(gè)水平值，設(shè)計(jì)17組試驗(yàn)（表1），每組做3次平行，取均值。具體設(shè)計(jì)組合及試驗(yàn)值和軟件預(yù)測值如表3所示。

表3　酶解條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3Response surface experiment and results of response surface methodology

2.3.1蛋白水解度的方差分析

利用Design Expert軟件，通過表3中試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得中華鱟卵蛋白酶解條件對編碼自變量酶解pH值、加酶量和液料比的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=32.16-2.56A-0.43B+0.48C-1.80AB+1.36AC-0.87BC-2.91A2-8.18B2-3.70C2。方差分析見表4。

表4　回歸模型方差分析Table 4Analysis of variances for the regression model

通過回歸方程表達(dá)各因素與響應(yīng)值之間的關(guān)系，復(fù)相關(guān)系數(shù)R2=0.997 8，這表明中華鱟卵中蛋白水解度的模型擬合程度良好，即這種非線性方程關(guān)系是可靠的，因此可以用此模型預(yù)測酶解法水解中華鱟卵蛋白的結(jié)果，此模型能夠描述酶解pH值、加酶量、液料比對鱟卵蛋白水解度的變化規(guī)律，能較好優(yōu)化試驗(yàn)方案。模型的P值小于0.01，表明該模型非常顯著，不同條件下蛋白水解度的差異非常顯著，方法可行；失擬項(xiàng)P=0.747 5在α=0.05水平上不顯著，表明模型與實(shí)際情況的擬合可以很好的描述各酶解條件對蛋白水解度的影響。由P值大小可知，在所選各因素水平范圍內(nèi)，對結(jié)果的影響大小為：酶解pH（A）＞加酶量（B）＞液料比（C）；一次項(xiàng)A、B和C都非常顯著（P＜0.01）；二次項(xiàng)A2B2和C2都非常顯著（P＜0.01）；交互項(xiàng)AB、AC和BC都非常顯著（P＜0.01）。以上分析表明A、B、C、A2、B2、C2、AB、AC和BC這些因素對蛋白水解度的影響顯著。即酶解pH、加酶量、液料比、酶解pH值的平方、加酶量的平方、液料比的平方、交互作用AB、AC和BC效應(yīng)對中華鱟卵蛋白水解度的影響達(dá)到顯著水平。

2.4響應(yīng)曲面優(yōu)化

建立的回歸模型中的任一因素以零為基礎(chǔ)，得出其他3個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖見圖6～圖8。

圖6　酶解pH值和加酶量交互影響蛋白水解度的曲面圖及等高線圖Fig.6Surface plot and contour plot of the combined effects of pH and enzyme addition amount

圖7　酶解pH值與液料比交互影響蛋白水解度的曲面圖及等高線圖Fig.7Surface plot and contour plot of the combined effects of pH and liquid-solid ratio

圖8　加酶量與液料比交互影響蛋白水解度的曲面圖及等高線圖Fig.8Surface plot and contour plot of the combined effects of enzyme addition amount and liquid-solid ratio

圖6顯示了酶解pH值與加酶量交互作用對蛋白水解度的影響。由圖可知，曲面模型體現(xiàn)了隨著變量的變化可以得到的最佳值。蛋白水解度隨著酶解pH值和加酶量的增加而增加，并達(dá)到最大值。酶解pH值與加酶量在取值范圍內(nèi)變化，會對響應(yīng)值蛋白水解度產(chǎn)生顯著的影響。等高線圖形橢圓形明顯，酶解pH值和加酶量這兩個(gè)因素的交互作用顯著。

圖7顯示了酶解pH值與液料比交互作用對蛋白水解度的影響。由圖可知，在酶解pH值在-1～0，液料比在-1～-0.5的范圍內(nèi)，蛋白水解度不斷增加，而之后提高酶解pH值，加大液料比，卻使蛋白水解度有下降的趨勢。由等高線圖形可以判斷出，酶解pH值與液料比這兩個(gè)因素的交互作用影響顯著。

圖8顯示了加酶量與液料比交互作用對蛋白水解度的影響。在試驗(yàn)范圍內(nèi)，兩者取值增加，蛋白水解度亦隨之增加，達(dá)到峰值后，加酶量和液料比取值進(jìn)一步增大，蛋白水解度下降。由等高線圖形可以判斷出，加酶量與液料比這兩個(gè)因素的交互作用顯著。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn)分析

通過軟件分析，得到中華鱟卵中蛋白水解度的最佳工藝條件為酶解pH11.0、加酶量為30 000 U/g、液料比為70∶1（mL/g），該條件下中華鱟卵蛋白水解度預(yù)測值為32.16%。采取上述最優(yōu)條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，平行3次，取平均值，實(shí)測得率為32.60%。該值與理論最大值接近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化中華鱟卵中蛋白水解度工藝可行。

3　結(jié)論

酶法水解蛋白過程中，水解液的量值影響酶分子對蛋白底物的效用，溫度影響反應(yīng)體系的速度和酶的穩(wěn)定性，酶解體系的組成和反應(yīng)速率也還會受酶解時(shí)間等因素的影響［11-13］。以中華鱟卵蛋白為原料，蛋白水解度為評價(jià)指標(biāo)，采用酶解法對中華鱟卵中蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解的工藝研究。應(yīng)用Design-Expert.8.05b軟件，以蛋白水解度為響應(yīng)值，在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的需要，對酶解pH值、加酶量和液料比3個(gè)因素，采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化中華鱟卵蛋白水解度工藝，得二次多元回歸方程模型：

試驗(yàn)結(jié)果表明，最優(yōu)提取工藝條件為：酶解時(shí)間為7 h，酶解溫度為45℃，酶解pH值為11.0、加酶量為30 000 U/g、液料比為70∶1（mL/g）。該條件下中華鱟卵蛋白水解度預(yù)測值為32.16%。驗(yàn)證試驗(yàn)實(shí)測得率為32.60%。該值與理論最大值接近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化中華鱟卵中蛋白水解度工藝可行。利用此條件酶解鱟卵中蛋白，可得到較高含量的多肽產(chǎn)品，為鱟卵蛋白酶解液資源的開發(fā)提供了基礎(chǔ)。

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Optimization Process of Preparation of Polypeptides from Tachypleus Tridentatus Egg by Response Surface Methodology

DAI Zi-ru，ZHANG Chen-xiao，LIN Mei-fang，LI Quan，LI Shi-hui
（College of Food Engineering，Qinzhou University，Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory of Development and High-value Utilization of Beibu Gulf Seafood Resources，Qinzhou 535011，Guangxi，China）

Using hydrolysis degree of protein as an index，the hydrolysis effects and conditions of tachypleus tridentatus egg protein were optimization by single factor and response surface methodology.The results showed that the optimal hydrolysis conditions were hydrolysis time of 7 h，hydrolysis temperature of 45℃，hydrolysis pH of 11.0，enzyme addition amount of 30 000 U/g，and hydrolysis liquid-solid ratio of 70∶1（mL/g）.Under the optimal hydrolysis conditions，the degree of hydrolysis reached 32.60%.

tachpleus tridentatus eggs；enzymolysis；polypeptides；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.20.014

廣西高?？蒲许?xiàng)目（LX2014453）

戴梓茹（1982—），女（漢），副教授，博士，從事海洋資源開發(fā)與利用研究。

2015-12-08