李 揚(yáng)，徐 鳳，柴乖強(qiáng)，李春蓮，王中華

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

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基本培養(yǎng)基及激素對(duì)野生一粒小麥幼胚培養(yǎng)的影響

李 揚(yáng)，徐 鳳，柴乖強(qiáng)，李春蓮，王中華

(旱區(qū)作物逆境生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部西北地區(qū)小麥生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

為建立適于野生一粒小麥遺傳轉(zhuǎn)化的高效組培再生體系，以野生型一粒小麥幼胚為外植體，研究了MS、MSE3和N6三種基本培養(yǎng)基和激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)、分化和成苗的影響。結(jié)果表明，愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基以MES3為基本培養(yǎng)基并添加2.0 mg·L-12, 4-D效果最佳，愈傷組織出愈率最高可達(dá)90.5%，胚性愈傷率為80.0%。愈傷組織分化過(guò)程在添加0.25 mg·L-1IAA的MS培養(yǎng)基中加入0.5 mg·L-16-BA分化效果最佳，分化率能達(dá)到50.7%，成苗率為26.5%。

野生一粒小麥；幼胚；愈傷組織；再生

隨著測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展，普通小麥的基因組測(cè)序工作進(jìn)展很快，其A、D基因組的二倍體供體種以及普通小麥中國(guó)春的基因組測(cè)序工作已完成[1-3]。由此，小麥的研究工作即將進(jìn)入基因功能研究快速發(fā)展的新時(shí)期。但由于普通小麥?zhǔn)怯?個(gè)二倍體供體材料經(jīng)過(guò)兩次天然雜交形成的異源六倍體，基因組大小為17 Gb，十分龐大，并且普通小麥的基因通常以多拷貝的形式存在，功能上有很大的冗余，這為研究小麥重要基因的功能造成巨大困難。野生一粒小麥(Triticumboeoticum, AA)是普通小麥A基因組的二倍體供體種，其基因組以及功能基因的冗余度比普通小麥小，可以作為研究小麥基因功能的一個(gè)較為理想的受體。同時(shí)，A基因組中含有包括抗病基因在內(nèi)的大量重要的具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的基因。以抗白粉病基因?yàn)槔?，在已確定的50個(gè)小麥抗白粉病基因位點(diǎn)中11個(gè)都被定位在A染色體上[4]。所以建立野生一粒小麥的高效遺傳轉(zhuǎn)化體系可以為小麥功能基因的研究提供技術(shù)上的保證。

但二倍體小麥相比于四倍體和六倍體小麥來(lái)說(shuō)，組培過(guò)程中愈傷組織形成和分化能力較差。目前對(duì)野生一粒小麥再生體系領(lǐng)域的研究仍較少，且再生率極低。陸維忠等[5]利用一粒小麥幼胚進(jìn)行試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，一粒小麥幼胚出愈率僅為30%～40%，且并未得到再生植株。畢瑞明等[6]以野生一粒小麥成熟胚作為外植體，發(fā)現(xiàn)成熟胚誘導(dǎo)率為68.8%，再生效率僅為0.6%，不能適應(yīng)批量化基因轉(zhuǎn)化的要求。因此，亟須建立高效的野生一粒小麥組培再生體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系。

目前，小麥組培體系的研究已比較成熟。小麥的再生效率主要取決于基因型、外植體類型和培養(yǎng)基成分等。在小麥研究中常用的外植體有幼胚、幼穗、花藥和成熟胚，其中小麥幼胚出愈率和再生率高，被普遍認(rèn)為是最佳的小麥組織培養(yǎng)外植體[7-8]?；谛←溣着哐芯窟M(jìn)展，本研究以野生一粒小麥幼胚為外植體，使用不同基本培養(yǎng)基和不同濃度2, 4-D、6-BA進(jìn)行誘導(dǎo)和分化，以期尋找適合野生一粒小麥幼胚的組織培養(yǎng)條件，提高一粒小麥再生效率，為研究小麥基因功能奠定基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1材 料

二倍體野生型一粒小麥YL1(Triticumboeoticum, AA)由西北農(nóng)林科技大學(xué)小麥遺傳育種新技術(shù)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)提供。2014年秋播種于西北農(nóng)林科技大學(xué)試驗(yàn)田，2015年春取幼穗進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2培養(yǎng)基

本研究中所用培養(yǎng)基見表1，其中，MSE3培養(yǎng)基為：MS大量+MS微量+MS有機(jī)+鹽酸硫胺素(0.04 mg·L-1)+L-天冬酰胺(150 mg·L-1)。所有培養(yǎng)基pH值均調(diào)節(jié)為5.8，然后120 ℃高溫滅菌20 min。

表1　誘導(dǎo)、分化培養(yǎng)基成分Table 1　Media of callus induction and differentiation

1.3組織培養(yǎng)

1.3.1種子消毒

取揚(yáng)花后10～12 d的野生一粒小麥幼穗，插入水中置于4 ℃冰箱低溫處理1～2 d后用鑷子撥出籽粒。用75%(v/v)酒精表面消毒1 min，無(wú)菌水沖洗2～3次，15%(v/v)次氯酸鈉消毒20 min，無(wú)菌水沖洗3～5次。

1.3.2接種及愈傷組織誘導(dǎo)

用鑷子挑取野生一粒小麥種子的幼胚，盾片朝上接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。每皿接種約100個(gè)幼胚，每個(gè)處理3次重復(fù)。25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，每14天繼代1次。誘導(dǎo)培養(yǎng)7 d后統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出的愈傷組織數(shù)，愈傷誘導(dǎo)30 d左右統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織數(shù)。

1.3.3愈傷組織分化

待愈傷誘導(dǎo)30 d左右并統(tǒng)計(jì)胚性愈傷組織數(shù)后，挑取胚性愈傷組織接種到分化培養(yǎng)基上，將培養(yǎng)皿密封后置于人工氣候培養(yǎng)箱，25 ℃光培養(yǎng)，每14天繼代1次。分化培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)長(zhǎng)出綠點(diǎn)的愈傷組織數(shù)，分化40 d統(tǒng)計(jì)成苗數(shù)。

1.3.4再生植株生根及移栽

待綠苗長(zhǎng)至3～5 cm時(shí)移至生根培養(yǎng)基。待植株生根且再生植株長(zhǎng)至6～8 cm時(shí)移栽，煉苗1周，生長(zhǎng)至成熟。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用DPS軟件進(jìn)行處理，方差分析用LSD法檢驗(yàn)。出愈率、胚性愈傷率、分化率和成苗率分別用以下公式進(jìn)行計(jì)算。

愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織的幼胚數(shù)/接種幼胚數(shù)×100%；胚性愈傷組織誘導(dǎo)率=形成胚性愈傷組織的幼胚數(shù)/接種幼胚數(shù)×100%；分化率=分化出綠點(diǎn)的愈傷組織塊數(shù)/接種在分化培養(yǎng)基上的愈傷組織塊數(shù)×100%；成苗率=分化出綠苗的愈傷組織塊數(shù)/接種在分化培養(yǎng)基上的愈傷組織塊數(shù)×100%。

2　結(jié)果與分析

2.1基本培養(yǎng)基對(duì)野生一粒小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

挑取一粒小麥幼胚分別接種到MSE3、N6和MS(每種誘導(dǎo)培養(yǎng)基中分別添加2.5 mg·L-1的2,4-D)三種不同愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上培養(yǎng)，結(jié)果(表2)表明，一粒小麥幼胚在3種基本培養(yǎng)基上的出愈率均達(dá)到85%以上，胚性愈傷率均達(dá)到68%以上，但不同培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率存在顯著差異(P<0.05)。MSE3基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率和胚性愈傷率均最高，N6次之，MS最差。MSE3培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)率與MS培養(yǎng)基之間存在極顯著差異(P<0.01)，胚性愈傷率與MS培養(yǎng)基之間存在顯著差異(P<0.05)。

從愈傷質(zhì)量來(lái)看，MSE3培養(yǎng)基上絕大多數(shù)愈傷組織呈淡黃色致密顆粒狀，而N6和MS培養(yǎng)基上的愈傷組織則為乳白色、水質(zhì)狀。從總體上來(lái)看，MSE3更適合一粒小麥幼胚愈傷組織的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率可達(dá)93.3%，胚性愈傷率為83.0%，且誘導(dǎo)出的愈傷組織質(zhì)量較好。

2.2不同濃度2, 4-D對(duì)野生一粒小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響

在MSE3基本培養(yǎng)基中分別添加0、1.0、2.0和3.0 mg·L-1的2,4-D，研究2,4-D濃度對(duì)一粒小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)率及胚性愈傷率的影響，結(jié)果(表3)表明，在MSE3培養(yǎng)基中不同濃度的2, 4-D對(duì)一粒小麥幼胚愈傷誘導(dǎo)和胚性愈傷組織的形成存在著明顯的影響。

在不添加2, 4-D的對(duì)照處理中，接種幼胚直接形成實(shí)生芽，導(dǎo)致愈傷組織較小，幾乎無(wú)法形成胚性愈傷。而隨著2, 4-D濃度的升高，幼胚的出愈率和胚性愈傷率都有顯著提高。當(dāng)2, 4-D濃度達(dá)到2.0 mg·L-1時(shí)，出愈率和胚性愈傷率都達(dá)到最大值，分別為90.5%和80.0%，且與對(duì)照存在極顯著差異(P<0.01)。當(dāng)2, 4-D濃度繼續(xù)升高，出愈率和胚性愈傷率極顯著地下降。

表2　基本培養(yǎng)基對(duì)野生一粒小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 2　Effects of basal medium on callus induction of immature embryo in Triticum boeoticum

同列數(shù)字后的不同小寫字母表示差異在0.05水平上顯著；同列數(shù)字后的不同大寫字母表示差異在0.01水平上顯著。下同

Values labeled with different lower-case letters in the same column are significantly different among the treatments at 0.05 level and values labeled with different capital letters are significantly different among the treatments at 0.01 level.The same as below

表3　不同濃度2, 4-D對(duì)野生一粒小麥幼胚愈傷組織誘導(dǎo)的影響Table 3　Effects of 2, 4-D concentration on immature embryo callus induction in Triticum boeoticum

2.3不同濃度6-BA對(duì)野生一粒小麥幼胚愈傷組織分化的影響

在MS+IAA(0.25 mg·L-1) 的愈傷組織分化培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的6-BA，研究6-BA濃度對(duì)一粒小麥幼胚愈傷組織分化的影響。結(jié)果(表4)表明，6-BA的濃度對(duì)一粒小麥愈傷組織的分化具有重要影響。最適宜野生一粒小麥幼胚分化的6-BA濃度為0.5 mg·L-1，此時(shí)分化率和成苗率均最高，且與其他處理差異極顯著(P<0.01)。在添加不同濃度6-BA的分化培養(yǎng)基中，分化率范圍為22.4%～50.7%，最高分化率比最低高28.3%，成苗率范圍為7.2%～26.5%，成苗率最高比最低高19.3%。觀察發(fā)現(xiàn)(圖1)，當(dāng)6-BA濃度為0和0.5 mg·L-1時(shí)愈傷組織呈淡黃色、較致密，而當(dāng)6-BA濃度繼續(xù)升高，愈傷組織褐化嚴(yán)重，分化率顯著下降。因此，適宜一粒小麥分化的6-BA濃度為0.5 mg·L-1，分化率最高可達(dá)50.7%，成苗率為26.5%。

表4　不同濃度6-BA對(duì)野生一粒小麥幼胚愈傷分化的影響Table 4　Effects of 6-BA concentration on immature embryo callus differentiation in Triticum boeoticum

A～D分別代表0、0.5、1.0和1.5 mg·L-14個(gè)6-BA濃度

A-D indicated the four 6-BA concentrations of 0, 0.5, 1.0 and 1.5 mg·L-1,respectively

圖1不同濃度6-BA誘導(dǎo)野生一粒小麥的分化情況

Fig.1Differentiation of immature embryo callus in different 6-BA concentrations

3　討 論

已有的研究大多以MS培養(yǎng)基為誘導(dǎo)小麥愈傷組織最常用的基本培養(yǎng)基。伍 玲等[9]利用四川小麥背景的小麥幼胚進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)MSE3培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率比MS培養(yǎng)基平均高18.2%，顯著提高了誘導(dǎo)效率。本研究顯示在所用的3種基本培養(yǎng)基中，MSE3效果最佳，MSE3培養(yǎng)基上愈傷組織誘導(dǎo)率和胚性愈傷率都顯著高于MS和N6兩種培養(yǎng)基，說(shuō)明MSE3培養(yǎng)基同樣適宜于野生一粒小麥幼胚愈傷誘導(dǎo)。

2, 4-D是麥類作物組織培養(yǎng)中最常用的外源激素，它相比于其他生長(zhǎng)素更適合小麥愈傷組織的誘導(dǎo)[10]，且在MS培養(yǎng)基上添加2.0～3.0 mg·L-1的2, 4-D誘導(dǎo)小麥幼胚產(chǎn)生愈傷組織均取得良好效果[11]。本研究以MSE3為基本培養(yǎng)基，在2, 4-D設(shè)置的4個(gè)濃度梯度中，誘導(dǎo)率和胚性愈傷率隨2, 4-D濃度的增加呈單峰曲線變化，當(dāng)濃度為2.0 mg·L-1時(shí)效果最好，與Wu等[12]和陳學(xué)虎等[13]在小麥中的研究結(jié)果一致。說(shuō)明一粒小麥最佳的2, 4-D使用量與小麥相同。在2, 4-D濃度為0 時(shí)誘導(dǎo)效果最差，實(shí)驗(yàn)證明生長(zhǎng)素是一粒小麥愈傷誘導(dǎo)過(guò)程必需的激素，但過(guò)高濃度的2, 4-D也不利于愈傷組織的形成。

本研究在低濃度的生長(zhǎng)素環(huán)境中添加不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA，研究了適合野生一粒小麥幼胚分化的6-BA濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0.5 mg·L-16-BA最適宜野生一粒小麥分化，當(dāng)濃度繼續(xù)增加，愈傷組織褐化嚴(yán)重，該結(jié)果與趙占軍等[14]研究結(jié)論一致。曾有人以薄皮核桃、辣椒和沙棘等為材料，發(fā)現(xiàn)低濃度的6-BA適宜愈傷組織的分化，隨著培養(yǎng)基中6-BA濃度的升高，褐化率顯著升高，分化率下降[15-18]，與本研究結(jié)果相同。在組培過(guò)程中植物組織褐變會(huì)造成分化率下降、組培材料死亡等結(jié)果，嚴(yán)重影響了組織培養(yǎng)效率。張衛(wèi)芳等[15]認(rèn)為在分化培養(yǎng)基中添加生長(zhǎng)素2, 4-D及IAA可以減弱高濃度細(xì)胞分裂素的傷害。在未來(lái)試驗(yàn)中可深入研究，考慮二者復(fù)配對(duì)愈傷分化的影響，從而選擇最佳的生長(zhǎng)素與細(xì)胞分裂素的濃度配比，進(jìn)一步提高一粒小麥的分化效率。

本研究對(duì)野生一粒小麥再生體系的研究較前人有了顯著提升，出愈率、胚性愈傷率、分化率和成苗率都顯著提高，分別可達(dá)到90.5%、80.0%、50.7%和26.5%，證明了野生一粒小麥具有極高的再生潛力，經(jīng)過(guò)不斷深入的研究，一粒小麥可以作為研究小麥功能基因的重要受體材料，為今后的研究奠定基礎(chǔ)。

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The Effects of Basal Medium and Hormone on Immature Embryo Culture inTriticumboeoticum

LI Yang, XU Feng, CHAI Guaiqiang, LI Chunlian, WANG Zhonghua

(State Key Laboratory of Crop Stress Biology for Arid Areas/Key Laboratory of Wheat Biology and Gennetics-breeding in Northwest Area, Ministry of Agriculture/College of Agronomy,Northwest A&F University, Yangling, Shaanxi 712100, China)

In order to optimize regeneration system of immature embryo culture inTriticumboeoticum, the effects of the basal medium and hormone on callus induction, differentiation, and regeneration of immature embryo were studied. The results showed that the callus induction rates were obviously different in various basic media and 2, 4-D concentration. MSE3 with 2.0 mg·L-12, 4-D was suitable for producing immature embryos callus, in which the induction rate can reach to 90.5% and the frequency of embryonic callus induction was 80.0%. The differentiation and seedling rates shown as 50.7% and 26.5%, respectively, were significantly higher under 0.5 mg·L-16-BA than the other three treatments.

Triticumboeoticum; Immature embryo; Callus; Regeneration

時(shí)間：2016-05-10

2016-01-06

2016-03-02

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31271794)

E-mail：liyang910806@163.com

王中華(E-mail：zhonghuawang@nwsuaf.edu.cn)

S512.1；S330

A

1009-1041(2016)05-0583-06

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1359.S.20160510.1623.014.html