張紅蕾，徐志棟，李　瑋,2*，楊瑜濤，杜　潔，韓孟楠，王爍康

(1.河北大學　化學與環(huán)境科學學院，河北　保定　071002；2.河北博倫特藥業(yè)有限公司，河北　石家莊　052263)

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生物轉化L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的定量分析方法

張紅蕾1，徐志棟1，李瑋1,2*，楊瑜濤1，杜潔1，韓孟楠1，王爍康1

(1.河北大學化學與環(huán)境科學學院，河北保定071002；2.河北博倫特藥業(yè)有限公司，河北石家莊052263)

以芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)為柱前衍生劑，四硼酸鈉為緩沖溶液，建立了一種柱前衍生反相高效液相色譜(RP-HPLC)測定微生物轉化L-脯氨酸生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的定量分析方法。優(yōu)化了衍生反應條件，當衍生反應體系中水和乙腈的比例為66∶34，pH值為9.9時衍生效果最佳。采用Agilent Extend C-18柱進行分離，以0.1%三氟乙酸水溶液和乙腈作為流動相，梯度洗脫，檢測波長263 nm。L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸均在0.01～5.00 mg/mL范圍內線性關系良好，相關系數均大于0.999，檢出限為5.00～7.00 ng/L，不同濃度下的平均回收率分別為98.9%～102%和97.9%～100%。該方法重現性好，精密度高，為定量分析微生物發(fā)酵液中的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸提供了有效方法。

柱前衍生；反相高效液相色譜；反式-4-羥基-L-脯氨酸；L-脯氨酸；微生物轉化

反式-4-羥基-L-脯氨酸(trans-4-Hydroxy-L-proline，trans-Hyp)為亞氨基酸，是L-脯氨酸 (L-Pro) 羥基化后的產物，易于衍生，藥理活性多樣[1-2]，可用于新一代培南類抗生素[3]、抗腫瘤藥[4]、抗高血壓藥[5]及新型胃藥[6]等多種新創(chuàng)制藥物的合成。由于具有抗氧化、抗輻射的作用，該物質在化妝品領域也有重要應用[7]。

目前，反式-4-羥基-L-脯氨酸的生產方法主要有生物提取法和生物酶催化轉化法[8-11]。生物提取法主要以動物膠原蛋白為原料，通過強酸水解、亞硝酸氧化和離子交換樹脂純化等過程制備，此方法雖然技術成熟，但原料成本高，提取率低，“三廢”排放量大、污染嚴重。生物酶催化法利用脯氨酸羥化酶的催化特性，以L-脯氨酸為原料通過發(fā)酵轉化得到反式-4-羥基-L-脯氨酸。生物轉化法與生物提取法相比反應條件溫和，能耗低，污染小。本實驗室曾篩選到一株可以生物轉化L-脯氨酸產生反式-4-羥基-L-脯氨酸的重組大腸桿菌工程菌[12]。

在反式-4-羥基-L-脯氨酸的微生物轉化及生產中，對其含量進行分析十分重要。目前，文獻已報道的反式-4-羥基-L-脯氨酸的定量分析方法大部分采用氯胺T法[13]，該方法簡便易操作，但檢測濃度范圍較窄，且只能對羥脯氨酸定量，無法反映脯氨酸的變化情況。高效液相色譜可解決這一問題，本文借鑒衍生試劑柱前衍生氨基酸的高效液相色譜分析方法[14-16]，利用芴甲氧羰酰氯(FMOC-Cl)與樣品進行衍生反應，對衍生體系中水和乙腈的比例進行了優(yōu)化，并對衍生化樣品的穩(wěn)定性進行了考察。結果顯示，該方法前處理簡單、檢測范圍寬、重復性好、衍生產物穩(wěn)定，為應用高效液相色譜分離及定量分析微生物轉化體系中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸提供了有效方法。

1　實驗部分

1.1儀器與材料

Dionex Ultimate 3000型高效液相色譜儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)；Centrifuge 5424R離心機(德國Eppendorf公司)；ZWYR-200D振蕩培養(yǎng)箱(上海智城分析儀器制造有限公司)；Vortex-5旋渦混合器(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；BT125D天平(德國Sartorius公司)。

L-脯氨酸、反式-4-羥基-L-脯氨酸、FMOC-Cl、十水合四硼酸鈉(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；三氟乙酸(上海麥恪林生化科技有限公司)；乙腈、甲醇(安徽時聯特種試劑有限公司)；LB培養(yǎng)基(生工生物工程股份有限公司)。實驗用水均為去離子水。

1.2標準溶液的配制

精密稱取L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸適量，用水配制成濃度為50.00 mg/mL 的標準溶液，分別將上述兩種標準溶液用水梯度稀釋至0.01,0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL。于4 ℃保存，備用。

1.3衍生化方法

1.3.1標準品衍生化 分別吸取“1.2”中不同濃度標準品溶液50 μL于1.5 mL EP管中,向每支EP管內分別加入200 μL 0.125 mol/L四硼酸鈉水溶液、410 μL水、320 μL乙腈、20 μL FMOC-Cl的乙腈溶液(0.38 mol/L)，置于渦旋混勻器振蕩5 s后靜置10 min，過0.45 μm微孔濾膜后進行RP-HPLC檢測。

1.3.2待測樣品衍生化 重組大腸桿菌接種于含3.00 g/LL-脯氨酸的LB培養(yǎng)基中,于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，將大腸桿菌發(fā)酵液以9 000 r/min離心2 min,取50 μL上清液加入1.5 mL離心管內，并加入0.125 mol/L四硼酸鈉水溶液200 μL、水410 μL、乙腈320 μL、0.38 mol/L FMOC-Cl的乙腈溶液20 μL，置于渦旋混勻器振蕩5 s后靜置10 min，過0.45 μm微孔濾膜后進行RP-HPLC分析。

1.4RP-HPLC分析條件

色譜柱為Agilent Extend C-18(4.6 mm ×250 mm，5 μm，Agilent公司)，流動相A為0.1% 三氟乙酸水溶液,B為0.1% 三氟乙酸乙腈溶液，檢測波長263 nm，進樣量5 μL，梯度洗脫條件∶0～5 min，30% B；5～8 min，30%～40% B；8～15 min，40% B；15～20 min，40%～50% B；20～25 min，50% B；25～30 min，50%～90% B；30～38 min，90% B；38～41 min，90%～30% B；41～45 min，30% B。

1.5衍生化樣品的穩(wěn)定性測定

分別配制濃度為0.20，1.00，5.00 mg/mL 的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的標準品，進行衍生化處理后,再分別于4 ℃、室溫(RT)和37 ℃放置20 h后取出進行液相色譜分析，以室溫放置0 h的衍生化樣品為對照。并采用RP-HPLC對4 ℃保存0，12，24，48，72 h的不同濃度衍生化樣品的穩(wěn)定性進行分析。

2　結果與討論

2.1衍生條件優(yōu)化

2.1.1衍生體系緩沖鹽的選擇 對衍生體系3種不同緩沖鹽溶液進行考察。結果顯示，以N-甲基嗎啉鹽酸鹽(0.125 mol/L)作為緩沖鹽時，L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的衍生產物不出峰；以三乙胺(0.125 mol/L)作為緩沖鹽時有目標峰，但相鄰有雜峰干擾；以四硼酸鈉(0.125 mol/L)作為緩沖鹽時，不僅有呈高斯對稱的目標峰，無雜峰干擾，且峰面積最大。綜上所述，選擇最佳緩沖鹽為四硼酸鈉。

2.1.2衍生體系水與乙腈比例的選擇 對衍生體系中水與乙腈的不同比例進行了研究。在不同水和乙腈比例條件下，5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸標準溶液的衍生結果如表1所示，當水和乙腈的比例為98∶2和82∶18時有FMOC-Cl結晶析出，衍生產物的峰高較低；當水和乙腈的比例為50∶50和34∶66時有四硼酸鈉結晶析出，且衍生產物的峰嚴重拖尾；當水和乙腈的比例為66∶34時，衍生產物無色透明，峰形呈高斯對稱，且半峰寬較窄，無明顯拖尾，故選擇該比例下0.38 mol/L衍生劑用量20 μL。在該比例下緩沖體系的pH值為9.9，滿足上述兩種氨基酸易于在堿性環(huán)境中衍生的條件。

表1　不同比例的水和乙腈對衍生效果的影響Table 1　Effect of different proportions for water and acetonitrile on derivatization

2.1.3衍生反應時間的選擇將5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的衍生反應體系分別靜置0，1，5，10，15，20 min后，采用RP-HPLC檢測，發(fā)現隨反應時間的延長，兩種氨基酸的峰面積相應增加，當反應時間為10 min時，峰面積達到最大，反應時間繼續(xù)延長，峰面積反而下降。故選擇最優(yōu)反應時間為10 min。

2.2線性范圍、檢出限與回收率

在“2.1”優(yōu)化條件下，對不同濃度(0.01,0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL)的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸標準溶液衍生后，采用高效液相色譜進行分析，每個濃度重復進樣5次，以峰面積(y)為縱坐標，標準品濃度(x,mg/mL)為橫坐標進行線性回歸，L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的線性方程分別為y=33.79x+0.983 0和y=38.86x+0.939 7，相關系數(r2)分別為0.999 9和0.999 8，線性范圍均為0.01～5.00 mg/mL。當信噪比為4時，L-脯氨酸和L-羥脯氨酸的檢出限分別為7.00 ng/L 和5.00 ng/L。重復測定不同濃度的標準溶液5次，L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的平均回收率分別為98.9%～102%和97.9%～100%。

2.3精密度與重現性

將不同濃度(1.00，2.00，3.00，4.00，5.00 mg/mL)的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸標準溶液按“1.3”方法處理后，進行RP-HPLC分析，每種濃度做5個平行，不同批次做3次重復。兩種待測物3批次5次平行間的相對標準偏差(RSD)均小于3%，表明該方法的重現性良好。

2.4儲存條件對衍生化樣品穩(wěn)定性的影響

分別對5.00 mg/mLL-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸衍生后樣品的儲存溫度進行檢測。經衍生化處理后，2種氨基酸衍生化樣品分別于室溫、37 ℃和4 ℃下放置20 h后進行RP-HPLC檢測。結果顯示，以室溫放置0 h的衍生化樣品為對照(CK)，發(fā)現衍生化樣品于4 ℃儲存時的穩(wěn)定性最佳，與CK相比無顯著差異。而室溫放置20 h和37 ℃放置20 h的樣品的穩(wěn)定性較CK顯著下降(P<0.05)，說明低溫儲存有利于衍生化樣品的穩(wěn)定。

此外，對不同濃度衍生化樣品于4 ℃的儲存時間(0，12，24，48，72 h)進行了檢測。結果顯示，不同濃度的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸在不同保存時間下的峰面積無顯著差異，說明衍生化處理的樣品在4 ℃較為穩(wěn)定，可以短時間(72 h)于4 ℃保存。

2.5微生物發(fā)酵體系中反式-4-羥基-L-脯氨酸的色譜分離及測定

圖1　氨基酸標準品及發(fā)酵液樣品的色譜圖Fig.1　Chromatograms of amino acids standard and fermented liquid samplesa：L-Pro and trans-Hyp standard；b：L-Pro in LB mediun without inoculation of bacterium；c：co-culture with L-Pro biotransforming bacteriumwhich can bioconvert L-Pro into trans-Hyp

應用上述優(yōu)化的柱前衍生方法檢測重組大腸桿菌轉化體系中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的含量。氨基酸標準品及發(fā)酵液樣品的色譜圖見圖1，由圖可見大腸桿菌發(fā)酵液中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸獲得了良好的分離，根據線性回歸方程計算出剩余L-脯氨酸的濃度為0.64 mg/mL，轉化生成反式-4-羥基-L-脯氨酸的濃度為1.77 mg/mL，表明此時大腸桿菌轉化L-脯氨酸為反式-4-羥基-L-脯氨酸的轉化率為 59.0%。

3　結　論

采用本文建立的柱前衍生反相高效液相色譜法可以準確、快速、靈敏地分離并檢測重組大腸桿菌轉化體系中的L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸含量，該方法適用于微生物轉化體系中L-脯氨酸和反式-4-羥基-L-脯氨酸的分離及定量分析。

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Quantitative Analysis of trans-4-Hydroxy-L-proline by Microbial Conversion of L-Proline

ZHANG Hong-lei1,XU Zhi-dong1,LI Wei1，2*,YANG Yu-tao1,DU Jie1,HAN Meng-nan1,WANG Shuo-kang1

(1.College of Chemistry Environmental Science,Hebei University,Baoding071002,China;2.Heibei Brant Pharmaceutical Co.,Ltd.,Shijiazhuang052263,China)

trans-4-Hydroxy-L-proline is one of the valuable chiral building block in the production of many pharmaceuticals.A quantification method oftrans-4-hydroxy-L-proline andL-proline from microbial transformation by using reverse phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) was developed.9-Fluorenylmethyl chloroformate(FMOC-Cl) was used as pre-column derivation agent,and the derivatization was proceeded in sodium tetraborate buffer solution(pH 9.9) containing acetonitrile-water(66∶34).The solution then was separated on an Agilent Extend C-18 column by using 0.1% trifluoroacetic acid and acetonitrile as mobile phase,and detected with UV detector at 263 nm.The linear ranges of two amino acid were in the range of 0.01-5.00 mg/mL,with correlation coefficients greater than 0.999.The limits of detection(LOD) were in the range of 5.00-7.00 ng/L,and the average recoveries oftrans-4-hydroxy-L-proline andL-proline were 98.9%-102% and 97.9%-100%,respectively.This method provides an effective way to quantifyL-proline andtrans-4-hydroxy-L-proline in microorganism fermented liquid system with good reproducibility,and high precision.

pre-column derivation; RP-HPLC;trans-4-hydroxy-L-proline;L-proline; microbial conversion

2016-02-16；

2016-04-05

2014年河北省高等學校高層次人才科學研究項目(GCC 2014013 )；國家國際科技合作專項項目(2013DFB30190)

李瑋，博士，教授，研究方向：化學合成，Tel:0312-5929009，E-mail:13731461388@139.com

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.020

O657.72；O629.71

A

1004-4957(2016)09-1181-04