伍偉俊， 張 瓏， 錢鎖開

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一氧化氮合酶基因轉(zhuǎn)染預(yù)防兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的實(shí)驗(yàn)研究

伍偉俊1， 張 瓏2， 錢鎖開2

目的 通過血管內(nèi)轉(zhuǎn)染內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因的方法，結(jié)合腦動(dòng)脈病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察，探討eNOS基因轉(zhuǎn)染對(duì)蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣的影響及其可能機(jī)制。方法 采用枕大池二次注血法建立兔蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦血管痙攣模型。通過頸動(dòng)脈微泵持續(xù)滴注方法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染。45只兔隨機(jī)分為對(duì)照組、SAH組、AdeNOS組。各組分別于造模7 d后進(jìn)行灌注固定取腦動(dòng)脈行病理學(xué)和超微結(jié)構(gòu)觀察；測(cè)量大腦中動(dòng)脈直徑，同時(shí)免疫組化檢測(cè)eNOS的表達(dá)。結(jié)果 枕大池二次注血法造模后，血液廣泛聚積于蛛網(wǎng)膜下腔，以基底池為主；免疫組化證實(shí)AdeNOS組7 d重組eNOS基因表達(dá)，重組eNOS主要表達(dá)于內(nèi)皮質(zhì)。7 d腦組織HE染色顯示AdeNOS組腦動(dòng)脈平均直徑較SAH組增大；電鏡下SAH組血管痙攣明顯，海馬神經(jīng)元細(xì)胞腫脹，結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞核固縮，線粒體空泡化，AdeNOS組損傷明顯減輕。結(jié)論 采用頸動(dòng)脈微泵持續(xù)滴注方法轉(zhuǎn)染eNOS基因至兔腦動(dòng)脈可緩解蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦血管痙攣，且這一效應(yīng)可能通過增加內(nèi)皮細(xì)胞重組內(nèi)皮型一氧化氮合酶表達(dá)水平而實(shí)現(xiàn)。

蛛網(wǎng)膜下腔出血； 腦血管痙攣； eNOS

蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)是威脅人類健康的重要疾病之一，死亡及致殘率極高。 SAH的主要致死及致殘因素是出血本身、腦血管痙攣(cerebral vasospasm，CVS)，其中腦血管痙攣是蛛網(wǎng)膜下腔出血住院患者的最主要致死及致殘因素[1～3]。顱內(nèi)動(dòng)脈瘤破裂造成SAH后腦血管痙攣的發(fā)生率極高，在血管造影上證實(shí)有血管痙攣的比率可高達(dá)30%～70%，約20%～30%出現(xiàn)明顯神經(jīng)損害的癥狀及體征，甚至危及患者的生命。自從Ecker等[4]于1951年首先報(bào)道了蛛網(wǎng)膜下腔出血后出現(xiàn)腦血管痙攣的現(xiàn)象以來，國內(nèi)外對(duì)SAH誘發(fā)的腦血管痙攣的機(jī)制進(jìn)行了大量的研究。SAH后紅細(xì)胞的溶解和血紅蛋白的釋放及氧化過程與腦血管痙攣的時(shí)間進(jìn)程一致，故目前認(rèn)為血紅蛋白是SAH后遲發(fā)性血管痙攣的主要啟動(dòng)因素。近年來，腦血管病特別是腦動(dòng)脈瘤的治療手段發(fā)展迅速，通過血管內(nèi)介入方法已經(jīng)成為許多發(fā)達(dá)國家的首選治療方法之一。因此，對(duì)于動(dòng)脈瘤破裂導(dǎo)致的蛛網(wǎng)膜下腔出血患者，在血管內(nèi)介入治療動(dòng)脈瘤的同時(shí)，將防治血管痙攣的外源eNOS(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)基因?qū)肽X血管，將可能達(dá)到提高治療的效果。本實(shí)驗(yàn)通過建立二次SAH模型，觀察SAH后腦動(dòng)脈的病理變化及內(nèi)皮型一氧化氮合酶基因?qū)λ挠绊?，進(jìn)一步探討SAH 后CVS發(fā)生的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及分組 新西蘭大白兔45只(購自南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，雌雄不限，體質(zhì)量2.5～3.3 kg。按將動(dòng)物隨機(jī)分為3組：(1)對(duì)照組；(2)SAH組，制作SAH模型。(3)AdeNOS組，攜帶eNOS基因重組腺病毒(eNOS gene recombinant adenovirus，AdeNOS)由第二軍醫(yī)大學(xué)微生物教研室提供，制作SAH模型前用AdeNOS預(yù)處理。

1.2 兔SAH模型的制備 大白兔枕部剃毛，消毒后于枕部中線作一直切口，長2.5 cm，銳性分離直達(dá)寰枕筋膜，充分顯露寰枕部，用18 G套管針與軀體成角約30°穿刺枕大池；退出針芯，此時(shí)可見清亮腦脊液流出，取自體耳中央動(dòng)脈的血2.5 ml(非抗凝)，緩慢注入枕大池內(nèi)；退出套管針，局部壓迫后，縫合切口，取側(cè)臥頭低30°位放置30 min，使血液集積在腦基底池。SAH組和AdeNOS且均在首次注血后48h，由兔耳中央動(dòng)脈取血2.5 ml，按上述方法，再次注入枕大池內(nèi)。對(duì)照組動(dòng)物先后2次枕大池內(nèi)注入等量生理鹽水。

1.3 血管內(nèi)滴注AdeNOS 制作方法：0 d，兔第一次枕大池注血前，頸部正中切開，暴露右側(cè)頸總動(dòng)脈、頸內(nèi)、外動(dòng)脈系統(tǒng)。頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)端結(jié)扎，動(dòng)脈夾夾于頸總動(dòng)脈近心端。頸外動(dòng)脈結(jié)扎近端剪一小切口，取留置針從切口逆行插入，頭端置于頸外動(dòng)脈起始部，固定微導(dǎo)管，微導(dǎo)管另一端通過注射針頭、二通連于微泵上的注射器。采用分段臨時(shí)阻斷滴注法[5]，微泵速度為0.6 ml/h，重組腺病毒滴度為8×1010pfu/ml。在滴注攜帶目的基因腺病毒的開始時(shí)用臨時(shí)阻斷夾阻斷頸總動(dòng)脈血流20 min，然后放開血流20 min，后再阻斷頸總動(dòng)脈血流20 min，微泵持續(xù)滴注重組腺病毒共1 h，共0.6 ml。滴注完畢后，退出留置針，頸外動(dòng)脈殘端用絲線結(jié)扎?？p合頸部切口。頸部操作完成后行第一次枕大池自體血注入。

1.4 動(dòng)物的觀察 按照Endo[6]神經(jīng)功能評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，記錄手術(shù)前后各組動(dòng)物飲食(以標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料、自來水喂養(yǎng)) 、精神狀態(tài)、活動(dòng)情況及神經(jīng)功能變化等指標(biāo)。將SAH 后兔進(jìn)食量減少的程度分為4 級(jí)：1 級(jí)為全量(100%)；2 級(jí)為>50%但<100%；3 級(jí)為<50%；4 級(jí)為0。神經(jīng)功能根據(jù)動(dòng)物精神狀態(tài)及運(yùn)動(dòng)情況分為4級(jí)：1 級(jí)，活動(dòng)正常(無神經(jīng)功能障礙)；2 級(jí)：輕度或可疑神經(jīng)功能障礙(如精神差、嗜睡、活動(dòng)減少等)；3 級(jí)：中度神經(jīng)功能障礙(肢體無力、跛行、單癱等)；4 級(jí)：重度神經(jīng)功能障礙(劃圈運(yùn)動(dòng)、行走困難、四肢癱瘓等)。

1.5 灌注固定及電鏡標(biāo)本制作 所有白兔造模7 d后，以3%戊巴比妥鈉麻醉，暴露心臟，灌注固定。先以生理鹽水1000 ml 快速滴注，繼以4%多聚甲醛1000 ml灌注，前500 ml 快速滴完，后500 ml 緩慢滴注，灌注時(shí)間約為2 h。迅速開顱取右側(cè)大腦中動(dòng)脈及周圍少許腦細(xì)胞，并于電鏡固定液中后固定8 h。將固定的組織經(jīng)0.1 mol/l磷酸緩沖液漂洗，除去殘留固定劑；乙醇梯度脫水；將組織置入純丙酮液中浸透過夜，Epan812脫色，制成半薄切片，光鏡固定視野后經(jīng)枸櫞酸鉛乙酸鈾染色。日立H600電鏡觀察并攝片。

1.6 光鏡標(biāo)本制作 斷頭取腦后立即置于10%甲醛溶液內(nèi)固定過夜，各組分別取右側(cè)大腦中動(dòng)脈，置于4%多聚甲醛內(nèi)固定4 h后，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。修成厚4 μm塊，行HE染色以及免疫組化檢測(cè)eNOS。常規(guī)酒精脫水，石蠟包埋，染色過程包括5個(gè)內(nèi)容：脫蠟，染色，脫水，透明和封固。

1.7 免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)及方法 從染色陽性細(xì)胞數(shù)判定染色強(qiáng)度，陽性細(xì)胞數(shù)的計(jì)量方法為：每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)選取1張切片，每張切片觀察5個(gè)高倍鏡視野，計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)的數(shù)目，陽性細(xì)胞數(shù)為0者記為(-)；<5%為(+)；5～<25%為()；25～<50%為()；≥50%為()。同一張照片由2位病理科醫(yī)師獨(dú)立觀察后一起做出判斷。結(jié)果判斷：eNOS陽性染色定位于胞漿，因此表達(dá)陽性的細(xì)胞主要在胞漿著色，呈弧形或散在棕黃色。

2 結(jié) 果

2.1 動(dòng)物的一般情況 SAH后所有兔均有不同程度的神經(jīng)功能異常，其表現(xiàn)為反應(yīng)淡漠，食納差、運(yùn)動(dòng)減少、毛發(fā)雜亂，頸項(xiàng)強(qiáng)直，肢體癱瘓等。大部分兔注血后出現(xiàn)四肢抽搐，角弓反張，約15～30 s后緩解。動(dòng)物行為異常以注血管當(dāng)日明顯，次日略有緩解，二次注血后癥狀更為加重，以3～7 d為著。AdeNOS組1 d內(nèi)行為異常較SAH組明顯，如拒食，嗜睡等，可能與頸部手術(shù)有關(guān)，3 d后均有所緩解。

2.2 兔腦血管病理變化

2.2.1 光學(xué)顯微鏡下所見 對(duì)照組未見明顯組織學(xué)改變，大腦中動(dòng)脈管壁較薄，血管內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞無壞死、脫落，形成連續(xù)的單細(xì)胞層，胞核無固縮、濃染；內(nèi)彈力層平整、無皺縮和斷裂；血管平滑肌細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞器完整(見圖1、圖2)。SAH組大腦中動(dòng)脈管腔變窄，同時(shí)管壁增厚；血管內(nèi)膜出現(xiàn)皺褶，內(nèi)皮細(xì)胞向管腔突起，胞質(zhì)中見有空泡形成，部分細(xì)胞胞核濃染固縮；內(nèi)彈力層皺起，平滑肌細(xì)胞肥大、扭曲變形(見圖3、圖4)。AdeNOS組大腦中動(dòng)脈管壁未見增厚，血管內(nèi)膜完整，內(nèi)皮細(xì)胞無壞死、脫落，內(nèi)彈力層平整、無皺縮和斷裂；血管平滑肌細(xì)胞呈扁平狀，細(xì)胞器尚完整(見圖5、圖6)。用Image Pro Plus 6.0全自動(dòng)圖象分析系統(tǒng)測(cè)定大腦中動(dòng)脈內(nèi)徑長。對(duì)照組、SAH組及AdeNOS組血管直徑分別為(0.52±0.034) mm、(0.34±0.021) mm、(0.49±0.045) mm。SAH組與對(duì)照組、AdeNOS組血管直徑之間比較，有顯著性差異(P<0.05)；但AdeNOS組與對(duì)照組比較，二者無顯著性差異(P>0.05)。

2.2.2 透射電鏡下超微結(jié)構(gòu) 對(duì)照組見血管內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，胞核完整，平滑肌纖維排列整齊，核周細(xì)胞器豐富、完整(見圖7、圖8)。SAH組表現(xiàn)為血管內(nèi)皮細(xì)胞變方圓，腫脹、變性、部分壞死，胞漿電子密度下降，有的細(xì)胞內(nèi)含有空泡，細(xì)胞間緊密連接欠完整，部分內(nèi)膜脫落。平滑肌細(xì)胞不規(guī)則，腫脹明顯，部分細(xì)胞器喪失，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不完整(見圖9～圖11)。AdeNOS組痙攣程度明顯輕于SAH組，但與對(duì)照組比較仍可發(fā)現(xiàn)血管內(nèi)皮細(xì)胞連接輕散，無內(nèi)皮細(xì)胞脫落，線粒體輕度腫脹，結(jié)構(gòu)基本正常，僅見少量空泡。彈力膜無明顯扭曲變形，平滑肌細(xì)胞內(nèi)肌絲排列稍紊亂，細(xì)胞核內(nèi)常染色質(zhì)少(見圖12)。

2.3 兔大腦中動(dòng)脈eNOS表達(dá)變化 免疫組化染色顯示，AdeNOS組右側(cè)大腦中動(dòng)脈可見血管橫切面均有棕色染色，血管內(nèi)膜棕色顯著，證實(shí)重組eNOS表達(dá)于腦動(dòng)脈，主要表達(dá)于內(nèi)皮質(zhì)，平滑肌層和外膜少量表達(dá)。SAH大腦中動(dòng)脈少量棕色染色(見圖13～圖15)。eNOS在3組大腦中動(dòng)脈中總體的表達(dá)(見表1)。采用χ2檢驗(yàn)，SAH組與AdeNOS組血管比較，有顯著性差異(P<0.05)，SAH組與比較無顯著性差異(P>0.05)，AdeNOS組與對(duì)照組血管比較無顯著性差異(P>0.05)。

表1 eNOS在大腦中動(dòng)脈的表達(dá)

3 討 論

SAH所致的CVS是一個(gè)非常復(fù)雜的生化病理變化的綜合結(jié)果。隨著顯微神經(jīng)外科及神經(jīng)介入治療的迅速發(fā)展，手術(shù)本身造成的死亡及傷殘率都有明顯的降低，而腦血管痙攣的預(yù)防及治療就成為制約SAH治療效果的重要環(huán)節(jié)。經(jīng)過幾十年的研究，腦血管痙攣的病因及發(fā)病機(jī)制還未十分確切，然而，大量研究表明高分子溶血產(chǎn)物氧合血紅蛋白是引起腦血管痙攣?zhàn)畛跏嫉年P(guān)鍵因素[7]：(1)氧合血紅蛋白，在蛛網(wǎng)膜下腔出血后紅細(xì)胞分解產(chǎn)生，與NO結(jié)合，阻止其進(jìn)入血管平滑肌細(xì)胞；(2)血管內(nèi)皮細(xì)胞受損而NO合酶活性下降，NO產(chǎn)量減少；(3)紅細(xì)胞釋放的氧合血紅蛋白及其代謝產(chǎn)生的自由基使NO滅活，并可刺激ET產(chǎn)生；(4)出血刺激及其他縮血管物質(zhì)的釋放以及血NO減少，可促使內(nèi)皮細(xì)胞ETmRNA表達(dá)。 此外，SAH后腦血管內(nèi)皮所經(jīng)歷的明顯的病理改變可能導(dǎo)致內(nèi)皮表面的生化改變，破壞維持腦血管系統(tǒng)舒張和收縮的的自身平衡機(jī)制[8]。NO已被證明為EDRF，它的持續(xù)釋放為維持腦血管調(diào)節(jié)所必須。NO 從內(nèi)皮細(xì)胞釋放后進(jìn)入鄰近的平滑肌細(xì)胞，激活可溶性鳥苷酸環(huán)化酶(GC)，GC 產(chǎn)生環(huán)鳥苷酸(cGMP)，激活細(xì)胞內(nèi)鈣泵使游離鈣進(jìn)入細(xì)胞，并使平滑肌舒張。催化NO生

圖1 對(duì)照組大腦中動(dòng)脈×200

圖2 對(duì)照組大腦中動(dòng)脈×400

圖3 SAH組大腦中動(dòng)脈×200

圖4 SAH組大腦中動(dòng)脈×400

圖5 AdeNOS組大腦中動(dòng)脈×200

圖6 AdeNOS組大腦中動(dòng)脈×400

圖7 對(duì)照組大腦中動(dòng)內(nèi)膜及內(nèi)皮細(xì)胞TEP×6000

圖8 對(duì)照組大腦中動(dòng)平滑肌TEP×8000

圖9 SAH組大腦中動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞脫落TEP×6000

圖10 SAH組大腦中動(dòng)脈內(nèi)膜皺褶TEP×3500

圖11 SAH組大腦中動(dòng)脈內(nèi)膜及管腔狹窄TEP×6000

圖12 AdeNOS組大腦中動(dòng)脈TEP×8000

圖13 對(duì)照組大腦中動(dòng)脈eNOS免疫組化×400

圖14 SAH組大腦中動(dòng)脈eNOS免疫組化×400

圖15 AdeNOS組大腦中動(dòng)脈eNOS免疫組化×400

物合成的酶稱為一氧化氮合酶(NOS)。NOS以L-精氨酸(L-Agr)和分子氧為底物，生成NO和瓜氨酸，是NO合成過程中的重要限速因素。SAH后痙攣期血管壁中eNOS減少，證明了NO在SAH后腦血管痙攣發(fā)揮了重要作用[9]。

近年來研究發(fā)現(xiàn)鞘內(nèi)注射補(bǔ)充外源性NO 能夠防止CVS發(fā)生[10，11]。Zimmerman[12]發(fā)現(xiàn)將NO控釋體置于痙攣血管周圍能有效抑制血液因素引起的血管痙攣。但是SAH后CVS可能持續(xù)14 d左右時(shí)間，現(xiàn)有的NO供體普遍存在半衰期短的缺欠，反復(fù)鞘內(nèi)給藥增加了感染和顱內(nèi)壓波動(dòng)的風(fēng)險(xiǎn)，而其全身給藥由于對(duì)外周血壓的影響很大，無法達(dá)到在蛛網(wǎng)膜下腔內(nèi)有效治療濃度。故而尋找一種安全、有效、持續(xù)的合成NO的物質(zhì)相當(dāng)重要。Khurana等在腺病毒介導(dǎo)的重組內(nèi)皮細(xì)胞NO合成酶的基因轉(zhuǎn)移中，成功表達(dá)了NOS，把重組后的腺病毒載體注入蛛網(wǎng)膜下腔，腦脊液中NO濃度明顯升高，對(duì)照組出現(xiàn)明顯腦血管痙攣，而治療組則沒有，7 d在動(dòng)脈外膜及軟腦膜通過Western blot和免疫組化分析顯示eNOS的表達(dá)[13]。這些發(fā)現(xiàn)為eNOS轉(zhuǎn)染治療血管痙攣和內(nèi)皮源性功能障礙提供了堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)。然而，上述研究僅僅是將重組腺病毒注入腦池，而血管內(nèi)滴入轉(zhuǎn)染內(nèi)膜尚在起步階段。Kuoll等[5]將滴度1×1010pfu /ml包有eNOS腺病毒注入阻斷血流的大鼠頸動(dòng)脈，共轉(zhuǎn)染20 min，4 d后免疫染色證實(shí)動(dòng)脈表達(dá)重組基因，頸動(dòng)脈基礎(chǔ)cGMP水平顯著提高。Soat等[14]將攜帶eNOS的腺病毒注入阻斷血流的高膽固醇血癥兔的頸動(dòng)脈，結(jié)果證實(shí)重組eNOS表達(dá)于兔頸動(dòng)脈，并改善了內(nèi)皮依賴性的血管舒張。Barr等將重組B-gal的腺病毒經(jīng)導(dǎo)管有冠狀動(dòng)脈導(dǎo)入兔心臟，5 d發(fā)現(xiàn)冠狀動(dòng)脈有B-gal的表達(dá)[15]。張瓏等將攜帶eNOS的腺病毒微泵持續(xù)滴入大鼠頸動(dòng)脈，7 d后動(dòng)脈內(nèi)膜可見eNOS的表達(dá)[16]。在本實(shí)驗(yàn)中，血管內(nèi)AdeNOS組腦血管直徑較SAH組明顯增粗，免疫組化證實(shí)血管內(nèi)膜eNOS陽性表達(dá)明顯增多，提示eNOS在蛛網(wǎng)膜下腔出血后腦血管痙攣中有相當(dāng)重要的作用。eNOS的增多，進(jìn)而合成和釋放的NO增多，從而在一定程度上維持了SAH后血管舒張與收縮的平衡。

蛛網(wǎng)膜下腔出血遲發(fā)性腦血管痙攣發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全闡明，治療手段局限，隨著神經(jīng)介入技術(shù)的廣泛開展，在SAH患者超早期全腦血管造影時(shí)即可順便通過造影管給予攜帶eNOS基因的重組腺病毒，順利完成基因轉(zhuǎn)染可能是一種特異性治療。希望在不久的將來重組eNOS基因能夠在人類蛛網(wǎng)膜下腔出血后遲發(fā)性腦血管痙攣的預(yù)防和治療中發(fā)揮作用。

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Experimental study on Endothelial nitric oxide synthase gene transfection in prevention of cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rabbits

WUWeijun，ZHANGLong，QIANSuokai.

(DepartmentofNeurosurgery，YichunPeople’sHospitalofJiangxiProvince，336000China)

Objective To investigate the effects of intravascular transfection of eNOS gene on cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage in rabbits，and explore the related mechanism through observating pathohistology and ultrastructural structure of cerebral arteries. Methods Delayed cerebral vasospasm model after SAH was developed by injecting arterial blood twice through cisterna magna. Recombinant adenovirus was injected into carotid arterial to transfect the rabbits. Forty-five rabbits were randomly divided into three groups，control group，SAH group and AdeNOS group. SAH models were made by two injections of 2.5 ml fresh and non-heparinized arterial blood into the citerna magna of the rabbits in SAH and AdeNOS groups. All animals were killed using perfusion-fixation on day 7 and the brain arteryies tissues were removed for pathohistology and ultrastructural studies. Immunohistochemical method was used for detecting the expression of eNOS. Results In SAH modlel，blood accumulated in the subarachnoid space，especially in the basal cistern. Immunohistochemistry confirmed that recombinant eNOS gene expressed mainly in the endothelium. Under microscope，the average diameters of the cerebral arterial in AdeNOS group were larger than that in SAH group，and there was less vasospasm under electron microscope. SAH group had hippocampal tissue edema and widened perivascular space. SAH group had marked pathological changes of neuron ultrastructure including cell swelling，structural integrity，nuclear condensation，mitochondrial vacuolization. Conclusion This study suggests that continuous use of carotid artery infusion micro-pump method in rabbit cerebral artery make endothelial cells express eNOS，leading to relieve delayed CVS following SAH.

Subarachnoid hemorrhage； Ccerebral vasospasm； eNOS

1003-2754(2016)01-0013-05

2015-01-29；

2015-05-25

(1.江西省宜春市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 宜春 336000；2.解放軍第九四醫(yī)院神經(jīng)外科，江西 南昌 330002)

張 瓏，E-mail：zhanglong1995@163.com

R743.35

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