蘇冬娜　吳詩(shī)品

(深圳市人民醫(yī)院感染內(nèi)科,深圳518020)

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Smad7基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在體外對(duì)肝星狀細(xì)胞TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)的影響①

蘇冬娜吳詩(shī)品

(深圳市人民醫(yī)院感染內(nèi)科,深圳518020)

目的：探討Smad7基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Smad7-EGFP-BMSCs)在體外抑制肝纖維化的機(jī)制。方法：分離、純化大鼠BMSCs并經(jīng)Smad7基因腺病毒質(zhì)粒(Ad-Smad7-EGFP)轉(zhuǎn)染建立Smad7-EGFP-BMSCs。實(shí)驗(yàn)將大鼠肝星狀細(xì)胞HSC-T6分為A組、B組、C組和D組，分別與Smad7-EGFP-BMSCs、BMSCs、Smad7質(zhì)粒及PBS進(jìn)行共同培養(yǎng)72 h，采用ELISA測(cè)定培養(yǎng)液中Smad7和TGF-β1的表達(dá)，采用Western印跡法和RT-PCR法測(cè)定細(xì)胞Smad7、TGF-β1、Col Ⅰ、α-SMA蛋白和mRNA的表達(dá)，采用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡情況。結(jié)果：(1)ELISA結(jié)果顯示，B組、C組和D組培養(yǎng)液TGF-β1蛋白水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1 蛋白水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)；(2)Western印跡法和PCR結(jié)果顯示，B組、C組和D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白和mRNA表達(dá)水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白和mRNA表達(dá)水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1、ColⅠ、α-SMA蛋白和mRNA表達(dá)水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白和mRNA表達(dá)水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)；(3)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，B組、C組和D組HSC-T6細(xì)胞凋亡率較A組顯著升高(P<0.01)，而D組細(xì)胞凋亡率較B組和C組顯著升高(P<0.01)。結(jié)論：Smad7基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)作用肝星狀細(xì)胞TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及促進(jìn)星狀細(xì)胞凋亡而具有抗肝纖維化的作用。

Smad7；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；肝星狀細(xì)胞；TGF-β1信號(hào)通路；細(xì)胞凋亡

肝硬化是各種慢性肝病發(fā)展的晚期階段，具有發(fā)病率高、治療療效差及死亡率高的特點(diǎn)，我國(guó)是肝硬化的高發(fā)國(guó)家，研究肝硬化治療方法十分迫切。肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是慢性肝病進(jìn)展至肝硬化的重要階段，以細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix，ECM)過(guò)度沉積為主要病理特征[1,2]。肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)的激活是公認(rèn)的肝纖維化形成中心環(huán)節(jié)[3]。肝星狀細(xì)胞通過(guò)產(chǎn)生和分泌大量膠原蛋白破壞肝基質(zhì)代謝的平衡，由膠原蛋白組成的膠原纖維積聚在肝基質(zhì)中，導(dǎo)致慢性肝病和肝癌等肝臟疾病的纖維化病變[4]。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(Transforming growth factor-beta1，TGF-β1)通過(guò)其下游Smads等信號(hào)分子促進(jìn)大鼠肝星狀細(xì)胞活化、增殖，從而在肝纖維化發(fā)生發(fā)展的進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[5,6]。而Smad7是TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的主要抑制性蛋白，是抗纖維化作用的重要信號(hào)分子。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是一種具有自我更新、多向分化潛能的多能干細(xì)胞，具有多種免疫調(diào)節(jié)能力，可促進(jìn)肝細(xì)胞再生、轉(zhuǎn)分化為肝細(xì)胞和抑制肝纖維化，可部分恢復(fù)肝功能逆轉(zhuǎn)肝硬化，是除了肝移植手術(shù)外從根本上治療肝硬化的有效途徑[7]。本研究以體外培養(yǎng)的大鼠肝星狀細(xì)胞株HSC-T6為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，觀察Smad7基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染BMSCs(Smad7-EGFP-BMSCs)對(duì)HSC-T6的作用，探討其是否可通過(guò)阻斷TGF-β1信號(hào)通路而具有靶向抗纖維化的作用。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及細(xì)胞系Wistar大鼠，雄性，2周齡，體重30～40 g，由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)為SCXK(粵)2011-0029。肝星狀細(xì)胞系HSC-T6，為SV40轉(zhuǎn)染SD大鼠HSC，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2主要試劑Smad7基因腺病毒質(zhì)粒(Ad-Smad7-EGFP)和腺病毒質(zhì)粒(Ad-eGFP)，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；anti-CD29-PE、anti-CD34-FITC、anti-CD45-PE、anti-CD90-FITC、anti-RT1A-PE和anti-RT1B-FITC單克隆抗體，購(gòu)自美國(guó)Dako公司；TRIZOL試劑、PrimeScriptTMRT reagent Kit及TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，均購(gòu)于TaKaRa公司，Smad7及β-actin抗體均購(gòu)于Abcam公司；DMEM培養(yǎng)基、胰酶，購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；胎牛血清，購(gòu)自北京索萊寶科技公司；細(xì)胞裂解液、ECL Prime 蛋白印跡試劑，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；BCA蛋白定量試劑盒，購(gòu)自美國(guó)Pierce公司；PVDF膜，購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；鼠抗人Smad7、TGF-β1、膠原蛋白Ⅰ(CollagenⅠ，ColⅠ)、α-肌動(dòng)蛋白(alpha-smooth muscle actin，α-SMA)和β-actin一抗，購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記二抗，購(gòu)自北京中杉公司；大鼠Smad7、TGF-β1定量ELISA試劑盒，購(gòu)自北京環(huán)亞泰克生物公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自南京凱基生物科技公司。

1.1.3主要試驗(yàn)儀器恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱，購(gòu)自美國(guó)Revco CO公司；Epics Altra流式細(xì)胞儀，購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter公司；熒光倒置顯微鏡，購(gòu)自日本Olympus公司；EXL808全自動(dòng)酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Bio-Tek公司；ABI 7500 Real Time PCR System，購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1HSC細(xì)胞培養(yǎng)和傳代從液氮中取出HSC-T6細(xì)胞株迅速?gòu)?fù)蘇后轉(zhuǎn)入塑料培養(yǎng)瓶中(1×105個(gè)/ml)，用含10%胎牛血清、1%青霉素和鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基于5%CO2、37℃的恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)接近于鋪滿整個(gè)瓶底時(shí)，用含0.25%胰酶消化細(xì)胞，傳代，取第3代生長(zhǎng)良好的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2大鼠BMSCs的分離、純化和鑒定2周齡SD大鼠脫臼處死，于75%醫(yī)用酒精中浸泡10 min，在無(wú)菌條件下取脛骨和股骨，切除兩段骨骺，用DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓，制成單細(xì)胞懸液，采用貼壁法在DEMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)和純化。選取生長(zhǎng)良好的第3代BMSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將BMSCs分別加入Anti-CD29-PE、anti-CD34-FITC、anti-CD45-PE、anti-CD90-FITC、anti-RT1A-PE和anti-RT1B-FITC單克隆抗體，避光反應(yīng)并洗滌后才有流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析檢測(cè)細(xì)胞所標(biāo)記的熒光長(zhǎng)度以確定其表型和純度。體外間充質(zhì)干細(xì)胞定向分化成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞并鑒定。

1.2.3大鼠Smad7-EGFP-BMSCs的建立取第三代BMSCs，以1×106個(gè)/ml細(xì)胞濃度接種至培養(yǎng)板，待細(xì)胞融合率至70%時(shí)，每孔加入不同病毒感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of Infection，MOI)的Ad-Smad7-eGFP(以Ad-eGFP和PBS作為對(duì)照)和Lipofecta-mine2000轉(zhuǎn)染試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染，10 h后換液，48 h后加入新霉素進(jìn)行篩選，熒光倒置顯微鏡檢測(cè)病毒的轉(zhuǎn)染率。以細(xì)胞內(nèi)表達(dá)綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)表示感染成功。以感染效率高(>90%)、轉(zhuǎn)染值(MOI)低確定最佳感染條件。以Smad7慢病毒質(zhì)粒在最佳條件進(jìn)對(duì)BMSCs進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染成功后建立Smad7-EGFP-BMSCs基因工程干細(xì)胞，分別采用Western印跡法和PCR法測(cè)定Smad7蛋白和mRNA含量。

1.2.4Smad7-EGFP-BMSCs抗纖維化體外機(jī)制的研究取第三代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HSC-T6細(xì)胞經(jīng)0.25%胰酶消化，將細(xì)胞密度調(diào)整至1×106個(gè)/ml后接種于96孔板，實(shí)驗(yàn)分為A組、B組、C組和D組，分別與Smad7-EGFP-BMSCs(1×104ml-1)、BMSCs(1×104ml-1)、Smad7質(zhì)粒及同體積PBS進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.4.1ELISA測(cè)定上清液Smad7和TGF-β1的表達(dá)每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，各組培養(yǎng)72 h后收集各組細(xì)胞上清液，采用ELISA法測(cè)定上清液Smad7、TGF-β1蛋白的表達(dá)。酶標(biāo)包被板設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品10 μl，待測(cè)樣本10 μl，37℃下孵化30 min，洗板，加入酶標(biāo)工作液，洗板3次，分別加入顯色劑A 和B ，37℃避光顯色15 min，加入終止液以終止反應(yīng)，立即采用酶標(biāo)儀測(cè)定A值，計(jì)算樣本中Smad7和TGF-β1蛋白濃度。

1.2.4.2Western印跡法測(cè)定細(xì)胞Smad7、TGF-β1、Col Ⅰ 和α-SMA蛋白每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后收集HSC-T6細(xì)胞，采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定各組Smad7、TGF-β1、Col Ⅰ 和α-SMA蛋白濃度。按蛋白量40 μg/孔進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳(80 V 20 min，150 V 約1.5 h)，轉(zhuǎn)膜(400 mA 2 h)至0.45 μm的PVDF膜，于5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入1∶1 000稀釋的一抗，4℃過(guò)夜，TBST緩沖液洗膜(5min×3次)，加1∶5 000稀釋的二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液充分洗膜，應(yīng)用ECL Prime 蛋白印跡試劑進(jìn)行化學(xué)發(fā)光顯色，X片曝光顯影。用美國(guó)UVP公司Lab Works軟件對(duì)Western條帶進(jìn)行定量分析，讀取積分光密度值。

1.2.4.3qRT-PCR法測(cè)定細(xì)胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMAmRNA每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后收集HSC-T6細(xì)胞，加入TRIZOL裂解液裂解細(xì)胞后提取總RNA，酶標(biāo)儀測(cè)定濃度及純度。應(yīng)用TaKaRa逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit，嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)將提取的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)NCBI-GenBank ColⅠ基因序列，利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物序列(見(jiàn)表1)。并應(yīng)用TaKaRa SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒，進(jìn)行PCR體系的擴(kuò)增及反應(yīng)。反應(yīng)體系為50 μl： 10×PCR Buffer 5 μl，10 μmol/L dNTP 1 μl，模板1 μl，上游和下游引物各1 μl，0.5 μl 2 U/μl Taq DNA聚合酶(含Mg2+)，加入ddH2O至50 μl。PCR 反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，94℃30 s，退火55℃ 45 s，72℃ 60 s，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，72℃延展10 min。

表1引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度

Tab.1Primer sequences and product lengths

NamePrimersequencesProductlength(bp)Smad75'-TTCCTCCGCTGAAACAGGG-3'2205'-CCTCCCAGTATGCCACCAC-3'TGF-β15'-TGCTAATGGTGGACCGCAA-3'1125'-CACTGCTTCCCGAATGTCTG-3'Col-I5'-TACAGCACGCTTGTGGATG-3'2565'-TTGAGTTTGGGTTGTTGGTC-3'α-MSA5'-CTGTTCCGCCATCCTTCAT-3'1755'-CCGTGATCTCCTTCTGCATT-3'β-actin5'-CCGTGATCTCCTTCTGCATT-3'2685'-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3'

1.2.5細(xì)胞凋亡的測(cè)定每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)72 h后0.25%胰酶消化收集細(xì)胞，離心沉淀細(xì)胞，用預(yù)冷磷酸鹽緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，采用細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。取300 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC、5 μl碘化丙啶(PI)標(biāo)記，室溫避光反應(yīng)5 min，采用流式細(xì)胞儀分析各組HSC-T6細(xì)胞的凋亡情況。綠色熒光FITC通道檢測(cè)Annexin V-FITC，紅色熒光通道檢測(cè)PI，每個(gè)標(biāo)本測(cè)定10 000個(gè)細(xì)胞，測(cè)定速率為50～60個(gè)/min。

2　結(jié)果

2.1最佳轉(zhuǎn)染條件確認(rèn)轉(zhuǎn)染48 h后在熒光倒置顯微鏡下可觀察到各組細(xì)胞均表達(dá)GFP。不同MOI(0、5、10、30、50、100)進(jìn)行轉(zhuǎn)染HSC-T6細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)，隨著MOI增加，HSC-T6細(xì)胞熒光表達(dá)增強(qiáng)，MOI=10時(shí)可見(jiàn)綠色熒光信號(hào)，但是MOI從10增至30時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)抑制明顯加重，因而最佳MOI為10。HSC-T6細(xì)胞經(jīng)Ad-Smad7-eGFP轉(zhuǎn)染成功后Smad7蛋白和mRNA表達(dá)水平顯著升高。

2.2各組培養(yǎng)液Smad7和TGF-β1的水平ELISA結(jié)果顯示，B組、C組和D組培養(yǎng)液TGF-β1蛋白水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7蛋白水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1 蛋白水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7蛋白水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)，具體見(jiàn)表2。

表2各組培養(yǎng)液Smad7、TGF-β1水平的比較(n=6)

Tab.2Comparison of Smad7 and TGF-β1 in culture medium (n=6)

GroupsSmad7(ng/ml)TGF-β1(ng/ml)GroupA16.57±1.2426.73±1.85GroupB21.25±1.381)18.76±1.571)GroupC21.96±1.451)19.24±1.631)GroupD27.64±1.771)2)3)13.95±1.251)2)3)

Note：Compared with group A,1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

表3各組培養(yǎng)液Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白表達(dá)水平的比較(n=6)

Tab.3Comparison of Smad7, TGF-β1, ColⅠ,and α-MSA in cultured cells (n=6)

GroupsSmad7TGF-β1ColⅠα-MSAGroupA0.52±0.071.24±0.110.86±0.071.43±0.10GroupB0.74±0.091)0.84±0.081)0.62±0.051)0.94±0.111)GroupC0.76±0.101)0.79±0.101)0.57±0.061)0.88±0.091)GroupD1.12±0.121)2)3)0.57±0.081)2)3)0.35±0.031)2)3)0.49±0.061)2)3)

Note：Compared with group A,1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

2.3各組細(xì)胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白的表達(dá)PCR結(jié)果顯示，B組、C組和D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白表達(dá)水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白表達(dá)水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA 蛋白表達(dá)水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 蛋白表達(dá)水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)，具體見(jiàn)表3。

2.4各組細(xì)胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA的表達(dá)PCR結(jié)果顯示，B組、C組和D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA表達(dá)水平較A組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 mRNA表達(dá)水平較A組顯著升高(P<0.01)；D組TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA表達(dá)水平較B組和C組顯著降低(P<0.01)，而Smad7 mRNA表達(dá)水平較B組和C組顯著升高(P<0.01)，具體見(jiàn)表4。

2.5各組細(xì)胞凋亡情況的比較流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，B組、C組和D組HSC-T6細(xì)胞凋亡率較A組顯著升高(P<0.01)，而D組細(xì)胞凋亡率較B組和C組顯著降低(P<0.01)，具體見(jiàn)表5。

表4各組細(xì)胞Smad7、TGF-β1、ColⅠ和α-SMA mRNA表達(dá)水平的比較(n=6)

Tab.4Comparison of mRNA level of Smad7,TGF-β1,ColⅠ,and α-MSA in cultured cells (n=6)

GroupsSmad7TGF-β1ColⅠα-MSAGroupA0.36±0.041)0.98±0.081)0.82±0.081)1.18±0.101)GroupB0.52±0.041)0.74±0.061)0.59±0.061)0.68±0.071)GroupC0.49±0.051)0.69±0.051)0.55±0.071)0.73±0.101)GroupD0.84±0.081)2)3)0.51±0.061)2)3)0.31±0.041)2)3)0.36±0.051)2)3)

Note：Compared with group A,1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

表5Smad7-EGFP-BMSCs對(duì)HSC-T6細(xì)胞凋亡的影響(n=6)

Tab.5Impact of Smad7-EGFP-BMSCs on apoptosis of HSC-T6 cells (n=6)

GroupsSmad7GroupA1.87±0.541)GroupB4.83±0.731)GroupC5.22±0.851)GroupD9.48±1.481)2)3)

Note：Compared with group A, 1)P<0.01;compared with group B,2)P<0.01;compared with group C,3)P<0.01.

3　討論

肝硬化是一種以彌漫性纖維化的肝組織、再生結(jié)節(jié)和假小葉為特點(diǎn)的慢性疾病，機(jī)制至今尚不完全明確。肝纖維化是肝臟受到各種慢性損傷后的自我修復(fù)反應(yīng)，主要表現(xiàn)為EMA的過(guò)量合成與沉積。目前普遍認(rèn)為HSC 是肝臟分泌ECM的主要細(xì)胞，HSC 激活是肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)[8]。正常情況下肝星狀細(xì)胞處于靜息狀態(tài)，僅合成少量膠原。但是在肝臟疾病過(guò)程中，肝星狀細(xì)胞被激活，分泌大量ColⅠ形成EMA，并特異性表達(dá)α-SMA，同時(shí)ECM降解減少，最終導(dǎo)致肝纖維化[9]。HSC是肝纖維化基質(zhì)中ColⅠ的主要來(lái)源[10]，因此抑制肝星狀細(xì)胞生成ColⅠ是抑制肝纖維化形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[11,12]。

TGF-β1是目前發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)的促纖維化因子，它與細(xì)胞表面受體結(jié)合后可通過(guò)TGF-β1/Smads途徑傳遞活化信號(hào)，進(jìn)而促進(jìn)HSC表型轉(zhuǎn)變、增殖及ECM的合成[13]。Smads蛋白是唯一的TGF-β1受體后信使分子，TGF-β1通過(guò)其Ⅰ型和Ⅱ型受體完成信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，以激活其下游Smads信號(hào)分子的磷酸化，隨后引起核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)控基因的表達(dá)。Smads家族中Smad2～4、Smad6和Smad7參與TGF-β的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[14]，其中Smad7 是TGF-β1/Smad信號(hào)傳導(dǎo)途徑中重要的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，可阻止Smad2、Smad3 的磷酸化，從而對(duì)TGF-β1/Smad信號(hào)通路發(fā)揮負(fù)性調(diào)控[15]。

BMSCs是一種具有自我更新、多向分化潛能的多能干細(xì)胞，可分化為多種骨骼及附屬器官組織，參與機(jī)體的多項(xiàng)功能調(diào)節(jié)[16]。最新研究表明，BMSCs是一種免疫特許細(xì)胞，自身不表達(dá)主要組織相容性復(fù)合體及其他共刺激分子，具有對(duì)自然殺傷細(xì)胞及細(xì)胞毒性T細(xì)胞的逃逸功能，在骨髓抑制的替代治療中有很大的應(yīng)用前景[17]。有研究顯示通過(guò)靜脈注射或體外灌注BMSCs可以提高爆發(fā)性肝功能衰竭小鼠存活率[18]，另有研究顯示BMSCs可改善肝衰竭大鼠的免疫功能和肝臟組織炎性反應(yīng)壞死狀態(tài)，促進(jìn)肝功能的恢復(fù)[19]，但是其機(jī)制卻仍未有定論。

本研究結(jié)果顯示，Smad7-EGFP-BMSCs可降低HSC-T6細(xì)胞分泌TGF-β1蛋白水平(P<0.01)，而增加Smad7蛋白水平(P<0.01)；Smad7-EGFP-BMSCs可降低HSC-T6細(xì)胞表達(dá)TGF-β1、ColⅠ和α-SMA蛋白和mRNA水平(P<0.01)，而增加Smad7蛋白和mRNA水平(P<0.01)；Smad7-EGFP-BMSCske促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞凋亡(P<0.01)。并且Smad7-EGFP-BMSCs對(duì)HSC-T6細(xì)胞的上述作用較單獨(dú)BMSC或Smad7質(zhì)粒作用更強(qiáng)，這可能與Smad7-EGFP-BMSCs同時(shí)發(fā)揮BMSCs和Smad7質(zhì)粒作用因此抗肝纖維化作用更強(qiáng)有關(guān)。

總之，Smad7基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可通過(guò)作用肝星狀細(xì)胞TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路以及促進(jìn)肝星狀細(xì)胞凋亡而具有抗肝纖維化的作用。

[1]Koller T，Kollerova J，Huorka M，etal.Noninvasive scoring algorithm to identify significant liver fibrosis among treatment-na?ve chronic hepatitis C patients [J].Eur J Gastroenterol Hepatol，2014，26(10)：1108-1115.

[2]Fuchs BC，Hoshida Y，F(xiàn)ujii T，etal.Epidermal growth factor receptor inhibition attenuates liver fibrosis and development of hepatocellular carcinoma [J].Hepatology，2014，59(4)：1577-1590.

[3]Ghosh AK，Quaggin SE，Vaughan DE.The molecular basis of outraged Fibrosis：potential therapeutic approaches [J].J Exp Biol Med，2013，238(5)：461-481.

[4]Yin C，Evason KJ，Asahina K，etal.Hepatic stellate cells in liver development，regeneration，and cancer [J].J Clin Invest，2013，123(5)：1902-1910.

[5]王雅蕊，李俊，黃成，等.姜黃素對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞中TGF-β調(diào)節(jié)的NADPH氧化酶4的激活及Smad信號(hào)通路的影響[J].安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50(3)：319-323.

[6]馮佳，向陽(yáng)，夏燕，等.益氣養(yǎng)陰方對(duì)大鼠肺纖維化的干預(yù)作用及對(duì)Smad2、Smad7蛋白的影響[J].中國(guó)免疫學(xué)雜志，2015，31(3)：334-338.

[7]Ma S，Zhong D，Chen H，etal.The immunomodulatory effect of bone marrow stromal cells (BMSCs) on interleukin(IL)-23/IL-17-mediated ischemic stroke in mice[J].J Neuro-immunol，2013，257(1-2)：28-35.

[8]Friedman SL.The mechanisms of hepatic fibrogenesis [J].Gastroenterology，2008，134(6)：1655-1669.

[9]Liu Y，Munker S，Mullenbach R，etal.IL-13 Signaling in liver fibrogenesis [J].J Front Immunol，2012，3：116.

[10]Brenner DA，Kisseleva T，Scholten D，etal.The origin of myofibroblasts in liver fibrosis [J].J Fibrogenesis Tissue Repair，2012，5 (S1)：17.

[11]Lekkerkerker AN，Aarbiou J，van Es T，etal.The cellular players in lung fibrosis [J].Curr Pharm Des，2012，18(27)：4093-4102.

[12]陳厚文，郭夢(mèng)丹，陳琦，等.TNF-α和IL-13對(duì)人肺成纖維細(xì)胞膠原蛋白生成的影響[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(6)：667-673.

[13]Liu RM，Gaston Pravia KA.Oxidative stress and glutathione in TGF-beta mediated fibrogenesis [J].J Free Radic Biol Med，2010，48(1)： 1-15.

[14]Zhao TT，Zhang HJ，Lu XG，etal.Chai huang-Yishen granule inhibits diabetic kidney disease in rats through blocking TGF-β/Smad3 signaling [J].PLoS One，2014，9(3)：e90807.

[15]Moro T，Shimoyama Y，Kushida M，etal.Glycyrrhizin and its metabolite inhibit Smad3-mediated type I collagen gene transcription and suppress experimental murine liver fibrosis [J].Life Sci，2008，83(15-16)：531-539.

[16]Alempijevic T，Stulic M，Popovic D，etal.The role of fecal calprotectin in assessment of hepatic encephalopathy in patients with liver cirrhosis [J].Acta Gastroenterol Belg，2014，77(3)：302-305.

[17]郭春輝，韓蘭秀，萬(wàn)美容，等.失代償性肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)自體淋巴細(xì)胞增殖的影響及機(jī)制研究[J].中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2015，29(2)：100-102.

[18]Parekkadan B，Van Poll D，Suganuma K，etal.Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure [J].PLoS One，2007，2(9)：e941.

[19]周銳，周元平，鄭玲，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)大鼠爆發(fā)性肝功能衰竭治療作用的初步觀察[J].中華傳染病雜志，2012，30(2)：85-89.

[收稿2015-12-03]

(編輯張曉舟)

Effect of Smad7 gene modified BMSCs to TGF-β signal conduction in hepatic stellate cells

SU Dong-Na,WU Shi-Pin.

Department of Infetious Disease,Shenzhen People′s Hospital,Shenzhen 518020,China

Objective:To investigate the mechanism of Smad7 gene modified bone marrow mesenchymal stem cells(Smad7-BMSCs)to prevent hepatic fibrosis in vitro.Methods: Smad7-EGFP-BMSCs were established by isolating and purifying BMSCs of rats,and transfecting Ad-Smad7-EGFP.HSC-T6 were divided into Group A,Group B,Group C and Group D,which were respectively incubated with Smad7-EGFP-BMSCs,BMSCs,Smad7 plasmid and PBS for 72 hours.The level of Smad7and TGF-β1protein in the culture solution was determined by ELISA.The expression of mRNA and protein of Smad7,TGF-β1,Col Ⅰ and α-SMA in the hepatic stellate cells were respectively determined by Western blot and RT-PCR.Cellular apoptosis was determined by flow cytometry.Results: (1)The results of ELISA showed that the level of TGF-β1 protein decreased(P<0.01) but the level of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group B,Group C and Group D compared with Group A;the level of TGF-β1 protein decreased(P<0.01) but the level of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group D compared with Group B and Group C.(2)The results of Western blot and RT-PCR showed that the level of mRNA and protein of Smad7,TGF-β1,Col Ⅰ and α-SMA decreased(P<0.01) but the level of mRNA and protein of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group B,Group C and Group D compared with Group A;the level of mRNA and protein of Smad7,TGF-β1,Col Ⅰ and α-SMA decreased(P<0.01) but the level of mRNA and protein of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group D compared with Group B and Group C.(3)The results of flow cytometry showed that the rate of cellular apoptosis decreased(P<0.01)，but the level of Smad7 protein increased (P<0.01) in Group B,Group C and Group D compared with Group A;the rate of cellular apoptosis decreased(P<0.01)in Group D compared with Group B and Group C.Conclusion: Smad7-BMSCs can have the effect of anti-hepatic fibrosis by affecting TGF-β1 signal pathway and promoting cellular apoptosis in hepatic stellate cells.

Smad7;BMSCs;Hepatic stellate cells;TGF-β1 signal pathway;Cellular apoptosis

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.007

蘇冬娜(1977年-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事病毒性肝炎的發(fā)病機(jī)制研究，E-mail:sudona@qq.com。

及指導(dǎo)教師：吳詩(shī)品(1963年-)，男，博士，主任醫(yī)師，主要從事肝硬化的干細(xì)胞治療研究。

R392

A

1000-484X(2016)10-1441-05

①本文為深圳市科創(chuàng)委立項(xiàng)課題(JCYJ20140416122812003)。