馬倩倩　梁秋華　孫　琳　張正軍　于世鵬

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧272067)

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橋本氏甲狀腺炎患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞的表達(dá)及意義

馬倩倩梁秋華孫琳張正軍于世鵬①

(濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院，濟(jì)寧272067)

目的：檢測初診橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例，探討其在HT發(fā)病中的意義。方法：收集初診的HT患者作為病例組(HT,n=53)，另外選取年齡、性別相匹配的正常人作為對照組(HC,n=43)，并根據(jù)甲狀腺功能狀態(tài)將HT組分為甲狀腺功能正常組(HT-A,n=15)、亞臨床甲減組(HT-B,n=14)和臨床甲減組(HT-C,n=24)。流式細(xì)胞儀檢測外周靜脈血中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例，酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中IFN-γ、IL-17水平，化學(xué)發(fā)光法檢測甲狀腺功能及甲狀腺特異性抗體滴度。結(jié)果：HT組外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例、IFN-γ、IL-17、TPOAb與TgAb水平均顯著高于HC組，P<0.01。雙變量相關(guān)分析顯示HT患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞的比例與IFN-γ、TPOAb、TgAb均呈正相關(guān)(P<0.01，P=0.015，P<0.01)。結(jié)論：CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在HT患者外周血中呈高表達(dá)，CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞可能參與了HT的發(fā)病過程。

橋本氏甲狀腺炎;記憶性細(xì)胞;CD4+CD45RO+

橋本氏甲狀腺炎(Hashimoto′s thyroiditis,HT)是典型的T細(xì)胞介導(dǎo)的器官特異性自身免疫性甲狀腺疾病[1]。在HT中，正常的甲狀腺腺體被淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤，甲狀腺濾泡破壞并甲狀腺組織逐漸萎縮，伴有血清中甲狀腺過氧化物酶抗體(TPOAb)及甲狀腺球蛋白抗體(TgAb)等甲狀腺特異性抗體升高。

一般認(rèn)為，遺傳和環(huán)境因素之間相互作用引起的機(jī)體免疫耐受的打破和自身反應(yīng)性T細(xì)胞的激活是HT發(fā)病的關(guān)鍵，然而，其具體發(fā)生機(jī)制仍不明確。記憶性T細(xì)胞是初始T細(xì)胞在外周淋巴器官內(nèi)接受抗原提呈細(xì)胞提呈的抗原后活化直接分化而成或由效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來。研究證實(shí)，記憶性T細(xì)胞與自身反應(yīng)性T細(xì)胞可以相互轉(zhuǎn)化并參與了包括多發(fā)性硬化、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等多種自身免疫性疾病的發(fā)生[1-4]，但其與HT的發(fā)病是否有關(guān)，尚無相關(guān)報(bào)道。本研究通過檢測HT患者與正常人外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞、IFN-γ、IL-17、TPOAb及TgAb的表達(dá)水平及其之間的相關(guān)性，旨在探究CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞與HT發(fā)病的相關(guān)性，為研究HT的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1研究對象2015年1月1日～2016年2月1日期間就診于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的初診HT患者53名(女性51例，男性2例)，年齡(38.81±15.80)歲，且無確診的自身免疫性疾病、未服用過影響甲狀腺功能的藥物、未使用免疫抑制劑和糖皮質(zhì)激素類藥物，排除各種原因引起的急慢性炎癥。選取43例 (女性42例，男性1例)、年齡(37.40±9.65歲)、性別與HT組相匹配的于濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院體檢或者咨詢的正常人作為對照組。根據(jù)甲狀腺功能狀態(tài)將HT患者組分為甲狀腺功能正常 (HT-A，女性15例，男性1例)、亞臨床甲減組 (HT-B，女性14例，男性0例)和臨床甲減組 (HT-C，女性23例，男性1例)3個(gè)亞組。本研究獲得濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象均簽署書面知情同意書。HT的診斷基于《內(nèi)科學(xué)》第8版(人民衛(wèi)生出版社)中HT的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。

1.1.2主要儀器和試劑流式細(xì)胞儀型號為美國BD公司的FACS Calibur；FITC標(biāo)記大鼠抗人CD4 IgG2a、PE標(biāo)記大鼠抗人CD45RO IgG2b及其同型對照均購自美國e-Bioscience公司。IL-17細(xì)胞因子和IFN-γ細(xì)胞因子試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；酶標(biāo)儀購自ThermoLabsystems公司。免疫分析儀型號為德國羅氏公司的Cobas6000。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本收集清晨空腹條件下抽取研究對象外周血2 ml×2管，其中1管送至檢驗(yàn)科檢測甲狀腺功能狀態(tài)及甲狀腺相關(guān)特異性抗體，另1管1 000 r/min離心10 min后取上層血漿保存于-80℃冰箱，用于細(xì)胞因子的ELISA檢測，收集下層血細(xì)胞用于CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞流式檢測。標(biāo)本處理時(shí)間在采血后4 h以內(nèi)完成。

1.2.2甲功及甲狀腺抗體的測定甲狀腺功能及甲狀腺特異性抗體均由濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科按照標(biāo)準(zhǔn)化流程應(yīng)用化學(xué)發(fā)光法檢測。正常范圍如下:FT3(3.10～6.80 pmol/L)、FT4(12.0～22.0 pmol/L)、TSH(0.274～4.20 mU/L)、TPOAb(0～34 U/ml)、TgAb(0～110 U/ml)。

1.2.3流式細(xì)胞測定取50 ml全血應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞。步驟如下:①對應(yīng)標(biāo)本編號進(jìn)行試管編號，并按要求每一試管加入對應(yīng)抗體及標(biāo)本，渦旋混勻，避光孵育15 min；②加溶血素1.5 ml，渦旋混勻，避光孵育10 min，1 300 r/min離心5 min后去上清；③加PBS 1.5 ml渦旋混勻，1 300 r/min離心5 min后去上清，加PBS 0.5 ml，渦旋混勻；④上流式細(xì)胞儀檢測，用Cells Quest軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.2.4酶聯(lián)免疫吸附測定應(yīng)用ELISA測定血清IFN-γ、IL-17水平，步驟如下:①確定所需抗體包被酶標(biāo)板孔數(shù)目，增加2孔作為TMB空白顯色孔，將不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品及已用樣品稀釋液稀釋的樣品100 μl加入，加封板膜，37℃反應(yīng)90 min后洗滌；②每孔加入100 μl生物素抗人抗體工作液，加封板膜，37℃反應(yīng)60 min后用洗滌；③每孔加入100 μl親和素-過氧化物酶抗體工作液(TMB空白顯色孔除外)，加封板膜，37℃反應(yīng)30 min后洗滌；④每孔加入TMB顯色液90 μl，37℃避光反應(yīng)30 min后觀察每孔顏色變?yōu)樗{(lán)色的情況；⑤每孔加入TMB終止液100 ml，藍(lán)色變?yōu)辄S色；⑥用酶標(biāo)儀測定OD值；⑦將TMB空白顯色孔設(shè)為對照，做出曲線圖，找出各樣品對應(yīng)濃度；⑧分析。

2　結(jié)果

2.1甲狀腺指標(biāo)比較HT組血清TSH濃度、TPOAb與TgAb滴度均顯著高于HC組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，HT組血清FT4濃度顯著低于HC組(P<0.01)，血清FT3濃度與HC組無顯著差異(P=0.281)。見表1。

2.2外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例HT組外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例(29.31±5.79)較HC組(21.03±3.06)顯著升高(P<0.01)，HT-A組(25.07±4.34)、HT-B組(30.09±3.80)和HT-C組(31.08±5.84)CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例均顯著高于HC組(P=0.030,P<0.01,P<0.01)，HT-C組CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例均顯著高于HT-A組(P=0.012)。見圖1、表2。

表1病例組與對照組的臨床資料

Tab.1Clinical information of patients with Hashimoto′s thyroiditis(HT) and healthy controls(HC)

ItermsCases(n)Gender(F/M)FT3(pmol/L)FT4(pmol/L)TSH(mU/L)TPOAb(U/ml)TgAb(U/ml)HT5351/24.57(3.60-5.10)11.66(8.45-13.931)8.64(2.76-38.64)1)449.80(325.30-600)1)466.70(298.20-1350.00)1)HT-A1515/14.79(4.16-5.29)14.20(13.30-17.35)2.08(1.20-2.60)378.90(266.95-600.00)1)368.90(292.45-540.65)1)HT-B1414/04.58(3.93-5.06)13.54(12.40-15.24)1)7.76(6.01-9.80)1)2)449.80(148.50-553.95)1)605.70(524.20-2919.50)1)2)HT-C2423/14.41(2.30-4.96)9.04(3.23-10.87)1)2)3)30.92(9.47-100.00)1)2)3)490.30(338.20-600.00)1)465.10(199.40-1968.00)1)HC4342/14.72(4.21-5.07)15.98(14.71-17.27)1.83(1.52-2.13)7.92(5.06-11.50)24.52(16.85-28.05)NR--3.10-6.8012.0-22.00.274-4.200-340-110

Note：vs HC,1)P<0.05;vs HT-A,2)P<0.05;vs HT-B,3)P<0.05；HT.Hashimoto′s Thyroiditis;HT-A.Euthyroid subset of Hashimoto′s thyroiditis;HT-B.Subclinical hypothyroidism of Hashimoto′s Thyroiditis;HT-C.Overt hypothyroidism subset of Hashimoto′s Thyroiditis;HC.Healthy control;FT3.Free triiodothyronine;FT4.Free thyroxine;THS.Thyroid-stimulating hormone;TPOAb.Thyroid peroxidaseantibody;TgAb.Thyroglobulin antibody;NR.Normal range.

圖1　CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞流式細(xì)胞儀散點(diǎn)圖和箱式圖Fig.1　Scatter plots and box plots of flow cytometric analysis of CD4+CD45RO+memory T cellsNote: Percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,was significantly higher than that in HC(P<0.01),percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs in HT-A,HT-B,HT-C,were all significantly higher than that in HC(P=0.030,P<0.01,P<0.01).

2.3血清中細(xì)胞因子水平ELISA結(jié)果HT組血清IFN-γ水平 (282.4±74.42)較HC組(188.46±38.08)顯著升高(P<0.01)，HT-A組 (243.03±32.24)、HT-B組(315.78±55.78)、HT-C組(294.35±87.89)血清IFN-γ水平均顯著高于HC組(P<0.01,P<0.01,P<0.01)，此外， HT-B組和HT-C組IFN-γ水平均顯著高于HT-A組(P<0.01,P=0.043)，HT-B組和HT-C組兩組間IFN-γ水平無顯著差異(P=0.622)。HT組血清IL-17水平[254.42(221.73～326.40)]較HC組[183.20(167.61～206.64)]顯著升高(P<0.01)，HT-A組[233.45(194.62～251.19)]、HT-B組[249.09(218.04～263.40)]和 HT-C 組[304.85(226.01～449.76)]血清IL-17水平較HC組顯著升高(P=0.018,P<0.01 ,P<0.01)，此外，HT-A組血清IL-17水平顯著低于HT-C組(P=0.012)。見表2。

表2HT組與對照組CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞及細(xì)胞因子水平表達(dá)

Tab.2Expression of CD4+CD45RO+memory T cells and cytokines between Hashimoto′s Thyroiditis(HT)and Healthy Controls(HC)

ItermsCD4+CD45RO+memoryTcell(%)IFN-γ(pg/ml)IL-17(pg/ml)HT29.31±5.791)282.84±74.421)254.42(221.73-326.40)1)HT-A25.57±4.341)243.03±32.241)233.45(194.62-251.19)1)HT-B30.09±3.801)315.78±55.781)2)249.09(218.04-263.40)1)HT-C31.08±5.841)2)294.35±87.891)2)304.85(226.01-449.76)1)2)HC21.03±3.06188.46±38.08183.20(167.61-206.64)

Note：vs HC,1)P<0.05;vs HT-A,2)P<0.05;vs HT-B,3)P<0.05;IFN-γ.Interferon-γ；IL-17.Interleukin-17.

表3HT組外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞與細(xì)胞因子、甲狀腺特異性抗體相關(guān)性

Tab.3Correlation between CD4+CD45RO+memory T cells，cytokines and thyroid autoantibodies in Hashimoto′s thyroiditis(HT)

ItermsIFN-γIL-17TPOAbTgAbr0.7850.3540.4340.551P<0.010.051=0.015<0.01

2.4相關(guān)性分析應(yīng)用雙變量相關(guān)性分析HT患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例與血清IFN-γ、IL-17、甲狀腺相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系，結(jié)果顯示外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例與血清IFN-γ、TPOAb、TgAb均呈正相關(guān)(r=0.785,P<0.01;r=0.434,P=0.015;r=0.551,P<0.01),與血清IL-17、TSH無相關(guān)性(r=0.354,P=0.051;r=0.322,P=0.077)。見表3。

3　討論

生理?xiàng)l件下自身反應(yīng)性T細(xì)胞處于非活化狀態(tài)，無致病作用，但在特定條件下活化、增殖、聚集，最終引發(fā)自身免疫性損傷。在外周血中，自身反應(yīng)性T細(xì)胞在接觸抗原而被活化后，細(xì)胞膜表面的CD45RO表達(dá)增強(qiáng)，進(jìn)一步增強(qiáng)免疫反應(yīng)[6]。以往研究證實(shí)，自身反應(yīng)性T細(xì)胞的異常激活與HT發(fā)病密切相關(guān)，參與HT的發(fā)病過程[7-9]。激活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞可與CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞間相互轉(zhuǎn)化，反應(yīng)過后的自身反應(yīng)性T細(xì)胞大部分凋亡，少數(shù)轉(zhuǎn)化為CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞，由初始T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來和效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)化而來的CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞則長期存在于機(jī)體內(nèi)，當(dāng)再次接受抗原刺激時(shí)即刻發(fā)生強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，再次分化為激活的自身反應(yīng)性T細(xì)胞，推測CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞與自身反應(yīng)性T細(xì)胞間的相互轉(zhuǎn)化可能與HT的發(fā)病有關(guān)。目前尚無CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞與HT發(fā)病的相關(guān)報(bào)道。

本研究中，HT患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞的比例顯著高于對照組。我們的結(jié)果提示CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞可能參與了HT的發(fā)病。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞可通過分泌IFN-γ、IL-17加重自身反應(yīng)性T淋巴細(xì)胞的浸潤及加重局部炎癥反應(yīng)發(fā)揮其生物學(xué)作用[10，11]。IFN-γ、IL-17是目前公認(rèn)的在HT患者中升高且與病情嚴(yán)重程度相關(guān)的炎癥細(xì)胞因子[12，13]，我們的實(shí)驗(yàn)亦證明HT患者血清中IFN-γ、IL-17水平較對照組升高。進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，HT患者外周血中CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞比例與IFN-γ水平呈明顯正相關(guān)，進(jìn)一步提示CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞可能與HT的發(fā)病相關(guān)，其可能通過產(chǎn)生IFN-γ等細(xì)胞因子作用于HT的發(fā)病過程，且通過檢測HT患者外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞的比例可以反應(yīng)HT患者甲狀腺自身免疫性炎癥狀態(tài)從而提示病情變化趨勢。Taylor等[14]指出CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞的T細(xì)胞受體可以更快的產(chǎn)生細(xì)胞因子mRNA，故可更加迅速地發(fā)揮作用。

除了淋巴細(xì)胞浸潤，HT的另一個(gè)重要特點(diǎn)為可檢測出高濃度的甲狀腺自身抗體如TPOAb、TgAb，有學(xué)者稱這兩種抗體表明甲狀腺自身免疫性損害的嚴(yán)重性[15,16]。95%的HT患者TPOAb陽性，且與甲狀腺自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞浸潤的數(shù)量有很好的相關(guān)性，但是健康人中卻鮮有發(fā)現(xiàn)TPOAb陽性[17]，而且每年有4.3%TPOAb陽性的亞臨床患者進(jìn)展為甲減，而TPOAb陰性的亞臨床患者只有2.6%進(jìn)展為甲減，故TPOAb陽性被認(rèn)為預(yù)示著AITD患者日后可發(fā)生甲狀腺功能減退[18]，大約90%的HT患者中可發(fā)現(xiàn)高滴度的TgAb[19]，但是它在誘發(fā)HT中的作用尚不清楚。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)HT組中外周血CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞與TPOAb、TgAb均呈顯著正相關(guān)，亦提示CD4+CD45RO+記憶性T淋巴細(xì)胞可能參與HT的發(fā)病，并且CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞的升高可能有助于預(yù)測HT患者可能進(jìn)展為甲減。

4　結(jié)論

總之，本研究顯示CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞在HT患者中顯著升高，并與IFN-γ、TPOAb、TgAb的表達(dá)水平呈正相關(guān)，提示CD4+CD45RO+記憶性T細(xì)胞可能參與HT的發(fā)病過程。但是鑒于記憶性細(xì)胞和細(xì)胞因子在HT的發(fā)病過程中的多效性和網(wǎng)格性的特點(diǎn)，其具體機(jī)制仍需進(jìn)一步探討。

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[收稿2016-01-07修回2016-03-16]

(編輯許四平)

Expression and significance of CD4+CD45RO+memory T cell in peripheral blood of patients with Hashimoto′s thyroiditis

MA Qian-Qian，LIANG Qiu-Hua，SUN Lin，ZHANG Zheng-Jun，YU Shi-Peng.

Jining Medical University,Jining 272067,China

Objective:To explore the role CD4+CD45RO+memory T cells in the pathogenesis of Hashimoto′s thyroiditis (HT) by detecting the percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in peripheral blood mononuclear cells in peripheral blood of newly diagnosed HT patients.Methods: 53HT patients and 43 matched healthy controls (HC) were included in this study.According to the thyroid functions,HT patients were divided into euthyroid subset(HT-A,n =15) ,subclinical hypothyroidism(HT-B,n=14) and overt hypothyroidism subset (HT-C,n=24).The percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,as well as the level of serum IFN-γ and IL-17,and thyroid functions,and the titers of thyroid-specific autoantibodies (TPOAb,TgAb) were respectively detected by flow cytometry,ELISA,and ECLIA.Results: The percentages of CD4+CD45RO+memory T cells in PBMCs,as well as the level of serum IFN-γ and IL-17,the titers of TPOAb，TgAb were all significantly higher than that in HC(P<0.01).Bivariate correlation revealed that the percentages of CD4+CD45RO+memory T cells positively correlated with the level of serum IFN-γ,TPOAb and TgAb(P<0.01，P=0.015，P<0.01) in HT patients.Conclusion: The significant increase of CD4+CD45RO+memory T cells in peripheral blood of patients with HT suggested a role of CD4+CD45RO+memory T cells in the pathogenesis of this disease.

Hashimoto′s thyroiditis;Memory T cell;CD4+CD45RO+

10.3969/j.issn.1000-484X.2016.10.025

馬倩倩(1989年-) ，女，碩士，主要從事內(nèi)分泌與代謝病的研究，E-mail: MXQ-qianqian@163.com。

及指導(dǎo)教師：于世鵬(1963年-)，男，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事甲狀腺疾病方面的研究，E-mail: yushipengjn@163.com。

R581.4

A

1000-484X(2016)10-1527-05

①濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院兗州院區(qū)，濟(jì)寧272100。