孫麗慧， 王慶山， 趙淑艷， 修志龍

1. 大連理工大學(xué)食品與環(huán)境學(xué)院， 遼寧盤錦 124221；2. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 遼寧大連 116024

?

產(chǎn)共軛亞油酸菌株的篩選及其等離子體誘變

孫麗慧1， 王慶山1， 趙淑艷1， 修志龍2

1. 大連理工大學(xué)食品與環(huán)境學(xué)院， 遼寧盤錦 124221；2. 大連理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院， 遼寧大連 116024

本實驗從東北酸菜汁中篩選獲得了一株產(chǎn)共軛亞油酸能力較好的菌株SC-05，特別是氣相色譜分析結(jié)果表明，合成的CLA產(chǎn)物構(gòu)型為單一構(gòu)型，僅為c9, t11-18：2-CLA，經(jīng)鑒定該菌為乳桿菌屬Lactobacillussp.。菌株SC-05經(jīng)低溫等離子體處理后，篩選出突變株A-08，其共軛亞油酸產(chǎn)量達到119.24 μg/mL，比出發(fā)菌株增加了83.0%，且突變株A-08具有較好的遺傳穩(wěn)定性。

共軛亞油酸； 篩選； 乳桿菌屬； 等離子體誘變

共軛亞油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是一系列含有共軛雙鍵的十八碳脂肪酸的總稱[1]。CLA的立體異構(gòu)體多達幾十種，其中c9, t11-18：2和t10, c12-18：2兩種異構(gòu)體被認為最具有生物活性，如抗癌、抗動脈粥狀硬化和促進細胞分裂、阻止肌肉退化、延緩機體免疫力衰退等[2-4]，而且c9, t11-18：2是唯一能被動物細胞吸收進入磷脂層的異構(gòu)體[5]。

目前工業(yè)上普遍采用化學(xué)法合成CLA，如堿異構(gòu)化法、過渡金屬元素催化法和羥基脂肪酸脫水法等[6]。然而化學(xué)合成法雖然轉(zhuǎn)化率高、產(chǎn)量高，但是合成的產(chǎn)物是十幾種CLA異構(gòu)體的混合物，特別是其中的 t, t 異構(gòu)體對人體有害。相比而言，利用微生物合成CLA具有較好的選擇性，產(chǎn)物構(gòu)型多為c9, t11-18：2和t10, c12-18：2兩種異構(gòu)體的混合物，產(chǎn)品的安全性較高，因此近年來備受關(guān)注[7-9]。

本實驗從東北酸菜汁中篩選得到一株能夠合成CLA的微生物菌株，對產(chǎn)物采用氣相色譜法進行分析，結(jié)果表明產(chǎn)物構(gòu)型僅存在c9, t11-18：2-CLA，經(jīng)16S rDNA基因序列分析，確定該菌株為乳桿菌屬Lactobacillus，將其命名為Lactobacillussp. SC-05，并利用低溫等離子體對該菌株進行誘變，提高了CLA產(chǎn)量。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

Lactobacillussp. SC-05，由本實驗室從東北酸菜汁中分離得到。

1.1.2 培養(yǎng)基

增殖培養(yǎng)基(%)：牛肉膏 2，蛋白胨 2，酵母膏 1，葡萄糖 5，麥芽糖 2，調(diào)節(jié)pH至6.8。MRS液體培養(yǎng)基(%)：牛肉膏 1，蛋白胨 1，酵母膏 0.5，葡萄糖 2，乙酸鈉 0.5，磷酸氫二鉀 0.2，檸檬酸銨 0.2，硫酸鎂 0.02，硫酸錳 0.02，吐溫80 0.05，調(diào)節(jié)pH至6.8。MRS固體培養(yǎng)基(%)：在MRS液體培養(yǎng)基中加入瓊脂 1.5。平板篩選培養(yǎng)基(%)：在MRS固體培養(yǎng)基中加入溴甲酚紫 0.04。

1.1.3 主要試劑

亞油酸、共軛亞油酸、亞油酸甲酯、共軛亞油酸甲酯(c9, t11-CLAMe和t10, c12-CLAMe)標準品(純度≥99.9%)美國圣路易斯Sigma公司；亞油酸(純度≥95)，安慶市中創(chuàng)生物工程有限公司；酵母膏、牛肉膏、蛋白胨、瓊脂為生化試劑，北京奧博星生物技術(shù)公司；其它試劑為分析純。

1.2 菌株的分離與篩選

從酸奶、鮮牛奶、東北酸菜汁、四川泡菜汁、活性污泥浸出液中取樣適量，分別加入至增值活化培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h。采用梯度稀釋后將適宜濃度的菌懸液涂布于溴甲酚紫平板篩選培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h。分選出黃色菌圈較大的菌落并將其接種于MRS液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h。發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液用2倍體積正己烷萃取并用蒸餾水洗滌2次，無水硫酸鈉吸水干燥得到待測樣品，以未接入菌種且其他步驟和條件一致所得的正己烷萃取液為參比，利用紫外分光光度計測定波長在233 nm下吸光度，根據(jù)CLA-吸光度標準曲線方程求出CLA產(chǎn)量，篩選高產(chǎn)CLA菌株。

1.3 分析測定

產(chǎn)物的測定：將脫水后的脂肪酸萃取物加入體積分數(shù)3%的硫酸-甲醇溶液，70 ℃反應(yīng)2 h，再用2倍體積正己烷萃取脂肪酸甲酯，正己烷層水洗3次，無水硫酸鈉干燥，氮氣吹干，采用氣相色譜(Agilent 7890A)檢測；色譜條件如下：色譜柱：安捷倫HP-5MS毛細管柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；柱溫程序：100 ℃保持2 min，以10 ℃/min升至300 ℃，保持5 min；進樣量0.6 μL；分流比50∶1；進樣口溫度300 ℃。

菌株的鑒定：挑取培養(yǎng)基上的菌體于50 μL TaKaRa Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR(Code No.9164)中變性后離心取上清作為模板，反應(yīng)條件：80 ℃，15 min；然后使用TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit(Code No.RR176)進行PCR擴增目的片段；經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，切膠回收目的片段；由大連寶生物工程有限公司進行測序，在NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST檢索已有菌株的16S rDNA序列，用MEGA4.0軟件構(gòu)建進化樹。

1.4 低溫等離子體誘變

對篩選獲得的菌株SC-05采用多功能誘變系統(tǒng)(MPMS-MANDELA，北京偉恩思技術(shù)有限公司)進行低溫等離子體處理。首先將菌體培養(yǎng)至指數(shù)生長期，然后用無菌生理鹽水稀釋至OD600為1.0，吸取菌懸液15 μL均勻覆蓋于無菌皿槽底面，制成菌膜，然后用低溫等離子體誘變系統(tǒng)處理適當時間。誘變條件：載氣流量12 SLM(Standard liters per minute)，射頻功率100 W，處理距離5 mm，處理溫度為室溫。誘變處理后的載片用1.5 mL無菌生理鹽水徹底洗下菌體，經(jīng)適當稀釋后均勻涂布到MRS固體培養(yǎng)基平皿中，37 ℃培養(yǎng)48 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 CLA產(chǎn)生菌株的分離與篩選

按照1.2中的方法，從幾種樣品中分離純化菌株，共分離出78株菌株。利用紫外分光光度計測定發(fā)酵液樣品在波長233 nm下吸光度。經(jīng)過初篩，共獲得10株能夠轉(zhuǎn)化亞油酸生成CLA的菌株，采用搖瓶發(fā)酵對菌株進行復(fù)篩，并利用1.3中的氣相色譜的分析方法檢測發(fā)酵液中CLA的組成和含量，最終篩選獲得4株產(chǎn)CLA的能力較好的菌株，其中3株來自酸菜樣品(SC-05、SC-07、SC-13)，1株來自鮮牛乳樣品(XR-04)，其中菌株SC-05產(chǎn)CLA的能力最好，產(chǎn)量為65.16 μg/mL，特別是氣相色譜分析結(jié)果表明，SC-05合成的CLA產(chǎn)物構(gòu)型為單一構(gòu)型，僅為c9, t11-18：2-CLA。c9, t11-18：2是唯一能被動物細胞吸收進入磷脂層的異構(gòu)體，也是與人類和動物營養(yǎng)最為相關(guān)、最具有生物活性的異構(gòu)體[5]。而目前文獻報道的利用微生物合成CLA產(chǎn)物構(gòu)型多為c9, t11-18：2和t10, c12-18：2兩種異構(gòu)體的混合物[7,8,10-12]。利用生物合成法得到相對單一異構(gòu)體的 CLA，產(chǎn)品的安全性更高，其作用的保健功能和適用人群更有針對性，有著更為重要的研究價值和意義。因此，本實驗后續(xù)以菌株SC-05為進一步研究的對象。

2.2 細胞形態(tài)特征

溴甲酚紫MRS固體培養(yǎng)基菌落培養(yǎng)特征：菌落較小、凸起、呈圓形、邊緣整齊、濕潤光滑、黃色不透明(圖1a所示)。光學(xué)顯微鏡下觀察細胞形態(tài)特征：細胞呈桿狀，單個、成對或成鏈狀，G+(圖1b所示)。

圖1a SC-05菌落照片

圖1b SC-05菌株顯微鏡照片(1 000×)

2.3 菌種鑒定

測序結(jié)果表明，菌株SC-05的16S rDNA全長為1 451 bp，該序列已提交至Genbank，登記號為No. KT159284。將該序列與Genbank中相關(guān)數(shù)據(jù)進行相似性分析，用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)?；?6S rDNA序列分析和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹分析可以看出，菌株SC-05與乳桿菌屬Lactobacillus親緣關(guān)系較近，序列相似性達到99%。

圖2 基于16S rDNA全序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 低溫等離子體誘變選育

2.4.1 低溫等離子體處理存活曲線的測定

按照1.4的方法對菌株SC-05進行低溫等離子體處理，以時間為變量，測定其存活曲線，結(jié)果如圖3所示。當處理時間在80 s之前菌體存活率一直在下降，90 s、100 s時存活率出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，100 s之后存活率再次下降，整個存活曲線呈現(xiàn)先降后升再降的“馬鞍型”曲線變化，這與文獻報道的現(xiàn)象一致[13,14]?！榜R鞍型”曲線產(chǎn)生的機理可能是由于等離子體中的大量自由基和射線對胞內(nèi)蛋白和核酸產(chǎn)生破壞作用，從而導(dǎo)致細菌逐漸死亡，但當存活率下降到一定程度時，細菌機體啟動自身的修復(fù)機制，如SOS系統(tǒng)，導(dǎo)致存活率回升，隨著等離子體的繼續(xù)作用，其破壞作用超過細胞的自身修復(fù)速率，存活率再次下降，直至存活率為零[14-16]。通常理論認為當致死率為70%～80%時最有利于菌株發(fā)生較大的正突變率，因此確定30 s作為最佳誘變時間。

圖3 植物乳桿菌SC-05在等離子體處理不同

2.4.2 共軛亞油酸高產(chǎn)菌株的篩選

共挑取SC-05的誘變單菌落60個分別進行發(fā)酵轉(zhuǎn)化實驗，結(jié)果出現(xiàn)正突變的菌株有23株，其中A-08、A-22、B-06和B-11四個菌株的正突變幅度大于20%，如圖4所示，共軛亞油酸產(chǎn)量最高的突變株是A-08，其產(chǎn)量達到119.24 μg/mL，比出發(fā)菌株增加了83.0%。

圖4 正突變菌株產(chǎn)量

2.4.3 突變株A-08遺傳穩(wěn)定性實驗

誘變選育的突變菌株在連續(xù)傳代過程中可能會出現(xiàn)遺傳不穩(wěn)定的現(xiàn)象[17]。為考察突變株A-08的遺傳穩(wěn)定性，對菌株進行12代傳代培養(yǎng)，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，突變株A-08具有較高的遺傳穩(wěn)定性。

圖5 突變株A-08的遺傳穩(wěn)定性

3 結(jié)論

本實驗從東北酸菜汁中篩選獲得1株產(chǎn)CLA能力較好的菌株SC-05，特別是GC結(jié)果表明，SC-05合成的CLA產(chǎn)物構(gòu)型為單一構(gòu)型，僅為c9, t11-18:2-CLA。利用生物合成法得到相對單一異構(gòu)體的 CLA，產(chǎn)品的安全性更高，其作用的保健功能和適用人群更有針對性。通過對其16S rDNA序列測序及分析，發(fā)現(xiàn)與乳桿菌屬Lactobacillus親緣關(guān)系較近，序列相似性達到99%。菌株SC-05經(jīng)低溫等離子體處理后，篩選出突變株A-08，其共軛亞油酸產(chǎn)量達到119.24 μg/mL，比出發(fā)菌株增加了83.0%，且突變株A-08具有較好的遺傳穩(wěn)定性。該菌株可以通過進一步菌種選育及經(jīng)過發(fā)酵工藝優(yōu)化，預(yù)計共軛亞油酸產(chǎn)量會有較大的提升潛力。

[1] Irmak S, Dunford NT, Gilliland SE,etal. Biocatalysis of linoleic acid to conjugated linoleic acid [J]. Lipids, 2006, 41 (8): 771-776.

[2] Whigham LD, Cook ME, Atkinson RL. Conjugated linoleic acid: implications for human health [J]. Pharmacological Research, 2000, 42 (6): 503-510.

[3] Zhao HW, Lv JP, Li SR. Production of conjugated linoleic acid by whole-cell ofLactobacillusplantarumA6-1 [J]. Biotechnology and Biotechnological Equipment, 2011, 25(1):2266-2272.

[4] 熊向峰, 陳朝銀, 趙聲蘭. 亞油酸異構(gòu)酶及其性質(zhì) [J]. 工業(yè)微生物, 2002, 32(4):51-58.

[5] 陳杭君, 陳麗敏, 郜海燕等. 共軛亞油酸的制備、純化及檢測方法研究進展 [J]. 中國食品學(xué)報, 2012, 12(5):137-143.

[6] Paiza MW, Yang XY. Method of production conjugated fatty acids [P]. US, 5856149. 1999-01.

[7] Wang LM, Lv JP, Chu ZQ,etal. Production of conjugated linoleic acid byPropionibacteriumfreudenreichii[J]. Food Chemistry, 2007, 103: 313-318.

[8] Lara G, Katleen R, Stefan W,etal. Production of conjugated linoleic acid and conjugated linolenic acid isomers byBifidobacteriumspecies [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 87: 2257-2266.

[9] 張中義, 胡錦蓉, 劉萍等. 一株產(chǎn)共軛亞油酸乳酸菌的鑒定及其特性 [J]. 工業(yè)微生物, 2004, 34(2):5-9.

[10] Ogawa J, Kishino S, Ando A,etal. Production of conjugated fatty acids by lactic acid bacteria [J]. Journal of Bioscience and Bioengineering. 2005, 100(4): 355-364.

[11] 陳海琴, 許慶炎, 葉強等. 植物乳桿菌 ZS2058 生物轉(zhuǎn)化共軛亞油酸的反應(yīng)動力[J]. 微生物學(xué)報, 2009, 49 (2) : 174-179.

[12] 許慶炎，陳衛(wèi)，陳海琴等. 植物乳桿菌 ZS2058 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物共軛亞油酸的分析方法的研究 [J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2008, 34(1): 110-115.

[13] Montie TC, Wintenberg KK, Roth JR. An overview of research using the one atmosphere glow discharge plasma for sterilization of surfaces and materials [J]. IEEE Transactions on Plasma Science, 2000, 28(1): 41-50.

[14] 董曉宇, 李爽, 侯英敏等. 大氣壓冷等離子體誘變產(chǎn)1,3-丙二醇菌株Klebsiellapneumoniae[J].過程工程學(xué)報, 2008,8(3):555-560.

[15] 宋道軍, 姚建銘, 邵春林等. 離子注入微生物產(chǎn)生“馬鞍型”存活曲線的可能作用機制 [J]. 核技術(shù), 1999, 22(3): 129-132.

[16] 沈萍, 陳向東. 微生物學(xué)(第2版) [B]. 北京: 高等教育出版社, 2006. pp223.

[17] Li HG, Luo W, Wang Q,etal. Direct fermentation of gelatinized cassava starch to acetone, butanol, and ethanol usingClostridiumacetobutylicummutant obtained by atmospheric and room temperature plasma [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2014, 172(7): 3330-3341.

SUN Li-hui1*, WANG Qing-shan1, ZHAO Shu-yan1, XIU Zhi-long2

1. School of Food and Environment, Dalian University of Technology, Panjin 124221, China；2. School of Life Science and Biotechnology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China

Screening and plasma mutagenesis of conjugated linoleic acid high-producing strain

The strain SC-05 with the ability of synthesize conjugated linoleic acid (CLA) was isolated from sauerkraut juice samples. According to gas chromatography analysis, c9, t11-CLA was the only product in the fermentation broth. This strain was identified asLactobacillussp., based on full-length 16S rDNA. The strain SC-05 was induced by low temperature plasma, and the mutant strain A-08 was obtained. The results revealed that the CLA production by the mutant strain A-08 could reach 119.24 μg/mL, raised 83.0% compared with that by the original strain. And the mutant strain A-08 also exhibited its good genetic stability.

conjugated linoleic acid; screening;Lactobacillus; plasma mutagenesis

大連理工大學(xué)基本科研業(yè)務(wù)費專項項目(DUT16QY31)。

孫麗慧(1977～)，女，博士，副教授。Email：sunlihui@dlut.edu.cn。