L-絲氨酸檢測技術的研究進展

李忠財， 董會娜， 張大偉*， 叢麗娜

1.大連工業(yè)大學生物工程學院，大連 116034

2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

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L-絲氨酸檢測技術的研究進展

李忠財1,2， 董會娜2， 張大偉2*， 叢麗娜1*

1.大連工業(yè)大學生物工程學院，大連 116034

2.中國科學院天津工業(yè)生物技術研究所，天津 300308

L-絲氨酸作為一種非必需氨基酸，它在藥物、化工產品以及食品等方面得到了廣泛應用，是一種重要的工業(yè)產物，具有很重要的研究價值?？焖?、準確、高通量的檢測L-絲氨酸含量的方法，能夠為高通量菌種選育提供堅實的基礎。本文介紹了目前檢測L-絲氨酸含量的多種方法，包括變色酸-分光光度法、紙層析-分光光度法、熒光猝滅法、茚三酮顯色法、高效液相色譜法、酶反應檢測法及毛細管電泳-電致化學發(fā)光(CE-ECL)法，同時通過比較它們的優(yōu)缺點，并針對L-絲氨酸檢測中存在的各種問題進行討論分析，對L-絲氨酸的檢測技術進行展望。

L-絲氨酸； 檢測技術； 氨基酸

L-絲氨酸屬于一種非必需氨基酸，它是參與合成胞內生物物質嘌呤、嘧啶、磷脂等的重要前體[1-3]。在醫(yī)藥方面L-絲氨酸廣泛應用于氨基酸輸液和營養(yǎng)添加劑，它的衍生劑也具有優(yōu)良的藥用和生物活性[4]。此外，因L-絲氨酸具有特殊的潤濕性和保濕性，在國內外被大量用于高級化妝品中[5]。隨著對L-絲氨酸研究的深入認識和醫(yī)藥保健事業(yè)的不斷發(fā)展，人們對L-絲氨酸的需求量正迅速擴大。因此一種快速簡便測定混合氨基酸中L-絲氨酸的含量的檢測方法對L-絲氨酸的開發(fā)利用具有重要意義。

近些年，隨著分析儀器的更新?lián)Q代以及對絲氨酸的深入研究，使得絲氨酸分析檢測方法的準確度和精密度都有了大幅度的提高。目前檢測絲氨酸的方法主要有：變色酸-分光光度法、紙層析-分光光度法、熒光猝滅法、茚三酮顯色法、高效液相色譜法以及酶反應檢測法等。

1 變色酸-分光光度法

變色酸-分光光度法的原理是在一定的pH條件下，絲氨酸碳鏈末端的-OH能被高碘酸鈉氧化成醛，這種醛又能與變色酸發(fā)生反應，呈現紫色，在570 nm處有最大吸收值[6, 7]，如圖1。該方法操作方便、所用儀器較簡單、成本較低、顯色靈敏、檢出限低，且在復雜的氨基酸混合物中檢測絲氨酸不會受到干擾。但該方法中的吸光度易受到如加熱時間、顯色劑用量和有色化合物穩(wěn)定性等方面的影響，從而影響檢測絲氨酸的準確性。周圓圓等[8]研究了變色酸法分光光度法檢測絲氨酸的分析方法，最終確定在變色酸2.0 mL，波長位于570 nm處，經過30 min的沸水浴顯色，能夠得到最好的顯色效果。同時通過樣品回收率實驗驗證表明：變色酸-分光光度法回收率均在100%左右，平均回收率為100.30%，相對標準偏差(RSD)為1.11%，進一步表明該方法極少受到樣品中其他混合氨基酸的干擾，具有很好的重復性和準確性。

圖1 絲氨酸與變色酸的顯色反應

變色酸-分光光度法方法使得絲氨酸的檢測操作方便，所用儀器較簡單、成本較低、顯色靈敏穩(wěn)定，檢出限低，易于掌握且在復雜的氨基酸混合物中, 沒有受到干擾可提高測量結果準確度的優(yōu)點，故可應用于準確測定混合氨基酸中絲氨酸含量。但是，絲氨酸與變色酸反應結束后在10 min內是比較穩(wěn)定的，因此我們需要注意反應產物應當盡快測量。

2 紙層析-分光光度法

紙層析法是分離、鑒定氨基酸混合物的常用技術，可用于多種氨基酸成分的定性鑒定和定量測定。其原理是用濾紙作為惰性支持物，濾紙纖維素上吸附的水或其它在層析過程中不流動的溶劑是固定相，展層用的有機溶劑是流動相。在層析時，樣品隨流動相沿濾紙的一個方向進行展層，由于不同氨基酸在兩相溶劑中的分配系數(Kd)不同，不同組分會以不同的速度移動，從而使得它們分布在濾紙的不同位置上，最終達到分離[9]。物質被分離后在紙層析圖譜上的位置可用比移值Rf(rate of flow，樣品起始點至氨基酸停留點中心的距離與起始點至溶劑前沿的距離的比值)來表示。根據各種氨基酸的Rf不同以及它們與顯色劑顯色后顏色的差別，達到對氨基酸進行定性鑒定和定量測定[10]。紙層析-分光光度法具有準確度高、重復性好、操作簡單、易于掌握等特點。王薇等[11]經重復性、干擾以及穩(wěn)定性實驗驗證表明，該方法平均回收率為100.48%，RSD為1.74%，進一步表明該方法具有很好的重復性和準確性。但是，此方法的不足之處是反應產物如放置長時間(超過10 min)后，測定絲氨酸質量濃度的RSD會顯著增加，測定結果與實際結果偏離較大[11, 12]。

用紙層析-分光光度法測定L-絲氨酸含量具有較高的準確度和精密度。線性相關顯著，而且操作方便、易于掌握，所用儀器較簡單，具有一次性處理量大(通量高)的優(yōu)點，在L-絲氨酸產生菌篩選和條件優(yōu)化中非常適用。

3 熒光猝滅法

熒光猝滅法檢測絲氨酸是通過磷?；z氨酸水解產生無機磷酸鹽猝滅鋱離子-鈦鐵試劑絡合物(Tb3+-TR)熒光探針的間接熒光法測定磷?；z氨酸的一種方法[13]。該方法利用鋱離子-鈦鐵試劑絡合物(Tb3+-TR)熒光探針監(jiān)測了磷?；z氨酸(P-Ser)、磷?；K氨酸(P-Thr)和磷?；野彼?P-Tyr)在一定條件下的完全水解，并通過磷酰化氨基酸水解產生的無機磷酸鹽猝滅Tb-TR絡合物熒光探針的熒光可間接測定磷?；z氨基酸(P-絲氨酸)。因此可采取預先水解磷?；被幔ㄟ^測定水解產生的磷酸鹽間接測定磷?；z氨基酸的含量。這種方法多用于蛋白質中氨基酸的測定。由于在真核生物細胞蛋白質中的絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸的磷酸酯化是最常見的磷?；愋蚚14-16]，所以可以用熒光猝滅法來檢測磷?；被釓亩梢宰C實很多蛋白的重要作用[13]。隨著科學技術的不斷發(fā)展，許多因素的加入及簡化使得熒光猝滅法不斷優(yōu)化。

4 茚三酮顯色法

茚三酮顯色法原理是在弱酸性條件下，α-氨基酸與茚三酮中共熱，反應后生成氨基茚三酮，再與水合茚三酮反應生成紫紅色或藍色物質，如圖2。絲氨酸與茚三酮在弱酸條件下反應會生成紫紅色物質[17, 18]，此反應十分靈敏，根據反應生成物質顏色的深淺，在570 nm下進行比色就可以測定樣品中絲氨酸的含量[19]。這種顯色反應產物主要是通過縮合反應形成，與羰基化合物和氨的衍生物之間的反應類似[20]，反應中pH，溫度，反應時間以及顯色劑用量的改變均會使產物顏色不穩(wěn)定，對準確測定氨基酸含量的結果造成一定的影響。有研究表明：利用茚三酮比色法定性定量檢測絲氨酸的最佳實驗條件為溶液pH在4.5左右，顯色劑用量為每10 mL展層劑中加入2.5 mL 0.1%的茚三酮，并在105 ℃下干燥加熱5 min[30]。所以絲氨酸所處的環(huán)境不同，測定條件也會發(fā)生改變。

近些年茚三酮法與層析法的結合，提高了層析分離的效果，使圖譜顯色均勻，色斑清晰。不僅省略了顯色液及喉頭噴霧器，節(jié)省了儀器設備，簡化了操作步驟，而且還節(jié)約了時間，使操作更簡便、易行，同時也將顯色劑茚三酮的濃度降為0.1%，節(jié)省了試劑[21]。

圖2 α-氨基酸與茚三酮的顯色反應

5 高效液相色譜法

高效液相色譜法(High Performance Liquid Chromatograph，HPLC)是目前氨基酸分析領域應用最廣、發(fā)展最快的現代分析技術之一，它是在經典液相色譜法的基礎上，引入氣相色譜法的理論和技術，以高壓輸送流動相，采用高效固定相及高靈敏度檢測器發(fā)展而成的現代液相色譜分析方法，具有分離分析速度快，靈敏度高、選擇性好，可分析微量組成樣品等特點[22]。利用HPLC方法分析氨基酸的過程主要是：首先，將氨基酸轉化為具有熒光的氨基酸衍生物；其次，將傳統(tǒng)的茚三酮反應用熒光監(jiān)測器代替來鑒定氨基酸。這樣不僅可以進一步縮短分析時間，顯著性提高靈敏度，而且能夠更好地發(fā)揮高效液相色譜地特點。

目前已報道的柱前衍生試劑很多，常用的含有鄰苯二甲醛、丹酰氯、氯甲酸芴甲酯、異硫氰酸苯酯等。隨著研究工作的深入，柱前衍生結合 HPLC 法已成為氨基酸分離和分析的重要手段[23,24]。

在HPLC方法當中流動相的選擇，流動相pH的選擇以及衍生時間的控制都非常重要。如果流動相pH太低，保留時間較長，峰面積會減小，靈敏度會降低；反之，隨pH的增大，保留時間縮短，峰面積增大。同時衍生時間也可以很大程度上影響對氨基酸的峰面積，如果衍生時間太短，反應不完全，濃度與峰面積的線性不好；反之，衍生時間太長，氨基酸與衍生劑形成的化合物極易降解，也會導致上述問題。因此根據具體的測量物質要進行適當的更改。

6 酶反應檢測

目前對利用酶法檢測絲氨酸的報道還不是很多。Toyokazu[25]等研究了在甲基營養(yǎng)生物中L-絲氨酸和乙醛酸的酶促反應檢測方法。主要由兩步反應組成，第一步反應是L-絲氨酸和乙醛酸鹽在絲氨酸氨基轉移酶(SGAT)作用下反應生成羥基丙酮酸和甘氨酸，第二步反應是羥基丙酮酸與NADH在羥基丙酮酸還原酶催化下反應，最后通過檢測NADH的下降量間接的來確定L-絲氨酸的含量，如圖4。Roger D. Hurst等研究了通過把L-絲氨酸在PBST、L-磷酸絲氨酸轉氨酶和D-3-磷酸脫氫酶的作用下轉換成L-磷酸絲氨酸，用分光光度法或者熒光光度法檢測L-絲氨酸[26]。酶反應方法對于檢測L-絲氨酸的優(yōu)點是快速，專屬性好，精確性好。

L-serine+glyoxylate→hydroxypuyuvate+glycine

hydroxypyruvate+NADH→D-glycerate+NAD+

圖3 L-絲氨酸和乙醛酸的酶反應原理

7 毛細管電泳-電致化學發(fā)光法

毛細管電泳(CE)是將毛細管看為分離的通道，以高壓的直流電場作為驅動力的一種新型分離及分析的技術，使分析化學這門學科得以從微升的水平發(fā)展到納升的水平，并使單細胞，乃至單分子的研究成為很大的可能。毛細管電泳具有檢出限低，進樣量少等優(yōu)點[27-29]，由于內徑狹窄也給檢測帶來了困難。因此，為了提高靈敏度，很多學者在不斷研究的過程中開辟了新領域。將電致化學發(fā)光( ECL) 檢測方法與 CE 技術聯(lián)用，可形成一種同時具備高效分離與高靈敏檢測的新方法[30-31]。ECL 檢測是在化學發(fā)光和電化學基礎上發(fā)展起來的一種新的分析技術。ECL不但保留了化學發(fā)光分析和電化學分析固有的優(yōu)點，同時還具有其自身的優(yōu)點，如所發(fā)生的化學發(fā)光反應易于控制、方法更靈敏、擴大了化學發(fā)光方法可檢測的范圍，更易于與現代分離技術聯(lián)用。

李靖等[32]在化學修飾電極研究的基礎上，將毛細管電泳-電致化學發(fā)光(CE-ECL)與化學修飾電結合，對L-絲氨酸進行分離檢測，并優(yōu)化了影響電致化學發(fā)光的各種因素如檢測電位，不同的發(fā)光試劑，緩沖溶液 pH，檢測電壓等。證明該方法具有操作簡便、所需試劑量少、檢測快速等特點。

8 小結

目前，國內外用于L-絲氨酸檢測的方法主要包括高效液相色譜法、茚三酮法、熒光淬滅法，酶反應法、紙層析-分光光度法等。其中高效液相色譜法其靈敏度好，準確度高，常用于L-絲氨酸的定量測定。茚三酮顯色法作為最基本最傳統(tǒng)的檢測方法，其操作簡便、反應快速，但是其對反應條件的要求較高，需要對反應溫度、pH、時間進行精確控制，并且對不同種類的氨基酸具有不同的靈敏度，不適合分析對精確性要求較高的樣品。熒光猝滅法可以避免大部分氨基酸的干擾，但是樣品需要經過復雜的磷?；A處理，并且檢測結果誤差較大。酶反應法具有良好的專屬性和精準性，但是其反應速度過慢，反應體系中所用酶的純化步驟復雜，儲存條件限制多。紙層析-分光光度法操作簡便，適用于菌株篩選中氨基酸的定性檢測，但是其穩(wěn)定性差，不適用大批量樣品的分析檢測。變色酸-分光光度法反應速度快，操作簡單，準確度高。準確、快速、高通量的檢測方法均可用于大量樣品的發(fā)酵液中L-絲氨酸的定量檢測。

近年來，對L-絲氨酸檢測分析的方法不斷發(fā)展，但是應用最為廣泛的仍然是高效液相法，這種技術可以精確定量L-絲氨酸含量，是目前L-絲氨酸定量檢測應用最廣泛的方法。一些快速簡便的L-絲氨酸檢測方法不斷出現或改良，如紙層析-分光光度法、變色酸-分光光度法等，雖然這些檢測方法的快速性得到很大提升但是精確性仍然不盡如人意。隨著社會和科學的發(fā)展，對于快速、準確、高通量的L-絲氨酸檢測方法需求越來越多，檢測設備的更新以及科學家對L-絲氨酸更全面深入的研究會使L-絲氨酸檢測方法在快速、準確、高通量方面有大幅度的提高。

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LI Zhong-cai1,2, DONG Hui-na2, ZHANG Da-wei2, CONG Li-na1

1. School of Biological Engineering,Dalian Polytechnic University,Dalian 116034,China 2. Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China

Development of analytical methods for L-serine

L-serine, as one of the nonessential amino acids， is an important industrial product with research value, widely used in medicine, chemical products and foods. As fast, accurate and high-throughput method for detecting L-serine concentration could lay the foundation for high-throughput screening of L-serine producing strains, various kinds of methods for detecting the concentration of L-serine were mainly introduced, including chromotropic acidspectrophotometry, paper chromatogram physpectrophotometer, fluorescence quenching method, ninhydrin coloration method, high-performance liquid chromatography, enzymatic assays method and CE-ECL. Moreover, the advantages and disadvantages of these methods were compared and discussed. And the development of analytical methods for L-serine was forecasted.

L-serine; analytical methods; amino acid

國家自然基金(31370089)，天津市科技支撐計劃重點項目(14ZCZDSY00065)，天津市自然科學基金(16JCYBJC23500，15JCQNJC09500)。

李忠財(1989～)，男，碩士研究生。E-mail:li_zhc@tib.cas.cn。

*通訊作者: 叢麗娜(1962～)，女，教授。E-mail:linacong@163.com；張大偉(1978～)，男，研究員。E-mail:zhang_dw@tib.cas.cn。