王隆洋，閔偉紅*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

利用生物技術(shù)生產(chǎn)甲硫氨酸的研究進(jìn)展

王隆洋，閔偉紅*

（吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，小麥和玉米深加工國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130118）

甲硫氨酸廣泛應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域，其市場(chǎng)需求量逐年增長(zhǎng)?，F(xiàn)行的化學(xué)合成甲硫氨酸產(chǎn)物為外消旋混合物，且對(duì)環(huán)境污染嚴(yán)重，與生物技術(shù)生產(chǎn)甲硫氨酸相比，不具備可持續(xù)性。生物技術(shù)生產(chǎn)甲硫氨酸可分為微生物發(fā)酵法和酶法。科研人員一直嘗試闡明甲硫氨酸生物合成途徑并進(jìn)行高產(chǎn)菌株的選育，但由于其合成途徑復(fù)雜，尚未獲得適用于工業(yè)生產(chǎn)的菌株。對(duì)于現(xiàn)有菌株，深入研究甲硫氨酸生物合成途徑、擴(kuò)大甲硫氨酸向胞外的輸出量、對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)基組分及工藝條件進(jìn)行優(yōu)化都是有效提高甲硫氨酸產(chǎn)量的途徑。酶法生產(chǎn)甲硫氨酸可分為異構(gòu)體拆分和化合物酶解，其中利用微生物酶實(shí)現(xiàn)D型向L型的轉(zhuǎn)化更有助于增加L-甲硫氨酸得率；最新的化合物酶解法結(jié)合了基因工程及酶的固定化技術(shù)，在實(shí)際生產(chǎn)中也具有巨大潛力。本文總結(jié)了國(guó)內(nèi)外甲硫氨酸生產(chǎn)近況，重點(diǎn)論述了微生物發(fā)酵法、酶法及二者相結(jié)合生產(chǎn)甲硫氨酸的最新研究進(jìn)展，并針對(duì)甲硫氨酸的發(fā)酵生產(chǎn)特點(diǎn)，提出變構(gòu)抑制的解除、復(fù)合硫源的應(yīng)用及關(guān)鍵酶的穩(wěn)定性三方面的問(wèn)題及建議。鼓勵(lì)將酶法與發(fā)酵法相結(jié)合，并提倡通過(guò)酶解植物蛋白獲得甲硫氨酸的研究，以實(shí)現(xiàn)低成本、低污染、高產(chǎn)量、高純度的甲硫氨酸生產(chǎn)。

甲硫氨酸；生物技術(shù)；微生物發(fā)酵；酶法生產(chǎn)；異構(gòu)體拆分；化合物酶解

甲硫氨酸（methionine），又名蛋氨酸，是唯一含硫的非極性α-氨基酸，1922年由Mueller首次從酪蛋白中分離出來(lái)，被認(rèn)為是α-氨基-N-丁酸的γ-甲硫基衍生物，是一種重要的必需氨基酸，與蘇氨酸、賴(lài)氨酸等同屬于天冬氨酸家族[1]。

甲硫氨酸在堅(jiān)果、肉類(lèi)及部分植物中大量存在，而在動(dòng)物和人體內(nèi)卻不能自行合成。其對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)的重要作用及缺乏而產(chǎn)生的不良后果已經(jīng)被證實(shí)，如導(dǎo)致家禽蛋殼硬度下降及奶牛產(chǎn)奶品質(zhì)降低[2]；人類(lèi)毒血癥、肌肉麻痹、精神分裂及發(fā)育不良等[3]。因此，其作為一種飼料、食品和保健品的重要添加成分，有著廣闊的市場(chǎng)前景。

甲硫氨酸有D型和L型兩種存在形式，均具有生物活性[4]，但部分人群對(duì)D-甲硫氨酸有過(guò)敏反應(yīng)，因此L-甲硫氨酸成為較理想的含硫氨基酸資源[5]，可安全地應(yīng)用于電解質(zhì)平衡，腸外營(yíng)養(yǎng)和藥用輔料等治療多種疾病。醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)Ω呒兌鹊腖-甲硫氨酸需求量亦十分可觀。

在生物技術(shù)的發(fā)展中，甲硫氨酸不僅被用作蛋白質(zhì)合成的底物，也是諸多活性物質(zhì)S-腺苷甲硫氨酸、肉毒堿、牛磺酸、卵磷脂、磷脂酰膽堿和其他磷脂生物合成的中間體[6]。如S-腺苷甲硫氨酸可作為甲基供體及細(xì)胞內(nèi)小分子活性物質(zhì)參與細(xì)胞反應(yīng)[7]。近年來(lái)，隨著對(duì)S-腺苷甲硫氨酸的研究不斷深入[8-11]，其前體甲硫氨酸在分子生物學(xué)中也具有重要的地位和研究?jī)r(jià)值。

甲硫氨酸生產(chǎn)與其他氨基酸存在本質(zhì)差別。目前市場(chǎng)上其他氨基酸均可通過(guò)微生物發(fā)酵生產(chǎn)，產(chǎn)量可達(dá)到理論值的25%～75%，而甲硫氨酸的實(shí)際發(fā)酵產(chǎn)量不及其理論值的10%[12]。因此，全球甲硫氨酸生產(chǎn)多采用化學(xué)合成法，主要有丙二酸酯法、固-液相轉(zhuǎn)移催化法、氨基內(nèi)酯法和丙烯醛法等，其產(chǎn)物為D型和L型外消旋混合物。其中丙烯醛法因原材料較廉價(jià)、工藝路線(xiàn)簡(jiǎn)單、能耗低、收率高，被幾大主要跨國(guó)公司采用。但該生產(chǎn)過(guò)程需要丙烯醛、氨水和氰化物等危險(xiǎn)化學(xué)品，其廢液嚴(yán)重污染環(huán)境。2015年，San ders等[6]對(duì)甲硫氨酸石化生產(chǎn)路線(xiàn)與生物質(zhì)合成路線(xiàn)進(jìn)行比較，證明了生物合成的可持續(xù)性。多年來(lái)，科學(xué)工作者一直探索利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸，由于其合成途徑調(diào)控過(guò)于復(fù)雜[13]，目前還沒(méi)有適用于甲硫氨酸的工業(yè)生產(chǎn)菌株。

甲硫氨酸是繼谷氨酸之后產(chǎn)量第二大的氨基酸，2011年，針對(duì)動(dòng)物飼料的甲硫氨酸市場(chǎng)年銷(xiāo)售額約28.5 億美元，銷(xiāo)量85 萬(wàn)t，年增長(zhǎng)率5%。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，2014年全球甲硫氨酸需求量約100 萬(wàn)t，呈逐年增長(zhǎng)趨勢(shì)。目前甲硫氨酸三大主要生產(chǎn)商為贏創(chuàng)（原德固賽）公司、安迪蘇（原普朗克）公司和日本曹達(dá)（原孟山都）公司[6]。

2006年，中國(guó)藍(lán)星有限公司收購(gòu)安迪蘇子公司，并于2010年在江蘇南京開(kāi)始建廠，將最初年產(chǎn)能7 萬(wàn)t的計(jì)劃翻倍至14 萬(wàn)t。該廠的建成投產(chǎn)將結(jié)束中國(guó)重要?jiǎng)游镲暳咸砑觿┩耆蕾?lài)進(jìn)口的局勢(shì)。贏創(chuàng)公司2011年12月決議，在新加坡建立產(chǎn)能15萬(wàn)t的甲硫氨酸加工廠，將在2014年第三季度投入生產(chǎn)。韓國(guó)杰希公司和法國(guó)阿科瑪公司于2012年宣布將在東南亞建立產(chǎn)能8 萬(wàn)t的甲硫氨酸加工廠，該廠將采用全新的發(fā)酵-化學(xué)法聯(lián)合生產(chǎn)線(xiàn)。德國(guó)巴斯夫公司雖然于2007年申請(qǐng)了發(fā)酵生產(chǎn)甲硫氨酸的專(zhuān)利，但至今仍不適用于商業(yè)生產(chǎn)。法國(guó)邁陀保利克公司和羅蓋特公司合作致力于L-甲硫氨酸發(fā)酵產(chǎn)品的研發(fā)[6]。

1 生物技術(shù)生產(chǎn)甲硫氨酸研究進(jìn)展

1.1 微生物發(fā)酵路線(xiàn)的相關(guān)研究

1.1.1 甲硫氨酸生物合成途徑的研究

為構(gòu)建甲硫氨酸生產(chǎn)菌，首先需要了解甲硫氨酸的生物合成途徑，其中最基本的氨基酸生產(chǎn)菌——大腸桿菌（Escherichia coli）和谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)。

細(xì)菌中甲硫氨酸合成途徑以天冬氨酸為起點(diǎn)，經(jīng)天冬氨酸激酶（aspartokinase，AK）和高絲氨酸脫氫酶（homoserine dehydrogenase，HSD）兩個(gè)限速酶催化，生成高絲氨酸，進(jìn)而分別合成蘇氨酸和甲硫氨酸。甲硫氨酸合成存在兩個(gè)途徑：巰基轉(zhuǎn)移途徑以胱硫醚為中間體，以半胱氨酸為硫源，而直接巰基化途徑則可利用無(wú)機(jī)硫源。大腸桿菌只通過(guò)巰基轉(zhuǎn)移途徑合成甲硫氨酸，谷氨酸棒桿菌可同時(shí)利用兩個(gè)途徑（圖1）。

圖1 細(xì)菌中甲硫氨酸合成途徑[1]Fig.1 Biosynthetic pathway of methionine in bacteria[1]

2002年Hwang等[14]在谷氨酸棒桿菌中發(fā)現(xiàn)了甲硫氨酸生物合成的直接巰基化途徑，并對(duì)metY或metB進(jìn)行突變，比較突變株生長(zhǎng)參數(shù)。兩種酶在序列上存在相似性，但微生物優(yōu)先選擇巰基轉(zhuǎn)移途徑。因此它們?cè)谶M(jìn)化上可能來(lái)自同一種酶，而MetY是長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中突變和自然選擇的結(jié)果，存在受甲硫氨酸反饋抑制、與底物親和性低的缺陷。2007年，該課題組[15]對(duì)MetB和MetY進(jìn)行純化，比較了二者的生化參數(shù)。發(fā)現(xiàn)MetB和MetY對(duì)O-乙酰高絲氨酸催化作用的Km值分別為3.9 mmol/L和6.4 mmol/L，與之前的推測(cè)吻合。同時(shí)，MetY對(duì)硫化物離子的Km也過(guò)高，證明其與硫化物離子的結(jié)合也很微弱，溫度和pH值耐受性也較MetB差。至此，MetY存在的生理意義和利用價(jià)值尚不明晰。

2006年，Kr?mer等[16]在對(duì)大腸桿菌和谷氨酸棒桿菌甲硫氨酸代謝途徑進(jìn)行計(jì)算機(jī)模擬分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，以甲硫醇為硫源時(shí)，還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）的消耗減少，可使甲硫氨酸理論產(chǎn)量得到提高。以甲硫醇或其二聚體二甲基二硫?yàn)榱蛟吹脑硎菍⑵洹猄—CH3基團(tuán)完整地插入甲硫氨酸的R基而直接生成甲硫氨酸。這一理論在2010年被Bolten等[4]證實(shí)，并通過(guò)基因敲除和14C同位素示蹤實(shí)驗(yàn)證明，催化這一反應(yīng)的酶正是MetY。至此，MetY這一獨(dú)特功能為該領(lǐng)域的研究提供了全新的線(xiàn)索。

1.1.2 甲硫氨酸生產(chǎn)菌株選育的研究

除發(fā)酵常用的谷氨酸棒桿菌和大腸桿菌之外，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、百合棒桿菌（Corynebacterium lilium）也常用作改造的出發(fā)菌株。2012年，Dike等[3]從不同土樣中篩選出3 株蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）RS-16、DS-13和AS-9，其中最優(yōu)菌株RS-16經(jīng)96 h發(fā)酵產(chǎn)甲硫氨酸1.84 mg/mL。但野生型菌株氨基酸的生物合成受到嚴(yán)格的代謝調(diào)控，一般不能滿(mǎn)足大量生產(chǎn)氨基酸的需要。因此，需要人為打破微生物對(duì)甲硫氨酸生物合成的代謝調(diào)節(jié)。

篩選抗結(jié)構(gòu)類(lèi)似物菌株和營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株是最常用的育種方法。2003年，Kumar等[17]采用紫外和亞硝基胍誘變技術(shù)處理百合屬棒桿菌，篩選獲得M-128菌株，其甲硫氨酸產(chǎn)量為2.3 g/L；2009年，閔偉紅等[18]通過(guò)抗結(jié)構(gòu)類(lèi)似物的篩選獲得北京棒桿菌（Corynebacterium pekinense）突變株E31，其甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)1.479 g/L。2011年，該課題組程麗[19]以E31為出發(fā)菌株，采用復(fù)合誘變和青霉素濃縮法篩選獲得12 株賴(lài)氨酸和蘇氨酸雙重營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，其中突變株GE37的甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)3.55 g/L。這些傳統(tǒng)的改造方法機(jī)理難以闡明，工作量大，但突變?nèi)?、有效。隨著基因技術(shù)的發(fā)展，2007年，Park等[1]解除了蘇氨酸對(duì)HSD的反饋抑制，同時(shí)敲除了thrB基因，阻止蘇氨酸合成。分批發(fā)酵過(guò)程中甲硫氨酸產(chǎn)量達(dá)2.9 g/L。2011年，Chen Zhen等[20]利用分子動(dòng)力學(xué)模擬與統(tǒng)計(jì)耦合分析相結(jié)合鑒別出30 個(gè)關(guān)鍵氨基酸殘基，并證明這些殘基的突變可在不同程度上解除大腸桿菌AKⅢ的反饋抑制。至此，對(duì)于兩大 限速酶的研究逐漸趨于半理性，能在代謝和進(jìn)化水平上做出合理的解釋?zhuān)脑炷繕?biāo)更明確。

在菌種選育過(guò)程中，一些新發(fā)現(xiàn)也給研究人員以啟示。2005年，Mampel等[21]對(duì)谷氨酸棒桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)座子誘變，得到7 000 個(gè)具有乙硫氨酸抗性的突變株，轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)為開(kāi)放閱讀框（open r eading frame，ORF）NCgl2640，NCgl2640失活會(huì)導(dǎo)致甲硫氨酸產(chǎn)量增加，證明該位點(diǎn)與L-甲硫氨酸合成途徑中某種抑制的解除密切相關(guān)。其結(jié)構(gòu)和具體功能有待科研工作者深入研究。2010年，Bolten等[4]發(fā)現(xiàn)了MetY的獨(dú)特功能后，試圖對(duì)MetY進(jìn)行過(guò)表達(dá)以增加甲硫氨酸產(chǎn)量，結(jié)果MetY酶活力提高了近30 倍，但發(fā)酵液中并無(wú)甲硫氨酸，胞內(nèi)甲硫氨酸產(chǎn)量也只提高了2 倍。胞內(nèi)組分分析發(fā)現(xiàn)其底物O-乙酰高絲氨酸已完全耗盡。這說(shuō)明半理性的單基因修飾難以保證整個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)的平衡，以途徑中各代謝物和酶的功能性質(zhì)及代謝流分布信息為基礎(chǔ)，更加理性化的多基因修飾成為下一階段的研究目標(biāo)。2000年Biran等[22]發(fā)現(xiàn)大腸桿菌中MetA極易被4 種依賴(lài)ATP催化的蛋白酶水解，且該基因受熱轉(zhuǎn)錄休克調(diào)控。2013年，Rotem等[23]對(duì)根癌土壤桿菌中MetA進(jìn)行表征時(shí)發(fā)現(xiàn)了相同的不穩(wěn)定性和極端不耐熱特性。這極有可能也是賴(lài)氨酸和蘇氨酸易發(fā)酵生產(chǎn)，在同一途徑下游的甲硫氨酸卻一直難以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的重要原因。

1.1.3 甲硫氨酸向胞外輸出的研究

發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸在合成水平上不易達(dá)到增產(chǎn)目標(biāo)，即便細(xì)胞質(zhì)內(nèi)甲硫氨酸產(chǎn)量得到提高，釋放至培養(yǎng)液中的量卻極少?？偨Y(jié)有以下兩方面原因：1）微生物自身調(diào)控嚴(yán)格，為趨利避害，甲硫氨酸在自然條件下不會(huì)過(guò)量積累，即使經(jīng)改造的菌株，甲硫氨酸的產(chǎn)量與微生物細(xì)胞適應(yīng)性之間的平衡也難把握。2）即使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)甲硫氨酸過(guò)量積累，但其輸出體系不完善，產(chǎn)物被微生物自身再利用或直接傷害細(xì)胞。2005年，Tr?tschel等[24]在已經(jīng)提高了胞內(nèi)甲硫氨酸濃度的條件下，利用DNA微陣列技術(shù)識(shí)別出過(guò)量表達(dá)的膜蛋白基因brnF（編碼BrnFE中較大的亞基），之前研究表明其與異亮氨酸輸出體系有關(guān)。當(dāng)BrnFE的合成被氯霉素關(guān)閉時(shí)，仍能觀察到大量甲硫氨酸輸出，只有極大提高氯霉素水平，其輸出才會(huì)減弱。這說(shuō)明甲 硫氨酸輸出體系不止一個(gè)，還存在不易被識(shí)別、但輸出能力高的其他體系。發(fā)掘并擴(kuò)增輸出通道既可增加發(fā)酵液中甲硫氨酸產(chǎn)量，又能避免代謝物積累對(duì)微生物的損傷。

1.1.4 發(fā)酵條件的研究

對(duì)于甲硫氨酸發(fā)酵，最特殊的培養(yǎng)基成分即硫和甲基。以谷氨酸棒桿菌為例，2006年，Kr?mer等[16]用計(jì)算機(jī)模擬了不同硫源在甲硫氨酸合成途徑中的應(yīng)用。以硫酸鹽為硫源通過(guò)直接巰基化途徑生成1 mol甲硫氨酸消耗8 mol NADPH，巰基轉(zhuǎn)移途徑消耗9 mol NADPH，而以硫代硫酸鹽為硫源，整個(gè)代謝過(guò)程只需要5.5 mol NADPH，以硫化物為硫源，NADPH消耗量?jī)H為硫酸鹽的一半。但磷酸戊糖途徑（pentose phosphate pathway，PPP）和三羧酸（tricarboxylic acid，TCA）循環(huán)所能提供的NADPH是固定的，因此不同硫源的利用效率有待在實(shí)踐中考證。硫與甲基來(lái)源的結(jié)合可以考慮比較硫代硫酸鹽與甲酸鹽、硫化物與甲酸鹽及甲硫醇的利用情況。除了這兩種關(guān)鍵組分，2014年，Anakwenze等[25]從發(fā)酵的油豆種子中分離出甲硫氨酸產(chǎn)量為1.89 mg/mL的赤云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）EC1，對(duì)發(fā)酵總體積、接種量、碳源及氮源濃度、促生長(zhǎng)物質(zhì)均進(jìn)行探索優(yōu)化，最終赤云金芽孢桿菌EC1甲硫氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到3.18 mg/mL。

對(duì)于發(fā)酵工藝的探索一直是實(shí)際生產(chǎn)中的關(guān)鍵。Sharma等[26]研究了百合棒桿菌產(chǎn)甲硫氨酸中稀釋速率與溶解氧對(duì)甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。最終確定當(dāng)稀釋速率為0.16 h－1、溶氧為42%時(shí)，甲硫氨酸生產(chǎn)速率最大值為160 mg/（L·h）。2012年，賈翠英等[27]研究了不同破壁方法對(duì)細(xì)菌甲硫氨酸產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，經(jīng)堿破壁、溶菌酶破壁、超聲波破壁、堿與超聲波復(fù)合破壁、溶菌酶與超聲波復(fù)合破壁后，甲硫氨酸產(chǎn)量分別提高10.9%、12%、18.3%、19.6%、22.2%。這種工藝可以將胞內(nèi)甲硫氨酸釋放出來(lái)，增加收率，復(fù)合破壁比單一破壁效果更顯著。

1.2 酶法生產(chǎn)路線(xiàn)的相關(guān)研究

1.2.1 外消旋混合物拆分生產(chǎn)甲硫氨酸

酶法拆分又分為兩種思路，傳統(tǒng)的拆分是消除外消旋混合物中的D-甲硫氨酸，另一種路線(xiàn)將D型轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型，純化的同時(shí)也增加了產(chǎn)量無(wú)疑是更理想的選擇。2007年，F(xiàn)indrik等[28]利用原玻璃蠅節(jié)桿菌（Arthrobacter protophormiae）中D-氨基酸氧化酶、過(guò)氧化氫酶、紅球菌（Rhodococcus）中L-苯丙氨酸脫氫酶、博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）中甲酸脫氫酶串聯(lián)實(shí)現(xiàn)D-甲硫氨酸向L-甲硫氨酸的完全轉(zhuǎn)化（圖2）。更有意義的是，D-氨基酸氧化酶和L-苯丙氨酸脫氫酶可以作用于不同的底物，因此，該體系也適用于其他D型氨基酸及某種氨基酸外消旋體向L型的轉(zhuǎn)化合成。

圖2 4 種酶串聯(lián)進(jìn)行D-甲硫氨酸向L-甲硫氨酸轉(zhuǎn)化Fig.2 Biotransformation of D-methionine into L-methionine in the cascade of four enzymes

1.2.2 化合物酶解生產(chǎn)甲硫氨酸

2014年，Jin Liqun等[29]對(duì)大腸桿菌中經(jīng)密碼子優(yōu)化的腈水解酶基因進(jìn)行重新合成和表達(dá)，從而有效利用2-氨基-4-甲硫基丁腈水解生產(chǎn)甲硫氨酸。并在催化劑充足的情況下，以固定的底物/催化劑比值探索底物最佳濃度。該課題組也對(duì)在填充床反應(yīng)器中利用固定化靜息細(xì)胞生產(chǎn)甲硫氨酸進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示固定化腈水解酶100 h后酶活力仍大于80%，甲硫氨酸總回收率達(dá)97%。該項(xiàng)研究表明，重組腈水解酶應(yīng)用于甲硫氨酸生產(chǎn)具有巨大潛力，酶在微生物體內(nèi)的過(guò)表達(dá)與酶的固定化技術(shù)相結(jié)合可能實(shí)現(xiàn)產(chǎn)量突破。

1.3 發(fā)酵與體外酶催化路線(xiàn)相結(jié)合

發(fā)酵法即以培養(yǎng)基組分為原料，利用微生物自身體內(nèi)代謝反應(yīng)，將低成本原料轉(zhuǎn)化為高價(jià)值產(chǎn)品，是最經(jīng)濟(jì)環(huán)保的氨基酸生產(chǎn)方式。發(fā)酵法之所以至今無(wú)法應(yīng)用于甲硫氨酸生產(chǎn)，關(guān)鍵在于其合成途徑的每一步均受到嚴(yán)格地反饋抑制，經(jīng)本課題組改造后的菌株GE37的甲硫氨酸發(fā)酵產(chǎn)量也僅為3.55 g/L[19]。因此發(fā)酵法生產(chǎn)甲硫氨酸仍處于科研階段。體外酶催化反應(yīng)目前并沒(méi)有一套完整的獨(dú)立生產(chǎn)體系，而是作為化學(xué)生產(chǎn)方法的輔助手段，2000年之前即用于DL-同型半胱氨酸向L-甲硫氨酸的合成及DL-甲硫氨酸的分離[30]。近年的研究也多屬于化學(xué)合成法的下游，目的是獲得高純度的L-甲硫氨酸。酶催化與發(fā)酵法相比，反應(yīng)過(guò)程較短，反應(yīng)體系及條 件易靈活操控。因此，發(fā)酵與體外酶催化路線(xiàn)相結(jié)合可以回避微生物的部分反饋抑制，縮短發(fā)酵過(guò)程以得到產(chǎn)量較大的中間體，進(jìn)而以此為底物合成L-甲硫氨酸。

韓國(guó)杰希公司采用的發(fā)酵/化學(xué)法聯(lián)合生產(chǎn)工藝即為兩種路線(xiàn)結(jié)合的實(shí)例，并于2012年宣布在東南亞建立產(chǎn)量80 000 t的甲硫氨酸加工廠。該路線(xiàn)以葡萄糖為基質(zhì)，利用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)琥珀酰高絲氨酸，隨后用酶將這一中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸和琥珀酸。如圖3所示，經(jīng)計(jì)算，這種全新的發(fā)酵/化學(xué)法聯(lián)合工藝生產(chǎn)的L-甲硫氨酸成本略高于化學(xué)合成法[6]。

圖3 發(fā)酵/化學(xué)法聯(lián)合生產(chǎn)工藝Fig.3 Combined fermentative/chemical route for methionine production

2 結(jié) 語(yǔ)

2.1 發(fā)酵法生產(chǎn)面臨的問(wèn)題和建議

甲硫氨酸與其他氨基酸相比至今難以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)，綜合上文所述，總結(jié)了以下三方面原因和建議。2.1.1 硫源的利用效率

甲硫氨酸與其他氨基酸最大的不同即對(duì)硫源的需求，而發(fā)酵法應(yīng)用最普遍的硫源為硫酸鹽，需消耗大量NADPH，但生物體能提供的NADPH有限；硫化物對(duì)NADPH需求量雖少，但因多有毒且穩(wěn)定性差，不適用于培養(yǎng)基；硫代硫酸鹽兼具氧化性與還原性，應(yīng)該對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步選擇和研究。甲硫醇作為硫和甲基的綜合供體，可以縮短代謝途徑并為最后一步提供更多甲基。因此，應(yīng)該對(duì)硫代硫酸鹽與甲硫醇或二甲基二硫的復(fù)合使用進(jìn)行新的嘗試。提高NADPH的供應(yīng)量也是菌株改造的策略之一。

2.1.2 代謝途徑調(diào)控的改造

硫和甲基的參與已經(jīng)使代謝途徑增長(zhǎng)，而合成途徑中涉及到諸多反饋抑制性酶，進(jìn)一步削弱了代謝流。如何確定關(guān)鍵酶、發(fā)現(xiàn)酶的活性中心及抑制劑結(jié)合位點(diǎn)，并進(jìn)一步識(shí)別關(guān)鍵殘基成為一個(gè)艱巨的課題。通過(guò)半理性設(shè)計(jì)，本課題組已找出北京棒桿菌（Corynebacterium pekinense）天冬氨酸激酶與抑制劑結(jié)合位點(diǎn)有直接或間接作用的所有關(guān)鍵氨基酸殘基，并通過(guò)突變解除反饋抑制得到高活力菌株。2013年，李慧穎等[31]得到突變體R169H，酶活力較突變前提高2.3 倍；同年，郭永玲[32]得到突變體T361N、A362I，酶活力分別提高47.99、34.60 倍；2014年，任軍等[33]得到突變體G277K，酶活力提高9.48 倍；同年，朱運(yùn)明等[34]得到突變體G377F，酶活力提高9.3 倍。此外，類(lèi)似的單基因修飾研究缺少全面性和持續(xù)性，還應(yīng)對(duì)改造前后的代謝流變化進(jìn)行對(duì)比分析，嘗試針對(duì)改造后的缺陷進(jìn)行多基因修飾，繼續(xù)對(duì)甲硫氨酸產(chǎn)量是否提高進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

較成功的理性設(shè)計(jì)在甲硫氨酸同族氨基酸——賴(lài)氨酸生產(chǎn)中有成功的先例。2013年，Kind等[35]根據(jù)TCA循環(huán)和賴(lài)氨酸合成途徑相關(guān)知識(shí)，通過(guò)敲除?sucCD在琥珀酰輔酶A合成酶水平上有目的性地阻斷TCA循環(huán)，使其與賴(lài)氨酸合成途徑相結(jié)合，增加目的產(chǎn)物合成途徑代謝流，產(chǎn)量提高60%。由于理性設(shè)計(jì)需要大量全面準(zhǔn)確的生物學(xué)信息，直接針對(duì)代謝流的整合在甲硫氨酸研究領(lǐng)域還需要嘗試和突破。

2.1.3 關(guān)鍵酶在代謝過(guò)程中的穩(wěn)定性

在大腸桿菌和根癌土壤桿菌中均證實(shí)了高絲氨酸?；D(zhuǎn)移酶（homoserine transsuccinylase，HTS）的不穩(wěn)定性，這可能也是賴(lài)氨酸和蘇氨酸易發(fā)酵生產(chǎn)，而同一途徑下游的甲硫氨酸卻一直難以實(shí)現(xiàn)發(fā)酵生產(chǎn)的重要原因。其極端不耐熱和易被蛋白酶分解這兩大特性，是發(fā)酵法面臨的難題。對(duì)Biran等[22]發(fā)現(xiàn)的4 種可能分解HTS的蛋白酶進(jìn)行修飾，或與嗜熱菌關(guān)鍵基因整合都是菌株改造可以嘗試的方向。

此外，甲硫氨酸向胞外輸出的研究尚不成熟，可在菌株改造后，對(duì)胞內(nèi)組分進(jìn)行量化分析，以探索胞內(nèi)甲硫氨酸產(chǎn)量最大時(shí)的條件，以及能分泌到胞外營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌種選育。

2.2 酶法生產(chǎn)面臨的問(wèn)題和建議

酶法合成一般不作為單獨(dú)的生產(chǎn)路線(xiàn)，傳統(tǒng)的酶法是與石化生產(chǎn)路線(xiàn)相結(jié)合，以石化生產(chǎn)廢棄物為原料，進(jìn)行化學(xué)合成后，對(duì)外消旋混合物進(jìn)行拆分以得到高純度的L-甲硫氨酸，其中Findrik等[28]將D型轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)型的實(shí)驗(yàn)是更具意義的研究。

韓國(guó)杰希公司首次采用發(fā)酵法與體外酶催化的聯(lián)合生產(chǎn)工藝，先利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)琥珀酰高絲氨酸，隨后用酶法在微生物體外將這一中間產(chǎn)物轉(zhuǎn)化成甲硫氨酸和琥珀酸。降低生產(chǎn)成本的同時(shí)減少污染。2010年，Bolten等[4]對(duì)谷氨酸棒桿菌MetY進(jìn)行過(guò)表達(dá)使酶活力大幅提高，但由于胞內(nèi)底物耗盡，甲硫氨酸產(chǎn)量仍不理想。參考杰希公司，可嘗試由發(fā)酵法獲得大量O-乙酰高絲氨酸，并利用過(guò)表達(dá)的酶在體外催化甲硫醇與O-乙酰高絲氨酸生成甲硫氨酸。

目前，對(duì)酪氨酸、半胱氨酸和脯氨酸的生產(chǎn)，從蛋白中分離仍是最經(jīng)濟(jì)的方法。由于植物可以合成甲硫氨酸，因此通過(guò)酶解方法利用稻草等農(nóng)作物的廢棄物生產(chǎn)甲硫氨酸是最經(jīng)濟(jì)的模式。2015年，Sanders等[6]對(duì)這種方法的成本進(jìn)行了核算，證明了其具有一定可行性。但該法不適用于獲得高純度的L-甲硫氨酸，因?yàn)楫a(chǎn)物組成復(fù)雜，分離純化難度大。

甲硫氨酸的生物技術(shù)生產(chǎn)與理論值之間的差距證明，此項(xiàng)研究具有廣闊的進(jìn)步空間，對(duì)微生物發(fā)酵、酶法分解等多方面的探索仍有待深入研究。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，利用生物技術(shù)生產(chǎn)甲硫氨酸仍將是科研工作者面臨的重要課題。

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Progress and Prospects for Methionine Bioproduction

WANG Longyang, MIN Weihong*
(National Engineering Laboratory on Wheat and Corn Further Processing, College of Food Science and Engineering, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China)

Methionine is widely used in many fields such as feed, food, pharmaceutical and biotechnology, and has an increasing market demand. Compared with chemical synthesis, the biological production of methionine has many advantages especially in sustainable production and environmental protection. The biological methods used for methionine production include microbial fermentation and enzymatic treatment. Researchers have been trying to describe the biosynthetic pathway of methionine and breed high methionine-producing strains. However, no bacteria are now used in industrial production of met hionine because of the complex biosynthesis pathway of this amino acid and the affinity with other intracellular reaction systems. In-depth study of methionine biosynthesis pathway, expansion of methionine exporting system and optimization of fermentation conditions are effective to increase the yield of methionine produced by the existing strains. The stateof-the-art technology of enzymatic hydrolysis for the production of methionine, combining genetic engineering with enzyme immobilization, has great application potential. This article summarizes the latest advances in the biotechnologies for methionine production in China and abroad with emphasis on microbial fermentation, enzymatic treatment and their combination. According to the characteristics of methionine production by microbial fermentation, existing problems and corresponding suggestions with respect to the removal of allosteric inhibition, the application of composite sulfur source and the stability of key enzymes are put forward. The combination of enzymatic treatment and microbial fermentation is recommended to be used for the production of methionine from preferably hydrolyzed plant proteins, achieving the advantages of low cost, low pollution, high yield and high purity.

methionine; biotechnology; microbial fermentation; enzymatic processing; isomer resoultion; enzymatic hydrolysis

10.7506/spkx1002-6630-201603048

Q517

A

1002-6630（2016）03-0280-06

王隆洋, 閔偉紅. 利用生物技術(shù)生產(chǎn)甲硫氨酸的研究進(jìn)展[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(3): 280-285. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603048. http://www.spkx.net.cn

WANG Longyang, MIN Weihong. Progress and prospects for methionine bioproduction[J]. Food Science, 2016, 37(3): 280-285. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201603048. http://www.spkx.net.cn

2015-03-03

吉林省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（20130101139JC）

王隆洋（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)榘l(fā)酵微生物的選育與代謝調(diào)控。E-mail：shuiranmo1991@163.com

*通信作者：閔偉紅（1971—），女，教授，博士，研究方向?yàn)榘l(fā)酵工程、糧食科學(xué)與深加工技術(shù)。E-mail：minwh2000@163.com