脫脂羊腦蛋白水解多肽的分離純化及抗氧化活性

常 飛，楊雪果，肖士成，蔣鵬飛，黃慧娜，段旭昌,*

脫脂羊腦蛋白水解多肽的分離純化及抗氧化活性

常 飛1，楊雪果1，肖士成2，蔣鵬飛1，黃慧娜1，段旭昌1,*

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100；2.陜西楊陵華興羊產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展有限公司，陜西 楊凌 712100）

為制備羊腦蛋白抗氧化肽，本實(shí)驗(yàn)對(duì)脫脂羊腦蛋白含量及氨基酸組成進(jìn)行了分析；采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）對(duì)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶不同酶解時(shí)間的酶解液分子質(zhì)量進(jìn)行了分析；采用交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25和Sephadex G-15對(duì)羊腦酶解產(chǎn)物進(jìn)行了逐級(jí)分離純化，以羥自由基（·OH）和亞硝酸根離子清除能力為指標(biāo)對(duì)分離組分進(jìn)行抗氧活性評(píng)價(jià)，并對(duì)純化后的組分抗氧化活性進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果表明，脫脂羊腦粉中蛋白含量為60.55%，在測(cè)定的17 種氨基酸中，谷氨酸和天冬氨酸這兩種酸性氨基酸含量最高，且含有7 種必需氨基酸；羊腦蛋白經(jīng)酶解后，分子質(zhì)量集中在10 kD以下；經(jīng)Sephadex G-25純化后，得到了6 個(gè)組分，其中組分F4的抗氧化活性最強(qiáng)，組分F4經(jīng)Sephadex G-15純化后，得到3 個(gè)組分，其中組分F4-2的抗氧化活性最強(qiáng)，組分F4-2對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基、·OH、超氧陰離子自由基（O2－·）、亞硝酸根離子的半數(shù)抑制率IC50分別為1.64、2.47、7.98、5.14 mg/mL。

羊腦蛋白；多肽；分離純化；抗氧化活性

腦蛋白水解物是指動(dòng)物腦脫脂后再經(jīng)蛋白酶降解產(chǎn)生的含有游離氨基酸和分子質(zhì)量在1 000 D以下的小分子肽等的混合物[1]。目前動(dòng)物蛋白水解物作為腦血管病的特效藥應(yīng)用于腦血管病的治療當(dāng)中，應(yīng)用最多是以健康豬腦為原料，經(jīng)酶解而制得的豬腦水解液。腦蛋白水解液有多種功能，Gschanes等[2]研究表明，腦蛋白水解物可顯著改善大鼠腦缺血缺氧造成的記憶與運(yùn)動(dòng)能力；Gonzalez等[3]研究表明：腦蛋白水解物可顯著抑制腦損傷大鼠血清中過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性的降低。鐘玉旭等[4]研究表明，小牛腦酶解產(chǎn)物可降低腦損傷引起的腦組織脂質(zhì)過氧化物（lipid hydroperoxide，LPO），并提高谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活性。因此把腦蛋白酶解物中的肽段作為保健食品的功能成分具有非常好的應(yīng)用前景。

羊腦中富含蛋白質(zhì)，每100 g羊腦中含蛋白質(zhì)達(dá)11 g。西北地區(qū)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)達(dá)，羊腦資源豐富，利用羊腦蛋白為原料，酶解制備活性肽有很好開發(fā)前景。王洪奇等[5]對(duì)羊腦水解工藝進(jìn)行了研究，安玉會(huì)等[6]對(duì)羊腦多肽的氨基酸組成進(jìn)行了分析，羊腦多肽含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸和賴氨酸，尤其是谷氨酸和天冬氨酸的含量很高。谷氨酸和天冬氨酸是酸性氨基酸，Ai Saiga等[7]研究發(fā)現(xiàn)含有大量酸性氨基酸的肽段呈現(xiàn)更好的抗氧化性。在此理論基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室之前建立的酶解方法制備脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物[8]，并對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行了分離純化及抗氧化活性研究，旨在為羊腦深加工和功能產(chǎn)品開發(fā)，提高羊腦加工利用效益提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

羊腦，由陜西楊陵華興羊產(chǎn)業(yè)科技發(fā)展有限公司提供，品種為陜北絨山羊。

枯草芽孢桿菌中性蛋白酶（酶活力為60 000 U/g）北京索萊寶科技有限公司；交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25、交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-15 西安沃爾森生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；菲洛嗪 上海晶純生化科技股份有限公司；抗壞血酸 成都市科龍化工試劑廠；石油醚、氫氧化鈉、鹽酸、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、磷酸二氫鈉、硫酸亞鐵、水楊酸、過氧化氫、亞硝酸鈉、鄰苯三酚等試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；蛋白質(zhì)Marker（Mw26 616 D）美國(guó)Thermo Scientific公司。

1.2 儀器與設(shè)備

LGJ-100型冷凍干燥機(jī) 北京四環(huán)儀器公司；玻璃層析柱（16 mm×100 mm）、HL-2B數(shù)顯恒流泵、BSZ自動(dòng)部分收集器 上海滬西分析儀器廠有限公司；FOSS-2300型定氮儀 FOSS瑞典特卡托公司；L-8900全自動(dòng)氨基酸分析儀 日本日立公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司；HH-4恒溫水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；HC-3018高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脫脂羊腦粉的制備

將取回的新鮮羊腦用自來水清洗去除表面雜質(zhì)和鮮血，于－60 ℃條件下冷凍24 h，之后于9.5 Pa、－40 ℃條件下冷凍干燥48 h，凍干后的羊腦經(jīng)九陽料理機(jī)粉碎30 s過100 目篩，用濾紙包裹后放入索氏提取器中用石油醚脫脂12 h，脫脂后的羊腦分散于玻璃紙上于通風(fēng)櫥放置24 h充分揮發(fā)殘留的石油醚。然后再用九陽料理機(jī)粉碎30 s過100 目篩，用自封袋包裝后于－60 ℃條件下保存?zhèn)溆茫凑誈B/T 5009.5—2010《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》測(cè)定脫脂羊腦粉的蛋白質(zhì)含量[9]，按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.124—2003《食品中氨基酸的測(cè)定》測(cè)定氨基酸組成[10]。

1.3.2 羊腦蛋白酶解產(chǎn)物制備

按照實(shí)驗(yàn)室之前優(yōu)化的方法制備酶解產(chǎn)物[8]，稱取適量的脫脂羊腦粉置于三角瓶中，按固液比為1∶33（m/V）加入蒸餾水混勻，用0.1 mol/L NaOH調(diào)pH值至7.0，按5 653.20 U/g底物的酶添加量加入適量的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶，在39 ℃條件下酶解3 h，酶解結(jié)束后沸水滅酶。酶解液經(jīng)離心收集上清液，上清液冷凍干燥即得羊腦蛋白酶解產(chǎn)物。

1.3.3 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）

為詳細(xì)了解羊腦蛋白在加入蛋白水解酶后的蛋白分子質(zhì)量發(fā)生的變化，利用SDS-PAGE跟蹤酶解過程，輔助了解蛋白的酶解進(jìn)程。分別取1 g脫脂羊腦粉于7 個(gè)小燒杯中，按實(shí)驗(yàn)室之前優(yōu)化的酶解最佳條件[8]分別酶解1、2、3、4、5、6、7 h，同時(shí)做不添加蛋白酶的空白實(shí)驗(yàn)，將不同酶解時(shí)間的酶解液和空白對(duì)照的羊腦蛋白溶液經(jīng)透析后凍干，將凍干后的樣品溶解后進(jìn)行SDS-PAGE分析，分離膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%，濃縮膠質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%。考馬斯亮藍(lán)R-250染色。蛋白Marker分子質(zhì)量為26 616 D。

1.3.4 羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的分離純化

1.3.4.1 交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-25分離純化[11-13]

將凍干的酶解產(chǎn)物配制成質(zhì)量濃度25 mg/mL的溶液，在Sephadex G-25凝膠柱上進(jìn)行分離純化，上樣量為3 mL。以去離子超純水為洗脫液，洗脫流速為0.3 mL/min，采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液（3 mL/管），用紫外檢測(cè)儀在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)，收集各洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥各級(jí)洗脫組分，利用1.3.5.2節(jié)和1.3.5.4節(jié)的方法和計(jì)算公式分別求得羥自由基（·OH）和亞硝酸根離子的清除率，以·OH清除率和亞硝酸根離子清除率為檢測(cè)指標(biāo)篩選抗氧化活性最高的組分。

1.3.4.2 交聯(lián)葡聚糖凝膠Sephadex G-15分離純化

將上述經(jīng)過Sephadex G-25凝膠純化后抗氧化活性最強(qiáng)的組分進(jìn)行多次收集，凍干。將凍干的組分配制成質(zhì)量濃度10 mg/mL的溶液，在Sephadex G-15凝膠柱[14]上進(jìn)行分離純化，上樣量為3 mL。以去離子超純水為洗脫液，洗脫流速為0.3 mL/min，采用自動(dòng)部分收集器收集洗脫液（3 mL/管），用紫外檢測(cè)儀在280 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)[15]，收集各洗脫峰，真空濃縮，冷凍干燥各級(jí)洗脫組分；以·OH清除率和亞硝酸根離子清除率為檢測(cè)指標(biāo)篩選抗氧化活性最高的組分。

1.3.5 純化后活性肽的抗氧化活性測(cè)定

1.3.5.1 DPPH自由基清除率測(cè)定[16-17]

用95%乙醇將DPPH配制成0.1 mmol/L的溶液，取0.5 mL DPPH溶液置于不同試管中，分別加入0.5 mL酶解脫脂羊腦蛋白多肽測(cè)試液和不同濃度VC溶液試樣，振蕩混勻，于室溫下暗反應(yīng)30 min，在517 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，分別以蒸餾水代替試樣做空白實(shí)驗(yàn)，以95%乙醇溶液替代試樣做對(duì)照實(shí)驗(yàn)，按式（1）計(jì)算各試樣的DPPH自由基清除率，比較純化后多肽組分與VC和未經(jīng)純化的酶解產(chǎn)物對(duì)DPPH自由基清除效果。

式中：As為試樣與DPPH反應(yīng)的吸光度；A0為95%乙醇代替DPPH對(duì)照吸光度；Ab為空白吸光度。

1.3.5.2 ·OH清除率測(cè)定[18]

在不同試管中加入0.5 mL 0.15 mol/L的硫酸亞鐵溶液和0.5 mL 2 mmol/L水楊酸鈉溶液，然后分別加入1 mL酶解脫脂羊腦蛋白多肽測(cè)試液或不同濃度VC溶液試樣，然后再分別加入0.5 mL 6 mmol/L過氧化氫溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng)，于37 ℃條件下反應(yīng)1 h后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和過氧化氫溶液做空白對(duì)照，按式（2）計(jì)算各樣品的·OH清除率，比較純化后多肽組分與VC和未經(jīng)純化的酶解產(chǎn)物對(duì)·OH清除效果。

式中：As為試樣的吸光度；A0為蒸餾水替代過氧化氫對(duì)照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣空白吸光度。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代鄰苯三酚溶液對(duì)照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣空白吸光度。

1.3.5.4 亞硝酸根離子清除能力測(cè)定[20]

取0.5 mL酶解脫脂羊腦蛋白多肽測(cè)試液或不同質(zhì)量濃度VC溶液于不同試管中，分別加入0.5 mL 5 μg/mL亞硝酸鈉溶液，于37 ℃反應(yīng)30 min，再分別加入0.5 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4%的對(duì)氨基苯磺酸，搖勻靜置5 min；再分別加入0.25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 0.2%的鹽酸萘乙二胺顯色劑，搖勻，靜置反應(yīng)15 min，于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。分別以蒸餾水替代試樣和亞硝酸鈉溶液做空白實(shí)驗(yàn)，按式（4）計(jì)算各實(shí)驗(yàn)樣的亞硝酸根離子清除率，比較純化后多肽組分與VC和未經(jīng)純化的酶解產(chǎn)物對(duì)亞硝酸根離子清除效果。

式中：As為試樣吸光度；A0為蒸餾水替代亞硝酸鈉溶液對(duì)照吸光度；Ab為蒸餾水替代試樣空白吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 脫脂羊腦粉蛋白含量及氨基酸組成

脫脂羊腦粉的蛋白質(zhì)含量測(cè)定結(jié)果為60.55%。氨基酸組成測(cè)定結(jié)果見表1。

表1 脫脂羊腦蛋白粉氨基酸組成分析結(jié)果Table 1 Amino acid composition of defatted goat brain protein

由表1可知，在所測(cè)定的17 種氨基酸中，谷氨酸含量最高，其次是天冬氨酸，這與安玉會(huì)等[6]對(duì)羊腦多肽氨基酸組成分析結(jié)果是一致的。Saiga等[7]研究發(fā)現(xiàn)含有大量酸性氨基酸的肽段呈現(xiàn)更好的抗氧化性，谷氨酸和天冬氨酸是酸性氨基酸，這兩種酸性氨基酸含量高也為下一步抗氧化活性的研究提供了理論支撐。除此之外，可以看到羊腦蛋白中含有豐富的賴氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、蘇氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸至少7 種必需氨基酸。

2.2 羊腦蛋白酶解多肽的SDS-PAGE分析

圖1 羊腦蛋白不同酶解時(shí)間的SDS-PAGGEE圖Fig.1 SDS-PAGE of goat brain protein hydrolyzed for different time periods

不同酶解時(shí)間羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的SDS-PAGE結(jié)果如圖1所示。未經(jīng)酶解的羊腦蛋白溶液中蛋白組分比較復(fù)雜，含有多種不同分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，由于分離膠的濃度較大，因此大分子質(zhì)量的蛋白的分離效果并不好。但可以看出其分子質(zhì)量主要集中25～130 kD之間。羊腦蛋 白經(jīng)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解后，除分子質(zhì)量在55 kD左右的蛋白質(zhì)只有少量被水解之外，其他蛋白均得到不同程度的水解。從整個(gè)電泳圖譜來看，高分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)經(jīng)枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解后降解為小分子質(zhì)量的肽段，這些肽段的分子質(zhì)量都集中在10 kD以下。SDS-PAGE顯示，羊腦蛋白在枯草芽孢桿菌中性蛋白酶的作用下得到了迅速水解。

2.3 羊腦蛋白酶解多肽的Sephadex G-25分離純化結(jié)果

圖2 脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的Sephadex G-25層析洗脫結(jié)果Fig.2 Elution profile of defatted goat brain hydrolysates on Sephadex G-25 column

脫脂羊腦蛋白的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解多肽的Sephadex G-25分離純化結(jié)果如圖2所示。羊腦酶解產(chǎn)物經(jīng)Sephadex G-25純化后，被分離成F1、F2、F3、F4、F5、F6 共6 個(gè)組分。Sephadex G-25的分離范圍是1 000～5 000 D，組分F1為穿透峰，即沒有進(jìn)入凝膠顆粒，直接從凝膠的縫隙中被洗脫下來，因此F1組分中以分子質(zhì)量為5 000 D以上的成分為主；F2、F3、F4、F5、 F6這 5 個(gè)組分是進(jìn)入到凝膠顆粒而被分離開來，因此這5 個(gè)組分中以分子質(zhì)量為5 000 D以下的成分為主。

將這6 個(gè)組分分別收集，冷凍干燥，稱質(zhì)量。然后配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，測(cè)定6 個(gè)組分的·OH清除率；配成質(zhì)量濃度為3 mg/mL的溶液，測(cè)定6 個(gè)組分的亞硝酸根離子清除率，結(jié)果如圖3所示。

圖3 脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的Sephadex G-25純化后各組分抗氧化活性比較Fig.3 Antioxidant activity of different fractions purified by Sephadex G-25 column

由圖3可知，羊腦蛋白的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解多肽經(jīng)Sephadex G-25純化后，得到的6 個(gè)組分中，F(xiàn)4組分的·OH和亞硝酸根離子的清除率最高，清除能力最強(qiáng)，F(xiàn)4組分質(zhì)量占6 個(gè)組分總質(zhì)量的（30.43±2.37）%。因此，將組分F4合并收集，冷凍干燥，供進(jìn)一步的分離純化研究。

2.4 羊腦蛋白酶解多肽F4的Sephadex G-15分離純化結(jié)果

羊腦蛋白的枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解多肽的Sephadex G-25分離純化后的F4組分經(jīng)Sephadex G-15的進(jìn)一步分離純化結(jié)果如圖4所示。組分F4經(jīng)Sephadex G-15純化后，又被分離成F4-1、F4-2、F4-3這3 個(gè)組分。Sephadex G-15分離的分子質(zhì)量范圍是＜1 500 D，組分F4-1為穿透峰，即沒有進(jìn)入凝膠顆粒，直接從凝膠的縫隙中被洗脫下來，因此F4-1組分中以分子質(zhì)量為1 500 D以上的成分為主；F4-2、F4-3兩個(gè)組分是進(jìn)入到凝膠顆粒而被分離開來，因此這兩個(gè)組分中以分子質(zhì)量為1 500 D以下的成分為主。

圖4 脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的Sephadex G-15層析洗脫結(jié)果Fig.4 Elution profile of F4 on Sephadex G-15 column

將這3 個(gè)組分分別收集，冷凍干燥，稱質(zhì)量，然后配成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的溶液，測(cè)定3 個(gè)組分的·OH清除率；配成質(zhì)量濃度為2 mg/mL的溶液，測(cè)定3 個(gè)組分的亞硝酸根離子清除率，結(jié)果如圖5所示。

圖5 脫脂羊腦蛋白酶解產(chǎn)物的Sephadex G-15純化后各組分抗氧化活性比較Fig.5 Antioxidant activity of different fractions separated from F4 by Sephadex G-15

由圖5可知，羊腦蛋白水解多肽的先經(jīng)Sephadex G-25分離后的F4組分再進(jìn)一步經(jīng)Sephadex G-15分離后，得到3 個(gè)組分中的F4-2組分的·OH和亞硝酸根離子清除率最高，即抗氧化活性最強(qiáng)組分，F(xiàn)4-2組分的質(zhì)量占3 個(gè)組分總質(zhì)量的（26.44±1.62）%。因此，將組分F4-2合并收集，冷凍干燥，供后面的抗氧化活性研究。

2.5 羊腦蛋白水解多肽F4-2組分的抗氧化活性

F4-2組分收集凍干后，配制成不同質(zhì)量濃度的溶液，測(cè)定其對(duì)DPPH自由基、·OH、O2－·、亞硝酸根離子的清除能力，然后利用Origin軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行擬合并計(jì)算其IC50值。不同質(zhì)量濃度F4-2組分和對(duì)照的抗氧化能力如圖6所示。

利用實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化后的酶解工藝得到的羊腦蛋白酶解產(chǎn)物相對(duì)與一些其他的抗氧化肽表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化性[8]。比如羊腦蛋白酶解產(chǎn)物抗氧化能力強(qiáng)于Klomklao等[21]制得的鯰魚蛋白酶解產(chǎn)物，Naqash等[22]制得的金線魚蛋白酶解產(chǎn)物，Hong Zhuang等[16]制得的玉米蛋白酶解產(chǎn)物，Venuste等[23]制得的南瓜蛋白酶解產(chǎn)物，楊璐等[24]制備的馬面魚骨膠原多肽及傅亮等[25]制備的綠豆多肽，因此，羊腦蛋白酶解產(chǎn)物經(jīng)初步分離純化后，僅將其與未經(jīng)分離純化的羊腦蛋白酶解產(chǎn)物和VC進(jìn)行抗氧化比較。

圖6 不同質(zhì)量濃度F4-2組分與VC對(duì)照的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activities of fraction F4-2 and control (VC) at different concentrations

由圖6A、6B可知，F(xiàn)4-2羊腦蛋白酶解多肽表現(xiàn)出了較強(qiáng)的DPPH自由基清除能力，DPPH自由基清除率與F4-2組分質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，通過 擬合并計(jì)算可知，VC和F4-2多肽對(duì)DPPH自由基清除的IC50分別為0.049 mg/ mL和1.64 mg/mL。F4-2多肽的IC50值是VC的33.47 倍，清除能力低于VC，但與未經(jīng)分離前的酶解產(chǎn)物的IC50（2.49 mg/mL）相比有顯著提高。

由圖6C、6D可知，F(xiàn)4-2多肽對(duì)·OH的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，經(jīng)擬合計(jì)算，VC和F4-2多肽對(duì)·OH的IC50值分別為0.15 mg/mL和2.47 mg/mL。F4-2多肽的IC50值是VC的16.47 倍，清除能力低于VC，但與未經(jīng)分離前的酶解產(chǎn)物的I C50（3.13 mg/mL）相比得到了提高。

由圖6E、6F可知，F(xiàn)4-2多肽對(duì)O2－·的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，并且呈現(xiàn)良好線性關(guān)系，經(jīng)擬合計(jì)算，VC和F4-2多肽對(duì)O2－·清除的IC50分別為0.15 mg/mL和7.98 mg/mL。F4-2多肽的清除能力明顯低于VC，但與未經(jīng)分離前的酶解產(chǎn)物的IC50（10.37 mg/mL）相比得到了明顯提高。

由圖6G、6H可知，F(xiàn)4-2多肽對(duì)亞硝酸根離子的清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增強(qiáng)，當(dāng)F4-2組分質(zhì)量濃度小于6 mg/mL時(shí)，清除率與F4-2組分質(zhì)量濃度呈線性關(guān)系，當(dāng)F4-2組分質(zhì)量濃度大于6 mg/mL時(shí)，隨著質(zhì)量濃度的增大，清除率的變化率降低。經(jīng)擬合計(jì)算，VC和F4-2組分對(duì)亞硝酸根離子清除的IC50分別為0.03 mg/mL和5.14 mg/mL，F(xiàn)4-2組分的清除能力明顯低于VC，但與未經(jīng)分離前的酶解產(chǎn)物的IC50（10.89 mg/mL）相比有顯著提高，其IC50是未經(jīng)分離前酶解產(chǎn)物IC50的約1/2，即清除亞硝酸根離子的抗氧化能力提高了近2 倍。

經(jīng)以上分析，羊腦蛋白酶解多肽經(jīng)Sephadex G-25和Sephadex G-15的分離純化，提高了分離多肽組分的抗氧化性能，得到的F4-2多肽組分具有最強(qiáng)的抗氧化性能，但其抗氧化性能弱于VC。

3 結(jié) 論

脫脂羊腦蛋白粉的蛋白質(zhì)含量為60.55%，至少含有7 種必需氨基酸，氨基酸中谷氨酸含量最高，天冬氨酸次之。

羊腦蛋白分子質(zhì)量大部分集中在25～130 kD之間，羊腦中的55 kD蛋白不易被枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解，其他蛋白的酶解效果較好，酶解后得到的多肽分子質(zhì)量集中在10 kD以下。

羊腦蛋白枯草芽孢桿菌中性蛋白酶酶解多肽經(jīng)過Sephadex G-25和Sephadex G-15分離后，得到了抗氧化能力最強(qiáng)的F4-2多肽。F4- 2多肽對(duì)DPPH自由基、·OH、O2－·、亞硝酸根離子的半數(shù)抑制率IC50分別為1.64、2.47、7.98、5.14 mg/mL，經(jīng)純化后的抗氧化肽的抗氧化活性顯著高于未經(jīng)分離純化的酶解產(chǎn)物。

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Purification and Antioxidant Activity of Peptides Derived from Defatted Goat Brain Protein

CHANG Fei1, YANG Xueguo1, XIAO Shicheng2, JIANG Pengfei1, HUANG Huina1, DUAN Xuchang1,*
(1. College of Food Science and Engineering, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; 2. Shaanxi Huaxing Goat Industry Science and Technology Development Co. Ltd., Yangling 712100, China)

This research was designed to prepare antioxidant peptides derived from goat brain protein. The protein content and amino acids composition of defatted goat brain were determined. The molecular mass distribution of protein hydrolysates by neutral protease from Bacillu s subtilis at different times was analyzed by sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE), and goat brain protein hydrolysates were separated and purified by Sephadex G-25 gel filtration chromatography and Sephadex G-15 gel filtration chromatography. The antioxidant activity of the resulting fractions was evaluated by DPPH, hydroxyl radical, superoxide anion radical, and nitrite radical scavenging assays. The results showed that the protein content of defatted goat brain was 60.55% and contained seven essential amino acids among which glutamic acid and aspartic acid were the most predominant. The molecular mass of the hydrolysates was below 10 kD. After purification by Sephadex G-25 gel filtration chromatography, the six fractions of the hydrolysates were obtained and F4 fraction showed the strongest antioxidant activity. F4 was further purified into three fractions by Sephadex G-15 gel filtration chromatog raphy, including F4-2 showing the strongest antioxidant activity. The IC50values of F4-2 for scavenging DPPH, hydroxyl radical, superoxide anion radical, and nitrite radicals were 1.64, 2.47, 7.98 and 5.14 mg/mL respectively.

goa t brain protein; peptides; separation and purification; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201601007

TS209

A

1002-6630（2016）01-0033-07

常飛, 楊雪果, 肖士成, 等. 脫脂羊腦蛋白水解多肽的分離純化及抗氧化活性[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 33-39.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601007. http://www.spkx.net.cn

CHANG Fei, YANG Xueguo, XIAO Shicheng, et al. Purification and antioxidant activity of peptides derived from defatted goat brain protein[J]. Food Science, 2016, 37(1): 33-39. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601007. http://www.spkx.net.cn

2015-03-09

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011BAD28B05-3）

常飛（1987—），男，碩士研究生，主要從事食品加工新技術(shù)研究。E-mail：changfeibest@126.com

*通信作者：段旭昌（1965—），男，副教授，博士，主要從事天然產(chǎn)物及食品加工新技術(shù)研究。E-mail：duanxc1965@tom.com