殼聚糖及其水溶性衍生物對(duì)小鼠免疫功能的影響

王志華，江陽(yáng)陽(yáng)，余曉華，顏永斌*，覃彩芹

殼聚糖及其水溶性衍生物對(duì)小鼠免疫功能的影響

王志華1，江陽(yáng)陽(yáng)1，余曉華1，顏永斌2,*，覃彩芹2

（1.湖北工程學(xué)院 特色果蔬質(zhì)量安全控制湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝感 432000；2.湖北工程學(xué)院 生物質(zhì)資源化學(xué)與環(huán)境生物技術(shù)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 孝 感 432000）

給小鼠喂食殼聚糖（chitosan，CS）、羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）、殼聚糖季銨鹽（quaternary ammonium salt of chitosan，HACC）和羥丙基殼聚糖（hydroxypropyl chitosan，HPCS）30 d后，測(cè)定其免疫器官指數(shù)、碳粒廓清速率、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)、血清溶血素含量（半數(shù)溶血值HC50）。結(jié)果表明：攝食CS及其水溶性衍生物的小鼠以上指標(biāo)均高于對(duì)照組；除胸腺指數(shù)和雙耳質(zhì)量差值外，HACC組小鼠其他各項(xiàng)免疫指標(biāo)與對(duì)照組相比均呈顯著或極顯著差異（P＜0.05或P＜0.01）；同樣，除胸腺指數(shù)外，HPCS組小鼠其他各項(xiàng)免疫指標(biāo)均顯著或極顯著高于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01）；CMCS組小鼠的吞噬指數(shù)（K）和半數(shù)溶血值（HC50）與對(duì)照組相比均呈顯著差異（P＜0.05）；殼聚糖及其3 種水溶性衍生物都能夠增強(qiáng)小鼠免疫功能，增強(qiáng)效果排序?yàn)镠PCS＞HACC＞CMCS＞CS，這可能與引入的化學(xué)基團(tuán)不同有關(guān)。

殼聚糖；水溶性衍生物；免疫功能

殼聚糖（chitosan，CS）是天然多糖中唯一的陽(yáng)離子聚合多糖，主要來(lái)源于節(jié)肢動(dòng)物（蝦、蟹）、軟體動(dòng)物的外殼以及真菌的細(xì)胞壁，是一種豐富的可再生資源[1-2]。因其具有一些獨(dú)特的生物活性，如抗微生物、抗氧化、增 強(qiáng)免 疫功能、調(diào)節(jié)血脂水平、抑制腫瘤等，CS被廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥、食品工程等領(lǐng)域[3-6]。自1983年美國(guó)食品和藥物監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）批準(zhǔn)CS作為食品添加劑以來(lái)，CS已被廣泛用于食品工業(yè)中，多用于制成保健食品或作為食品添加劑和果汁保鮮劑[7-9]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CS對(duì)小鼠非特異性免疫和特異免疫有明顯 的促進(jìn)作用，可活化自然殺傷（nat ural killer，NK）細(xì)胞以及調(diào)節(jié)殺傷性T細(xì)胞的免疫活性，增強(qiáng)機(jī)體免疫力[10-11]。但CS不溶于水，使其應(yīng)用受到了很大限制。CS經(jīng)過(guò)化學(xué)修飾或降解為低聚物，其水溶性提高的同時(shí)，生物學(xué)活性也會(huì)發(fā)生改變。研究表明，水溶性的低分子質(zhì)量CS能增強(qiáng)正常小鼠的免疫功能[12]；羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMCS）通過(guò)增強(qiáng)小鼠免疫力抑制S180腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)[13]；殼聚糖季銨鹽（quaternary ammonium salt of chitosan，HACC）作為免疫佐劑可增強(qiáng)戊型肝炎病毒疫苗的免疫效果[14]。水溶性羥丙基殼聚糖（hydroxypropyl c hitosan，HPCS）是CS的羥丙基化衍生物，對(duì)其應(yīng)用和生物活性已開(kāi)展了大量研究，如抗菌活性等[15]，但有關(guān)其免疫活性尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究主要通過(guò)給小鼠攝食CS及其3 種水溶性衍生物，比較分析HPCS與CMCS、HACC對(duì)小鼠體內(nèi)免疫功能的影響，初步探討CS水溶性衍生物中不同功能基團(tuán)對(duì)小鼠免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、動(dòng)物與試劑

CS（Mw2.48×105D、脫乙酰度92%） 浙江金殼生物化學(xué)有限公司；CMCS、HACC和HPCS由本實(shí)驗(yàn)室在堿性條件下將CS與氯乙酸、環(huán)氧丙烷、2,3-環(huán)氧丙基三甲基氯化銨進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)制備[16-18]，其取代度分別為0. 81、0.72和0.79，重均分子質(zhì)量（Mw）分別為1.42×105、1.71×105、1.56×105D。

4 周齡清潔級(jí)雌性昆明小鼠，體質(zhì)量18～22 g，小鼠及其食用的基礎(chǔ)飼料均由湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

二硝基氟苯（dinitrofluorobenzene，DNFB）為優(yōu)級(jí)純?cè)噭?，其他試劑均?分析純，由國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary 60紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì) 美國(guó)Agilent公司；TGL-16C臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭儀器廠；Impact 410 FTIR紅外光譜儀 美國(guó)尼高力公司。

1.3 方法

1.3.1 動(dòng)物分組及處理

將50 只健康的雌性昆明小鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1 周，隨機(jī)分為5 組：對(duì)照組小鼠喂食基礎(chǔ)飼料，其他4 組小鼠分別喂食含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5% CS、HACC、CMCS和HPCS的飼料。持續(xù)喂養(yǎng)期間自由飲水，每周稱體質(zhì)量，第31天將小鼠頸椎脫臼處死，取 出肝臟、脾臟和胸腺稱質(zhì)量。

1.3.2 CS及其水溶性衍生物的紅外光譜掃描

取少量的CS及其水溶性衍生物樣品，用紅外光譜儀在4 000～400 cm?1波數(shù)范圍內(nèi)掃描，得到其紅外光譜圖。

1.3.3 碳粒廓清實(shí)驗(yàn)

將含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同飼料和基礎(chǔ)飼料持續(xù)喂養(yǎng)小鼠30 d后，尾靜脈注射1∶4（V/V）稀釋的印度墨汁0.1 mL/10 g（以體質(zhì)量計(jì)，下同），注入后立即計(jì)時(shí)，并分別于2 min和10 min用抗凝過(guò)的平口毛細(xì)管從小鼠眼眶內(nèi)眥靜脈叢取血0.025 mL，加入到盛有2 mL 0.1%碳酸鈉溶液的管中，以0.1%碳酸鈉溶液為空白，于600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度（A600nm）。

1.3.4 小鼠血清溶血素抗體水平測(cè)定

將含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同飼料和基礎(chǔ)飼料持續(xù)喂養(yǎng)小鼠30 d。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束3 d前，給小鼠腹腔注射0.2 mL 10%的綿羊紅細(xì)胞（sheep red blood cell，SRBC），3 d后摘眼球取血，分離血清。將每組小鼠的血清混合于試管中，用生理鹽水1∶1稀釋。取稀釋血清1 mL置于冰浴中，依次加入10% SRBC 0.25 mL、生理鹽水1∶10（V/V）稀釋的豚鼠血清1 mL，37 ℃水浴中孵育30 min，冰水浴終止反應(yīng)，2 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL，加都氏液3 mL混勻，10 min后于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，對(duì)照組以1 mL生理鹽水代替樣品血清。另設(shè)半數(shù)溶血管，取10% SRBC 0.125 mL加都氏液至4 mL混勻，10 min后于540 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以半數(shù)溶血值（HC50）判斷血清溶血素抗體水平。

1.3.5 遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)

將含CS、CMCS、HACC和HPCS的不同飼料和基礎(chǔ)飼料持續(xù)喂養(yǎng)小鼠30 d。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束6 d前，稱取DNFB 50 mg，置于清潔干燥小瓶中，將預(yù)先配好的5 mL丙酮-麻油（1∶1，V/V）溶液倒入小瓶，混勻后，取DNFB溶液50 μL均勻涂抹在用硫化鋇脫毛的4 個(gè)CS及其水溶性衍生物組和對(duì)照組小鼠腹部皮膚上（約3 cm×3 cm）致敏。5 d后，用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳（兩面）進(jìn)行攻擊。攻擊后24 h頸椎脫臼處死小鼠，剪下左、右耳殼，用打孔器取下直徑8 mm的耳片，稱質(zhì)量。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)以±s示，均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件中的單因素方差分析（one-way analysis of variance，oneway ANOVA）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，比較實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 CS及其水溶性衍生物的結(jié)構(gòu)分析

CS及其水溶性衍生物的紅外光譜如圖1所示。與CS相比，CMCS在1 415 cm?1處出現(xiàn)—COOH對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰，而—COOH非對(duì)稱伸縮振動(dòng)吸收峰（1 720～1 550 cm?1）與乙酰氨基的特征吸收峰（1 645 cm?1）疊加，在1 580 cm?1處形成一個(gè)新的強(qiáng)吸收峰。HACC在1 482 cm?1處出現(xiàn)季銨基團(tuán)的C—H彎曲振動(dòng)的新吸收峰。HPCS在1 428 cm?1處出現(xiàn)一個(gè)較強(qiáng)的新吸收峰、在2 976 cm?1處出現(xiàn)一個(gè)新的吸收峰，這兩處吸收峰分別歸因于—CH3的C—H伸縮振動(dòng)和不對(duì)稱變形，表明CS分子上連接有羥丙基基團(tuán)。

圖1 CS及其水溶性衍生物的紅外光譜圖Fig.1 FT-IR spectra of chitosan and its derivatives

2.2 CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響

4 周齡小鼠攝食含質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5% CS、CMCS、HACC和HPCS的飼料，在實(shí)驗(yàn)期內(nèi)活動(dòng)、生長(zhǎng)正常。CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠體質(zhì)量的影響如表1所示。各組小鼠初始體質(zhì)量相近，實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，CS及其水溶性衍生物組小鼠體質(zhì)量比對(duì)照組小鼠體質(zhì)量略高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 各組小鼠體質(zhì)量的變化（x±s , n＝10）Table 1 Body weight changes of mice (x±s , n= 10)

2.3 CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠免疫器官指數(shù)的影響

攝食CS及其水溶性衍生物30 d后，各組小鼠的免疫器官指數(shù)如表2所示。免疫器官質(zhì)量是反映機(jī)體免疫功能重要而直觀的指標(biāo)，CS及其水溶性衍生物組小鼠脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)均有所增加，尤其是HACC組和HPCS組小鼠 的脾臟指數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），以上結(jié)果表明HACC和HPCS促進(jìn)小鼠免疫功能的效果比CMCS、CS好。

表2 小鼠免疫器官指數(shù)（x± s ＝10）Table 2 Immune organ index changes of mice (x± s , = 10)

2.4 CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠單核巨噬細(xì) 胞吞噬功能的影響

表3 小鼠碳粒廓清速率 (x±s ,n = 10)Table 3 Effect of chitosan and its derivatives on the carbon clearance rate in mice (x±s ,n = 10)

表3顯示了CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠單核巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響，CS及其水溶性衍生物組小鼠的吞噬指數(shù)（K）和吞噬系數(shù)（α）均高于對(duì)照組，其中HAC C組和HPCS組與對(duì)照組相比差異極顯著（P＜0.01），C MCS組小鼠的吞噬指數(shù)與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），以上結(jié)果表明CS衍生物能夠促進(jìn)小鼠巨噬細(xì)胞碳粒廓清功能。

2.5 CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響

圖2 CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響Fig.2 Effect of chitosan and its derivatives on mouse delayed type hypersensitivity (DTH)

CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)的影響如圖2所示。DNFB致敏小鼠后，CS及其水溶性衍生物組小鼠的雙耳質(zhì)量差值均高于對(duì)照組，HPCS組與對(duì)照組相比差異顯著（P＜0.05），其他各組與對(duì)照組相比差異不明顯（P＞0.05），以上結(jié)果表明HPCS能夠促進(jìn)小鼠細(xì)胞免疫功能的恢復(fù)。

2.6 CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠血清溶血素水平的影響

圖3 CS及其水溶性衍生物對(duì)小鼠血清溶血素的HHCC5500的影響Fig.3 Effect of chitosan and its derivatives on the content of serum hemolysin in mice

SRBC免疫小鼠后，B淋巴細(xì)胞受抗原刺激，分化為漿細(xì)胞，漿細(xì)胞產(chǎn)生抗體，其含量反映了小鼠特異性體液免疫的功能。由圖3可知，CS及其水溶性衍生物均可提高小鼠血清溶血素的HC50，與對(duì)照組比較，HACC、HPCS和CMCS均能顯著或極顯著提高小鼠血清溶血素含量（P＜0.05或P＜0.01），以上結(jié)果表明攝食CS及其水溶性衍生物有利于增強(qiáng)小鼠特異性體液免疫功能。

3 討 論

免疫系統(tǒng)的功能是消除病原微生物，清除損傷、衰老及死亡的自身細(xì)胞，監(jiān)視發(fā)生突變的細(xì)胞，維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定?，F(xiàn)代社會(huì)中人們由于各種壓力和飲食結(jié)構(gòu)不合理，導(dǎo)致體內(nèi)環(huán)境酸醎不平衡，免疫系統(tǒng)功能紊亂，誘發(fā)頑固性疾病的發(fā)生。CS天然無(wú)毒，其氨基可以結(jié)合H+、提高HCO3?濃度，使體液pH值傾向弱堿性，激活巨噬細(xì)胞，為淋巴細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞）的激活提供適宜的環(huán) 境，提高機(jī)體免疫力，作為增強(qiáng)機(jī) 體免 疫功能的保健食品和藥物開(kāi)發(fā)有良好的發(fā)展前景。

本研究將CS通過(guò)化學(xué)修飾制備成水溶性的CMCS、HACC和HPCS，經(jīng)元素分析，CMCS、HACC和HPCS的取代度相近，依次為0.81、0.72和0.79。小鼠攝食4 種CS及其水溶性衍生物后，通過(guò) 對(duì)其免疫器官指數(shù)和碳粒廓清指數(shù)、血清溶血素含量和遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)等免疫指標(biāo)分析[19-21]，發(fā)現(xiàn)4 種CS及其水溶性衍生物均能增強(qiáng)小鼠的免疫功能。但四者相比較，HPCS效果最好，其次是HACC，CMCS次之，CS效果較差，這暗示CS及其水溶性衍生物的免疫效果可能與引入的化學(xué)基團(tuán)有關(guān)。CS不溶于水，這嚴(yán)重影響了其生物活性。從結(jié)構(gòu)特征看，CS羥丙基化后，不僅其水溶性升高，同時(shí)易被消化道壁吸收降解，而且還使羥基的活性增加，分布到各組織細(xì)胞中，促進(jìn)其與巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞表面的膜受體（TLR4和甘露糖受體）結(jié)合[22]；經(jīng)季銨基團(tuán)修飾的CS，分子上正電荷密度增加，增強(qiáng)了其與帶負(fù)電荷的淋巴細(xì)胞 的親和性。兩者通過(guò)不同方式活化巨噬細(xì)胞和樹(shù)突細(xì)胞，尤其是樹(shù)突細(xì)胞?；罨臉?shù)突細(xì)胞會(huì)釋放細(xì)胞因子、使膜主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）MHCⅡ分子表達(dá)量增加、T細(xì)胞活化；活化的T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、IL-10、腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）和干擾素-γ（interferon-γ，IFN-γ），進(jìn)一步活化其他免疫細(xì)胞，產(chǎn)生抗體和具有免疫活性的NK細(xì)胞、粒細(xì)胞等，增強(qiáng)機(jī)體的免疫力[23-26]；CMCS結(jié)構(gòu)中含有—NH2和—COOH，既帶有正電荷又帶有負(fù)電荷，削弱了其改變體液環(huán)境pH值的能力以及與帶負(fù)電荷巨噬細(xì)胞的親和性，因此其增強(qiáng)小鼠免疫功能的活性弱于HACC。從結(jié)構(gòu)上推測(cè)化學(xué)修飾基團(tuán)在免疫調(diào)節(jié)過(guò)程發(fā)揮著重要作用，CS及其水溶性衍生物調(diào)節(jié)免疫活性的機(jī)理還有待進(jìn)一步深入研究。

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Effect of Chitosan and Its Water-Soluble Derivatives on Immune Function in Mice

WANG Zhihua1, JIANG Yangyang1, YU Xiaohua1, YAN Yongbin2,*, QIN Caiqin2
(1. Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, China; 2. Hubei Key Laboratory of Biomass-Resource Chemistry and Environmental Biotechnology, Hubei Engineering University, Xiaogan 432000, Chin a)

The immune organ index, carbon clearance rate, delayed type hypersensitivity, and serum hemolysin (HC50) in mice were compared and analyzed after the administration of chitosan (CS), carboxymethyl chitosan (CMCS), quaternary ammonium salt of chitosan (HACC) and hydroxypropyl chitosan (HPCS) for 30 days. The values of all investigated parameters were higher in mice administered with CS or its water-soluble derivatives compared with the control group. A significant difference (P ＜ 0.05) or extremely significant difference (P ＜ 0.01) in all immune inde xes except for thymus index and binaural weight difference was found for the HACC an d HPCS groups compared with the control group. Comparing the CMCS group with the control group, a significant difference in carbon clearance rate and the content of serum hemolysin (P ＜ 0.05) was observed. These results indicated that the administration of chitosan and its water-soluble derivatives could enhance the immune function of mice in the decreasing order of HPCS ＞ HACC ＞ CMCS ＞ CS. This may be associated with the introduction of chemical groups.

chitosan; water-soluble derivatives; immune function

10.7506/spkx1002-6630-201601035

O6 36.1

A

1002-6630（2016）01-0198-05

王志華, 江陽(yáng)陽(yáng), 余曉華, 等. 殼聚糖及其水溶性衍生物對(duì)小鼠免疫功 能的影響[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 198-202.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601035. http://www.spkx.net.cn

WANG Zhihua, JIANG Yangyang, YU Xiaohua, et al. Effect of chitosan and its water-soluble derivatives on immune function in mice[J]. Food Science, 2016, 37(1): 198-202. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201 601 035. ht tp://www.spkx.net.cn

2015-03-15

湖北省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目（B2015037）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31371750）

王志華（1973—），女，副教授，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物生理。E-mail：wangzhihuay@126.com

*通信作者：顏永斌（1975—），男，副教授，博士，研究方向?yàn)樘烊桓叻肿拥霓D(zhuǎn)化與利用。E-mail：yybyan@163.com