石榴葉多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的抗氧化作用

王美菊，陶明煊，牛文穎，朱 成，葉理躍，邢 佳

石榴葉多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的抗氧化作用

王美菊，陶明煊*，牛文穎，朱 成，葉理躍，邢 佳

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京 210097）

目的：研究石榴葉多酚（purified polyphenols from Punica granatum L. leaves，PPPL）對(duì)酒精所致急性肝損傷小鼠腎臟、心臟、脾臟、胸腺的保護(hù)作用。方法：將66 只雄性小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯150 mg/（kg·d）），PPPL低、中、高劑量組（100、200、400 mg/（kg·d）），連續(xù)灌胃30 d，第31天除空白對(duì)照組外其余各組給予50%乙醇（12 mL/kg），建立小鼠急性肝損傷模型。將小鼠脫臼處死后取腎臟、心臟、脾臟及胸腺，測(cè)定其超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）活力及丙二醛（malondialdehyde，MDA）、還原型谷胱甘肽（glutat hione，GSH）含量。結(jié)果：與模型對(duì)照組相比，PPPL各劑量組均能提高小鼠各臟器的SOD、CAT、GSH-Px活性和GSH含量，降低MDA含量。結(jié)論：PPPL對(duì)酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官具有明顯的抗氧化作用。

石榴葉多酚；酒精性肝損傷；抗氧化作用；心臟；腎臟；免疫器官

隨著社會(huì)和經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，飲酒已成為一種普遍行為，酒的消耗量呈逐年上升趨勢(shì)，長(zhǎng)期過量飲酒導(dǎo)致的健康隱患已成為全世界關(guān)注的公共衛(wèi)生問題[1]。大量研究表明，飲酒與冠心病、高血壓、動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生呈“J”型曲線關(guān)系，少量飲酒可降低這些疾病的發(fā)生率，而飲酒過量則會(huì)大大增加發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)[2]。長(zhǎng)期大量飲酒會(huì)導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化而被破壞，造成心肌損傷，亦會(huì)降低心肌收縮力，出現(xiàn)心室肥大和纖維化，重度飲酒還會(huì)導(dǎo)致心律失常[3-5]；乙醇進(jìn)入機(jī)體后，有5%～10%通過腎臟代謝，過量飲酒則使腎臟代謝超負(fù)荷[6]，乙醇、乙醛便積聚濃縮在腎臟細(xì)胞和間質(zhì)內(nèi)，導(dǎo)致腎臟損傷[7]，有研究稱乙醇可導(dǎo)致腎小管-間質(zhì)損傷，最終表現(xiàn)為腎間質(zhì)纖維化、慢性腎功能衰竭[8-9]。脾臟和胸腺是機(jī)體重要的免疫器官，有研究表明哺乳動(dòng)物過量飲酒會(huì)顯著抑制二者的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致脾臟和胸腺細(xì)胞脂質(zhì)過氧化，細(xì)胞膜通透性增強(qiáng)，使膜表面受體損傷，免疫機(jī)能降低[10]。

石榴（Punica granatum L.）為石榴科石榴屬落葉灌木，大量研究表明石榴及其產(chǎn)品中含有豐富的抗氧化成分，具有延緩衰老、治療心腦血管疾病、抗癌、提高機(jī)體免疫力等功效[11-12]?，F(xiàn)代研究顯示，石榴葉具有收斂止瀉、解毒殺蟲、治療跌打損傷、調(diào)節(jié)血脂水平、清除自由基等功效[13-14]，富含沒食子酸型多酚類物質(zhì)和鞣花酸等具有抗氧化活性的化合物[14]，近年來對(duì)其抗氧作用的研究已不斷深入。本實(shí)驗(yàn)以石榴葉為原料，研究石榴葉純化多酚（purified polyphenols from Punica granatum L. leaves，PPPL）對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的抗氧化作用，旨在為天然藥物或保健食品的研制、開發(fā)提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

石榴葉采自江蘇省南京市鼓樓區(qū)，經(jīng)洗凈烘干、粉碎后，過60 目篩，得石榴葉細(xì)粉，將其與50%乙醇按1∶20（m/V）料液比混勻，冰水浴超聲波破碎10 min，調(diào)節(jié)pH值為2，70 ℃水浴1.5 h，5 000 r/min冷凍離心10 min后過濾，得石榴葉粗多酚（crude polyphenols from Punica granatum L. leaves，CPPL），將CPPL旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后過大孔樹脂AB-8，所得樣品過聚酰胺即得PPPL[15-16]。經(jīng)Folin-酚比色法[17]測(cè)得PPPL的多酚純度為92.83%。

1.2 動(dòng)物

6 周齡昆明種雄性小鼠，體質(zhì)量（27±2） g，在江蘇省中醫(yī)院動(dòng)物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng)，動(dòng)物飼養(yǎng)許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0047，保持飼養(yǎng)室環(huán)境溫度為（23±2） ℃，相對(duì)濕度（50±5）%，照明時(shí)間為12 h。

1.3 試劑與儀器

四乙氧基丙烷 美國(guó)Fluka公司；還原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA） 美國(guó)Sigma公司；氯化硝基四氮唑藍(lán)（nitro blue tetrazolium，NBT）、5,5’-二硫雙-2-硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenzoic acid，DTNB）南京卓爾生化有限公司；H2O2、無水乙醇、硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）、甲硫氨酸（methionine，Met）等生化試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

722可見分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；754紫外-可見分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司；HH-δ數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市富華儀器有限公司；GL-22M高速冷凍離心機(jī) 湖南賽特湘儀離心機(jī)廠。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組及模型建立

66 只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分為空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照組（聯(lián)苯雙酯150 mg/（kg·d）），PPPL低、中、高劑量組（100、200、400 mg/（kg·d）），用蒸餾水配制樣品，每天灌胃1 次，連續(xù)灌胃30 d，空白對(duì)照組及模型對(duì)照組灌胃等劑量蒸餾水，每周稱小鼠體質(zhì)量?jī)纱巍?shí)驗(yàn)期間提供全價(jià)顆粒飼料，不限制飲食飲水。第31天，各組小鼠禁食不禁水12 h，除空白對(duì)照組外其余各組用50%乙醇灌胃，劑量為12 mL/kg，建立小鼠急性酒精性肝損傷模型，空白對(duì)照組灌胃等體積蒸餾水。去除死亡小鼠后每組剩余10 只小鼠，在灌胃12 h后，脫臼處死小鼠，取腎臟、心臟、脾臟及胸腺測(cè)定抗氧化指標(biāo)。

1.4.2 10%臟器勻漿及組織粗酶液的制備

測(cè)定各抗氧化指標(biāo)前，將臟器置于4 ℃冰箱存放過夜。準(zhǔn)確稱取0.1 g臟器，用生理鹽水洗去污血后拭干，置于表面皿中，在冰浴上用手術(shù)刀切碎，移入1.5 mL離心管中，再加入0.9 mL預(yù)冷的50 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8），冰水浴超聲波破碎（400 W，5 s/次，間隙10 s，重復(fù)5～7 次），然后在4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液即為10%組織勻漿液，該勻漿用于測(cè)定丙二醛（malondialdehyde，MDA）、GSH含量。

10%組織勻漿液與飽和硫酸銨溶液以3∶1（V/V）混合，10 000 r/min離心10 min，取上清液即為粗酶液，用于測(cè)定GSH-Px、CAT、SOD活力。

1.4.3 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定

采用Bradford法[18]測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。

1.4.4 MDA含量的測(cè)定

采用TBA法[19]測(cè)定MDA含量。

1.4.5 SOD活力的測(cè)定

參照Stewart等[20]的NBT光還原法測(cè)定SOD活力。

1.4.6 CAT活性的測(cè)定

采用紫外吸收法[21]測(cè)定CAT活力。

1.4.7 GSH-Px活力的測(cè)定

采用照DTNB法[22]測(cè)定GSH-Px活力。

1.4.8 GSH含量的測(cè)定

按文獻(xiàn)[23]的方法測(cè)定GSH含量。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS 13.5統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，單因素方差分析檢驗(yàn)組間數(shù)據(jù)是否存在顯著性差異，數(shù)據(jù)用x±s表示，以P＜0.05及P＜0.01為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 PPPL對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官M(fèi)DA含量的影響

MDA是脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，是評(píng)價(jià)細(xì)胞膜過氧化程度的重要指標(biāo)，其含量與細(xì)胞損傷程度成正相關(guān)。如表1所示，模型對(duì)照組小鼠腎臟、脾臟、胸腺M(fèi)DA含量明顯高于空白對(duì)照組，且差異極顯著（P＜0.01），心臟MDA含量與空白對(duì)照組相比也有顯著差異（P＜0.05）。給予PPPL后，小鼠各臟器的MDA含量均明顯下降，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。PPPL高劑量組小鼠各臟器的MDA含量均達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組水平，與模型對(duì)照組相比差異顯著或極顯著（P＜0.05或P＜0.01）。以上結(jié)果說明PPPL能顯著提高酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的抗氧化水平，對(duì)酒精性臟器損傷具有一定的保護(hù)作用。

表1 PPPL對(duì)小鼠腎臟、心臟及免疫器官M(fèi)DA含量的影響(x±s , n= 10)Table 1 Effect of PPPL on MDA contents in kidney and heart and immune organs of mice (x±s , n= 10)

2.2 PPPL對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官SOD活性的影響SOD是生物體內(nèi)重要的抗氧化酶，能有效清除代謝過程中產(chǎn)生的氧自由基，減緩細(xì)胞衰老進(jìn)程，測(cè)定其活性可間接反映機(jī)體的抗氧化能力。如表2所示，模型對(duì)照組小鼠各臟器SOD活力均極顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），表明造模成功。給予PPPL后，小鼠各臟器的SOD活力明顯增強(qiáng)，且存在劑量-效應(yīng)關(guān)系。PPPL高劑量組小鼠心臟、胸腺的SOD活力與陽(yáng)性對(duì)照組無極顯著差異（P＞0.01）。以上結(jié)果說明PPPL能有效提高小鼠腎臟、心臟及免疫器官的SOD活性，減緩其氧化進(jìn)程，減輕酒精對(duì)其損害。

表2 PPPL對(duì)小鼠腎臟、心臟及免疫器官SOD活力的影響 (x±s , n= 10)Table 2 Effect of PPPL on SOD activities in kidney, heart and immune organs of mice (x±s , n= 10)

2.3 PPPL對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官CAT活性的影響

表3 PPPL對(duì)小鼠腎臟、心臟及免疫器官CAT活力的影響 (x±s , n= 10)Table 3 Effect of PPPL on CAT activities in kidney, heart and immune organs of mice (x±s , n= 10)

CAT可催化過氧化氫分解為水和分子氧，從而清除機(jī)體內(nèi)的過氧化氫，減輕其對(duì)細(xì)胞的損害。如表3所示，模型對(duì)照組小鼠腎臟、心臟、胸腺的CAT活力明顯低于空白對(duì)照組（P＜0.01），脾臟CAT活力的變化雖然不及其他3 個(gè)臟器明顯，但與空白對(duì)照組相比，仍具有顯著差異（P＜0.05），表明造模成功。給予PPPL后，小鼠各臟器的CAT活力均明顯增強(qiáng)，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。PPPL高劑量組小鼠的各臟器CAT活力均達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組水平。以上結(jié)果說明PPPL能有效提高急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的CAT活性，增強(qiáng)了小鼠機(jī)體的抗氧化能力。

2.4 PPPL對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官GSH-Px活性的影響GSH-Px是廣泛存在于機(jī)體內(nèi)的一種含硒酶，能夠清除機(jī)體代謝產(chǎn)生的自由基，減緩脂質(zhì)過氧化進(jìn)程，從而保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。如表4所示，模型對(duì)照組小鼠各臟器GSH-Px活力均極顯著低于空白對(duì)照組（P＜0.01），表明造模成功。給予PPPL后，小鼠各臟器的GSH-Px活力明顯升高，且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表4 PPPL對(duì)小鼠腎臟、心臟及免疫器官GSH-Px活力的影響(x±s , n= 10)Table 4 Effect of PPPL on GSH-Px activities in kidney, heart and immune organs of mice(x±s , n= 10)

PPPL高劑量組小鼠的各臟器GSH-Px活力與陽(yáng)性對(duì)照組相比均無極顯著差異（P＞0.01），且PPPL中劑量組小鼠的腎臟、心臟GSH-Px活力亦達(dá)到陽(yáng)性對(duì)照組水平。以上結(jié)果說明PPPL能顯著提高急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的GSH-Px活性，提高其清除自由基的能力，抑制小鼠衰老進(jìn)程。

2.5 PPPL對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官GSH含量的影響

表5 PPPL對(duì)小鼠腎臟、心臟及免疫器官GSH含量的影響(x±s , n= 10)Table 5 Effect of PPPL on GSH contents in kidney, heart and immune organs of mice(x±s , n= 10)

GSH是由谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸組成的小分子肽，是一種重要的抗氧化劑，其結(jié)構(gòu)中含有極其活潑的巰基，容易氧化脫氫，從而可清除自由基，提高機(jī)體免疫力，延緩衰老。如表5所示，模型對(duì)照組小鼠各臟器的GSH含量明顯低于空白對(duì)照組，且差異極顯著（P＜0.01），說明急性酒精灌胃（12 mg/kg）會(huì)降低小鼠腎臟、心臟、脾臟及胸腺的GSH含量。陽(yáng)性對(duì)照組小鼠各臟器的GSH活力明顯高于模型對(duì)照組（P＜0.01或 P＜0.05），說明實(shí)驗(yàn)方法及操作可靠，重復(fù)性良好，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。給予PPPL后，小鼠各臟器的GSH含量明顯高于模型對(duì)照組，且隨著PPPL劑量的增大而提高，PPPL高劑量組小鼠各臟器的GSH含量甚至與陽(yáng)性對(duì)照組無極顯著差異（P＞0.01）。以上結(jié)果說明PPPL可明顯提高急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的GSH含量，增強(qiáng)其抗氧化能力，對(duì)酒精所致以上臟器損傷具有一定保護(hù)作用。

3 討 論

過量飲酒會(huì)導(dǎo)致急性或慢性酒精中毒。乙醇進(jìn)入機(jī)體后，在代謝過程中會(huì)產(chǎn)生大量的超氧陰離子自由基、過氧化物、羥自由基等活性氧，這些自由基極其活潑，能與細(xì)胞膜上的不飽和脂肪酸反應(yīng)，破壞脂質(zhì)的氧化-抗氧化體系平衡，促進(jìn)脂質(zhì)過氧化進(jìn)程[24-25]，導(dǎo)致生物膜嚴(yán)重受損；自由基還會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)、DNA等生物大分子發(fā)生修飾、交聯(lián)，破壞其正常結(jié)構(gòu)及功能[26]。自由基造成的氧化損傷廣泛存在于機(jī)體的組織或器官中，對(duì)心臟、腎臟、脾臟及胸腺均存在一定的危害。

機(jī)體內(nèi)的抗氧化防御體系分為酶和非酶兩大類，抗氧化酶類包括SOD、GSH-Px、CAT等，非酶抗氧化劑則包括GSH、VC及VE等。現(xiàn)代研究表明，大多數(shù)酚類體外清除自由基的能力要高于VC，且吸收率高[27]；除了作用于活性氧，這些酚類物質(zhì)還可提高酶類抗氧化劑的活性[28-29]；此外，其具有螯合金屬離子的作用，能夠有效阻斷金屬離子對(duì)氧化反應(yīng)的催化進(jìn)程；以上因素協(xié)同配合，最終使酚類化合物具有良好的抗氧化活性。石榴葉多酚的具體組分包括鞣花酸、沒食子酸和短葉蘇木酚等鞣質(zhì)類成分以及以木犀草素4’-O-β-葡萄糖苷為代表的黃酮類成分[30-31]。鞣質(zhì)類成分的結(jié)構(gòu)中含有沒食子?；蛄u基聯(lián)苯二?；?，易與自由基反應(yīng)，生成相對(duì)穩(wěn)定的中間產(chǎn)物；黃酮類物質(zhì)含有大量酚羥基，在自由基的清除方面也表現(xiàn)出良好的活性[14]；以上活性成分的存在，使石榴葉多酚表現(xiàn)出良好的抗腫瘤、抗突變及抗氧化功效。

本實(shí)驗(yàn)以石榴葉為原材料提取多酚，并通過建立小鼠急性酒精性臟器損傷模型，測(cè)定各組小鼠臟器MDA、GSH含量及SOD、GSH-Px、CAT活性，研究PPPL對(duì)小鼠腎臟、心臟及免疫器官酒精性損傷的保護(hù)作用。結(jié)果表明，造模后小鼠以上臟器SOD、GSH-Px、CAT活性和GSH含量均明顯低于空白對(duì)照組，而MDA含量明顯著高于空白對(duì)照組，其機(jī)制是過量乙醇進(jìn)入機(jī)體，代謝產(chǎn)生大量活性氧自由基，導(dǎo)致SOD、GSH、GSH-Px、CAT耗竭，機(jī)體抗氧化防御機(jī)能降低，細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化，最終導(dǎo)致其產(chǎn)物MDA含量升高。給予PPPL后，與模型對(duì)照組相比小鼠各臟器的SOD、GSH-Px、CAT活性及GSH含量明顯提高，MDA含量明顯降低，說明PPPL能夠提高急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的抗氧化酶活性，增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，減輕酒精對(duì)以上臟器的毒害。

過量飲酒甚至酗酒引發(fā)的一系列健康及社會(huì)問題不容忽視，本研究結(jié)果表明，PPPL具有較好的抗酒精性臟器損傷作用，機(jī)制與其較強(qiáng)的抗氧化作用有關(guān)，PPPL有望被開發(fā)成一種抗化學(xué)性臟器損傷的保健食品。

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Antioxidant Effects of Purified Polyphenols from Leaves of Punica granatum L. on Kidney, Heart and Immune Organs in Mice with Acute Alcoholic Liver Injury

WANG Meiju, TAO Mingxuan*, NIU Wenying, ZHU Cheng, YE Liyue, XING Jia
(Ginling College, Nanjing Normal University, Nanjing 210097, China)

Objective: To investigate the protective effect of purified polyphenols from leaves of Punica granatum L. (PPPL) on kidney, heart, spleen and thymus in a mouse model of acute alcohol-induced hepatic injury. Methods: Sixty-six male mice were randomly divided into blank control group, alcoholic injury model group, positive control group (administered with 150 mg/(kg d) bifendate by gavage) and PPPL low, medium, and high dose groups (100, 200 and 400 mg/(kg d)). All mice were administered for 30 days. On the next day, the mice from all groups except t he blank control group were administered with 50% alcohol (12 mL/kg), and then all the mice were subjected to dislocation death to assay the activities of SOD, CAT and GSH-Px and the contents of MDA and GSH in kidney, heart, spleen and thymus. Results: Compared with the alcoholic injury model group, the activities of SOD, CAT and GSH-Px and the contents of GSH in kidney, heart, spleen and thymus revealed an obvious increase in the PPPL treatment groups while the contents of MDA were obviously decreased. Conclusion: PPPL has pronounced antioxidant effect on kidney, heart and immune organs in mice with alcoholic hepatic injury.

purified polyphenols from leaves of Punica granatum L. (PPPL); alcohol liver injury; antioxidantion; heart; kidney; immune organs

10.7506/spkx1002-6630-201601037

TS201.4

A

1002-6630（2016）01-0208-05

王美菊, 陶明煊, 牛文穎, 等. 石榴葉多酚對(duì)急性酒精性肝損傷小鼠腎臟、心臟及免疫器官的抗氧化作用[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(1): 208-212. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601037. http://www.spkx.net.cn

WANG Meiju, TAO Mingxuan, NIU Wenying, et al. Antioxidant effects of purified polyphenols from leaves of Punica granatum L. on kidney, heart and immune organs in mice with acute alcoholic liver injury[J]. Food Science, 2016, 37(1): 208-212. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601037. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

王美菊（1992—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)與保健功能因子。E-mail：wmjessie@yeah.net

*通信作者：陶明煊（1970—），男，副教授，碩士，研究方向?yàn)樯锘钚晕镔|(zhì)與保健功能因子。E-mail：45017@njnu.edu.cn