郭芳芳，馮 鋒，白云峰，劉荔貞，陳澤忠，周靜清，曹雨迪（山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009）

高效毛細(xì)管電泳用于檢測黃花菜中4 種活性物質(zhì)

郭芳芳，馮 鋒*，白云峰，劉荔貞，陳澤忠，周靜清，曹雨迪
（山西大同大學(xué)化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，山西 大同 037009）

使用高效毛細(xì)管電泳法，對黃花菜中活性化合物蘆薈大黃素、山柰酚、綠原酸和槲皮素進(jìn)行檢測。在最佳電泳條件為10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液、pH 9.15、紫外檢測波長224 nm、30 kV的外加電壓條件下進(jìn)樣5 s，4 種物質(zhì)在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分離，4 種物質(zhì)的線性范圍分別為0.02～0.21、0.01～0.90、0.01～0.99、0.01～0.90 mg/mL，線性相關(guān)系數(shù)在0.997 6～0.999 6之間，檢出限分別為2.45×10－5、1.41×10－5、1.78×10－5、8.63×10－6mg/mL（RSN=3），平均回收率在97.5%～101.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.76%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法快速準(zhǔn)確，適合用于黃花菜中活性物質(zhì)的檢測。

高效毛細(xì)管電泳；黃花菜；槲皮素

郭芳芳, 馮鋒, 白云峰, 等. 高效毛細(xì)管電泳用于檢測黃花菜中4 種活性物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 73-76. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604013. http://www.spkx.net.cn

GUO Fangfang, FENG Feng, BAI Yunfeng, et al. Determination of four active compounds in nightlily (Hemerocallis citrina) flowers by high performance capillary electrophoresis[J]. Food Science, 2016, 37(4): 73-76. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604013. http://www.spkx.net.cn

黃花菜是一種百合科萱草屬的多年生草本植物，又名“金針菜”、“忘憂草”、“萱草”[1]，黃花菜營養(yǎng)豐富，是一種常見的食療食品。研究[2]發(fā)現(xiàn)，黃花菜中含有蒽醌類、多酚類、萜類、內(nèi)酰胺類、生物堿類、甾體皂苷等活性成分。其中，蘆薈大黃素是黃花菜中主要的蒽醌類化合物之一，具有健胃、抗炎抗菌等功效[3-5]。同時，黃花菜中還含有包括山柰酚、綠原酸和槲皮素等多酚類化合物。據(jù)報(bào)道，這些化合物具有一定的藥理作用，能夠起到抗氧化[6-9]、降血糖[10-12]、降血脂[13-15]、軟化血管[16]、抗敏[17]、抗癌[18-20]、抗炎[21-24]等多種作用。

趙二勞等[25]采用分光光度法測定了黃花菜中總黃酮；陳暉等[26]采用高效液相色譜法對甘肅省不同產(chǎn)地萱草花蕾中蘆丁、槲皮素、山柰酚進(jìn)行了測定。但鮮見使用高效毛細(xì)管電泳法對黃花菜中活性成分測定的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用高效毛細(xì)管電泳法對山西省大同縣黃花菜中蘆薈大黃素、山柰酚、綠原酸以及槲皮素進(jìn)行測定，以期為黃花菜的質(zhì)量控制和評價(jià)提供數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

干制黃花菜 市購；硼砂（分析純） 天津化學(xué)試劑三廠；氫氧化鈉（分析純） 天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；蘆薈大黃素、綠原酸、山柰酚、槲皮素對照品美國阿拉丁試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

P/ACETMMDQ高效毛細(xì)管電泳儀（配有紫外檢測器以及32Karat軟件） 美國Beckman公司；內(nèi)徑75 μm未涂層石英毛細(xì)管 邯鄲鑫諾光纖色譜有限公司；TDL-16B型離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；PSH-2C型精密酸度計(jì) 上海大普儀器有限公司；0.22 μm一次性針孔過濾器 天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；Lambda35紫外-可見分光光度計(jì) 美國PerkinEimer公司；KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；AP250D分析天平 美國Ohaus公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的制備

精密稱取2.148 mg蘆薈大黃素、9.68 mg山柰酚、9.88 mg綠原酸和8.96 mg槲皮素于4 個10 mL容量瓶中，用甲醇溶解后定容成相應(yīng)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2 樣品處理

取適量黃花菜，在真空干燥器中烘干，后將其研成粉末，精密稱取1 g于50 mL的錐形瓶中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)75%甲醇溶液并封口，超聲提取60 min，再用體積分?jǐn)?shù)75%甲醇溶液補(bǔ)足20 mL，將萃取所得溶液轉(zhuǎn)移至離心管中，以8 000 r/min離心10 min，將上層清液去除，用0.22 μm一次性針孔過濾器過濾2 次，置于4 ℃的冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 操作條件

在25 psi條件下，分別用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸餾水和緩沖溶液各沖洗30 min實(shí)現(xiàn)新毛細(xì)管的活化；實(shí)驗(yàn)中2 次進(jìn)樣間分別用0.1 mol/L NaOH溶液、二次蒸餾水和緩沖溶液沖洗5 min。檢測波長224 nm；分離電壓30 kV；進(jìn)樣時間5 s；緩沖溶液：10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3，pH 9.15。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳條件的確定

2.1.1 檢測波長的選擇

配制一定質(zhì)量濃度的蘆薈大黃素、山柰酚、綠原酸和槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇做空白，在波長200～450 nm范圍內(nèi)對其進(jìn)行紫外掃描，確定4 種活性物質(zhì)在波長224 nm處均有較大吸收，故將波長224 nm作為最佳檢測波長。

2.1.2 緩沖溶液pH值的選擇

緩沖溶液pH值通過影響電滲流的大小和分析物的解離情況，進(jìn)而影響分析物的分離情況，考察pH值分別在9.05、9.15、9.25、9.35時對4 種分析物分離情況的影響，如圖1所示。結(jié)果表明，當(dāng)pH值為9.05時，綠原酸和槲皮素兩峰分離情況較差；pH值為9.15時，4 種分析物完全分離；隨著pH值增大到9.25時，山柰酚和綠原酸兩峰分離度下降，當(dāng)pH值為9.35時，山柰酚和綠原酸兩峰部分重合，分離不完全，因此實(shí)驗(yàn)中選擇9.15做為最佳pH值。

圖1 pH值對4 種化合物分離的影響Fig.1 Effect of running buffer pH on the separation of four compounds

2.1.3 緩沖溶液濃度的影響

緩沖溶液濃度會引起Zeta電勢、溶液黏度以及電滲流的變化，進(jìn)而造成分析物遷移時間和分離情況的變化。考察Na2B4O7-H3BO3緩沖溶液在不同濃度（10、20、30、40、50 mmol/L）時，4 種分析物遷移時間的變化，如圖2所示。隨著緩沖溶液濃度增大，電流不斷增大，分析物遷移時間變長，分析物之間分離度變大。綜合考慮，本實(shí)驗(yàn)選擇最佳的緩沖溶液為10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3。

圖2 緩沖溶液濃度對4 種化合物分離的影響Fig.2 Effect of running buffer concentration on the separation of four compounds

2.1.4 外加電壓對分離的影響

外加電壓會對分析物的遷移速率以及電滲流的大小產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響分析物的分離情況。外加電壓較低時，遷移時間延長，峰形展寬，當(dāng)外加電壓增大時，樣品遷移速率增大，遷移時間縮短，但是產(chǎn)生的焦耳熱也會增加，基線噪音增大，不利于分析物的分離?？疾焱饧与妷悍謩e為15、20、25、30 kV時，4 種黃酮類化合物的分離情況，如圖3所示。外加電壓為15 kV時，分析物可以完全分離，但是所需時間長，隨著外加電壓的升高，分析時間不斷縮短；外加電壓為30 kV時，4 種化合物分離時間最短，且仍能得到良好的分離。綜合考慮，選擇30 kV作為最佳外加電壓。

圖3 分離電壓對4 種化合物分離的影響Fig.3 Effect of applied voltages on the separation of four compounds

2.1.5 進(jìn)樣時間對分離的影響

進(jìn)樣時間對分離效果也會產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)樣時間短，峰面積小，分析誤差大；隨著進(jìn)樣時間變長，峰面積大，但是會引起峰形展寬，分析物分離效率下降?？疾爝M(jìn)樣時間為3、4、5、6 s時分析物的分離情況，如圖4所示。隨著進(jìn)樣時間變長，峰面積不斷變大，分析時間有所縮短，但是當(dāng)進(jìn)樣時間為6 s時，有2 個峰發(fā)生重合，分離效果受到影響。綜合考慮，選擇5 s作為最佳進(jìn)樣時間。

圖4 進(jìn)樣時間對4 種化合物分離的影響Fig.4 Effect of injection duration on the separation of four compounds

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

用甲醇對標(biāo)樣進(jìn)行稀釋，配制4 種分析物的系列溶液，在最佳電泳條件下進(jìn)行測定，以峰面積對質(zhì)量濃度作圖，得到線性方程、線性相關(guān)系數(shù)（0.997 6～0.999 6）、線性范圍和各物質(zhì)的檢出限（RSN=3），如表1所示，線性關(guān)系良好，檢出限為8.63×10－6mg/mL。

表1 4 種化合物的線性方程及檢出限Table 1 Standard curves and limits of detection for determination of four compounds by HPCE

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過考察4 種被分析物遷移時間以及峰面積的日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，對方法的精密度進(jìn)行評估。4 種標(biāo)樣各取50 μL混合均勻，在最優(yōu)電泳條件下日內(nèi)、日間連續(xù)進(jìn)樣3 次，根據(jù)所得數(shù)據(jù)計(jì)算4 種被分析物遷移時間和峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，得到日間、日內(nèi)精密度，結(jié)果見表2。日內(nèi)精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于2.27%，日間精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.90%，表明該方法精密度良好。

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of precision test

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在最佳電泳條件下進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，通過向黃花菜提取液中分別加入一定量（3 個水平）的被分析化合物，測定回收率，結(jié)果如表3所示，平均回收率范圍在97.5%～101.2%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.04%～4.76%之間，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=3）Table 3 Results of recovery test (n= 3)

2.5 實(shí)際樣品的測定結(jié)果

按照1.3.2節(jié)方法對大同縣黃花菜處理，在最佳電泳條件下對提取液蘆薈大黃素、山柰酚、綠原酸和槲皮素進(jìn)行測定，如圖5所示，黃花菜中蘆薈大黃素、山柰酚、綠原酸以及槲皮素含量分別為2.14、5.36、1.74、1.86 mg/g。

圖5 毛細(xì)管電泳譜圖Fig.5 Capillary electrophoresis chromatograms

3 結(jié) 論

使用高效毛細(xì)管電泳-紫外檢測法對黃花菜中蘆薈大黃素、山柰酚、綠原酸和槲皮素4 種活性化合物進(jìn)行了測定，在最佳電泳條件下，4 種被分析化合物在6 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了分離，線性范圍分別為0.02～0.21、0.01～0.90、0.01～0.99、0.01～0.90 mg/mL，檢出限分別為2.45×10－5、1.41×10－5、1.78×10－5、8.36× 10－6mg/mL（RSN=3），線性相關(guān)系數(shù)在0.997 6～0.999 6之間，平均回收率為97.5%～101.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差不大于4.76%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法快速準(zhǔn)確，適合用于黃花菜中活性物質(zhì)的檢測。

[1] 許國寧, 張衛(wèi)明, 孫曉明, 等. 黃花菜的采后生理與保鮮技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 中國野生植物資源, 2011, 30(3): 9-13. DOI:10.3969/ j.issn.1006-9690.2011.03.003.

[2] 傅茂潤, 茅林春. 黃花菜的保健功效及化學(xué)成分研究進(jìn)展[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(10): 108-112. DOI:10.3321/j.issn:0253-990X.2006.10.027.

[3] 劉桂花, 何承輝, 邢建國, 等. HPLC法同時測定復(fù)方蘇潤江滴丸中秋水仙堿、蘆薈苷及蘆薈大黃素的含量[J]. 藥品分析雜志, 2013(3): 409-413.

[4] LI S W, YANG T C, LAI C C, et al. Antiviral activity of aloe-emodin against influenza a virus via galectin-3 up-regulation[J]. European Journal of Pharmacology, 2014, 28(5): 125-132. DOI:10.1016/ j.ejphar.2014.05.028.

[5] HU B Y, ZHANG H, MENG X L, et al. Aloe-emodin from rhubarb (Rheum rhabarbarum) inhibits lipopolysaccharide-induced inflammatory responses in RAW264.7 macrophages[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2014, 59(3): 846-853. DOI:10.1016/ j.jep.2014.03.059.

[6] 白雪松, 張晶瑩, 李善姬. 萱草總黃酮體外抗氧化研究[J]. 食品研究與開發(fā), 2013, 34(21): 19-22. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2013.21.006.

[7] 關(guān)炳峰, 譚軍, 周志娣. 金銀花提取物的抗氧化作用與其綠原酸含量的相關(guān)性研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2007, 28(10): 127-129. DOI:10.3969/j.issn.1002-0306.2007.10.037.

[8] 劉英, 王之盛, 周安國, 等. 橙皮苷和綠原酸的體內(nèi)外抗氧化效應(yīng)研究[J]. 食品科學(xué), 2009, 30(23): 196-199.

[9] AlAMDI N, MULLEN W, CROZIER A. Tea prepared from Anastatica hirerochuntica seeds contains a diversity of antioxidant flavonoids, chlorogenic acids and phenolic compounds[J]. Phytochemistry, 2010, 17(11): 248-254. DOI:10.1016/j.phytochem.2010.11.017.

[10] ZHANG Y L, LIU D M. Flavonol kaempferol improves chronic hyperglycemia-impaired pancreatic beta-cell viability and insulin secretory function[J]. European Journal of Pharmacology, 2011, 670(1): 325-332. DOI:10.1016/j.ejphar.2011.08.011.

[11] FANG X K, GAO J, ZHU D N. Kaempferol and quercetin isolated from Euonymus alatus improve glucose uptake of 3T3-L1 cells without adipogenesis activity[J]. Life Sciences, 2008, 82(11/12): 615-622. DOI:10.1016/j.ifs.2007.12.021.

[12] RODRIGUEZ P, GONZALEZ-MUJICA F, BERMUDEZ J, et al. Inhibition of glucose intestinal absorption by kaempferol 3-O-αrhamnoside purified from Bauhinia megalandra leaves[J]. Fitoterapia, 2010, 81(8): 1220-1223. DOI:10.1016/j.fitote.2010.08.007.

[13] LARSON A, WITMAN A H, GUO Y, et al. Acute, quercetin-induced reductions in blood pressure in hypertensive individuals are not secondary to lower plasma angiotensin-converting enzyme activity or endothelin-1: nitric oxide[J]. Nutrition Research, 2012, 32(8): 557-564. DOI:10.1016/j.nutres.2012.06.018.

[14] CHO A S, JEON S M, KIM M J, et al. Chlorogenic acid exhibits anti-obesity property and improves lipid metabolism in high-fat dietinduced-obese mice[J]. Food and Chemical Toxicology, 2010, 3(1): 937-943. DOI:10.1016/j.fct.2010.01.003.

[15] LI S Y, CHANG C Q, MA F Y, et al. Modulating effects of chlorogenic acid on lipids and glucose metabolism and expression of hepatic peroxisome proliferator-activated receptor-α in golden hamsters fed on high fat diet[J]. Biomedical and Environmental Sciences, 2009, 22(2): 122-129. DOI:10.1016/S0895-3988(09)60034-9.

[16] XIAO H B, LU X Y, SUN Z L, et al. Kaempferol regulates OPNCD44 pathway to inhibit the atherogenesis of apolipoprotein E deficient mice[J]. Toxicology and Applied Pharmacology, 2011, 257(3): 405-411. DOI:10.1016/j.taap.2011.09.024.

[17] MEDEIROS F O K C P, FAUSTINO L, BORDUCHI E, et al. Preventive and curative glycoside kaempferol treatments attenuate the TH2-driven allergic airway disease[J]. International Immunopharmacology, 2009, 9(13/14): 1540-1548. DOI:10.1016/ j.intimp.2009.09.005.

[18] LUO H T, GARY O, LI Z L, et al. Kaempferol induces apoptosis in ovarian cancer cells through activating p53 in the intrinsic pathway[J]. Food Chemistry, 2011, 128(2): 513-519. DOI:10.1016/ j.foodchem.2011.03.073.

[19] CHEN A Y, CHEN Y C. A review of the dietary flavonoid, kaempferol on human health and cancer chemoprevention[J]. Food Chemistry, 2013, 138(4): 2099-2107. DOI:10.1016/j.foodchem.2012.11.139.

[20] YOSHIDA T, KONISHI M, HORINAKA M, et al. Kaempferol sensitizes colon cancer cells to TRAIL-induced apoptosis[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2008, 375(1): 129-133. DOI:10.1016/j.bbrc.2008.07.131.

[21] RAJENDRANA P, RENGARAJANA T, NANDAKUMA R N, et al. Kaempferol, a potential cytostatic and cure for inflammatory disorders[J]. European Journal of Medicinal Chemistry, 2014, 86(2): 103-112. DOI:10.1016/j.ejmech.2014.08.011.

[22] SHINA H S, SAISU H, BEA M J, et al. Anti-inflammatory effect of chlorogenic acid on the IL-8 production in Caco-2 cells and the dextran sulphate sodium-induced colitis symptoms in C57BL/6 mice[J]. Food Chemistry, 2015, 168(1): 167-175. DOI:10.1016/ j.foodchem.204.06.100.

[23] XIAO J, SUN G B, SUN B, et al. Kaempferol protects against doxorubicin-induced cardiotoxicity in vivo and in vitro[J]. Toxicology, 2012, 292(1): 53-62. DOI:10.1016/j.tox.2011.11.018.

[24] KIM T H, KU S K, BAE J S. Inhibitory effects of kaempferol-3-O-sophoroside on HMGB1-mediated proinflammatory responses[J]. Food and Chemical Toxicology, 2012, 50(3/4): 1118-1123. DOI:10/1016/ j.fct.2011.12.004.

[25] 趙二勞, 段晉峰. 分光光度法測定黃花菜中總黃酮[J]. 分析試驗(yàn)室, 2008, 27(9): 94-96. DOI:10.3969/j.issn.1000-0720.2008.09.025.

[26] 陳暉, 黃燕, 瞿繼蘭. 甘肅不同產(chǎn)地萱草花蕾中蘆丁、槲皮素、山柰酚的測定[J]. 藥物分析雜志, 2012(9): 1574-1577.

Determination of Four Active Compounds in Nightlily (Hemerocallis citrina) Flowers by High Performance Capillary Electrophoresis

GUO Fangfang, FENG Feng*, BAI Yunfeng, LIU Lizhen, CHEN Zezhong, ZHOU Jingqing, CAO Yudi
(College of Chemical and Environmental Engineering, Shanxi Datong University, Datong 037009, China)

An efficient high performance capillary electrophoresis (HPCE) method was developed for the determination of aloe-emodin, kaempferol, chlorogenic and quercetin in nightlily flowers (Hemerocallis citrina). Sample injection was carried out by hydrodynamic injection for 5 s at 30 kV. The running buffer was 10 mmol/L Na2B4O7-H3BO3(pH 9.15), and the detection wavelength was set at 224 nm. Four target compounds were separated in 6 min. Under these optimal conditions, the linear ranges for the above four compounds were 0.02–0.21, 0.01–0.90, 0.01–0.99, and 0.01–0.90 mg/mL with correlation coefficients between 0.997 6 and 0.999 6, and the limits of detection were 2.45 × 10-5, 1.41 × 10-5, 1.78 × 10-5and 8.63 × 10-6mg/mL (RSN= 3), respectively. The average recoveries were 97.5% to 101.2%, with a relative standard deviation (RSD) less than 4.76%. This method is fast, accurate and suitable for the detection of these active compounds in H. citrine flowers.

high performance capillary electrophoresis (HPCE); Hemerocallis citrina; quercetin

10.7506/spkx1002-6630-201604013

TS207.3

A

2015-06-20

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（21375083）

郭芳芳（1989—），女，碩士研究生，主要從事毛細(xì)管電泳研究。E-mail：13546046121@163.com

*通信作者：馮鋒（1964—），男，教授，博士，主要從事光分析化學(xué)研究。E-mail：feng-feng64@263.net