3 種食源性致病菌Tem-PCR檢測方法的建立

劉忠梅，徐義剛，曲 敏，莫春生，劉新亮，李蘇龍,（.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱 5000；.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 50076）

3 種食源性致病菌Tem-PCR檢測方法的建立

劉忠梅1，徐義剛1，曲 敏2，莫春生2，劉新亮1，李蘇龍1,*
（1.黑龍江出入境檢驗檢疫局，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150076）

應(yīng)用靶序列富集多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（t arget-enriched multiplex-polymerase chain reaction，Tem-PCR）技術(shù)建立金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌3 種食源性致病菌的快速檢測方法。分別以金黃色葡萄 球菌femA基因、沙門氏菌invA基因和志賀氏菌ipaH基因為靶基因，設(shè)計3 對特異性引物，并與通用引物連接組成Tem-PCR引物，通過反應(yīng)條件優(yōu)化，建立了Tem-PCR檢測方法。結(jié)果顯示，建立的Tem-PCR方法特異性強(qiáng)，對沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的檢測靈敏度分別為1.1×103、2×103CFU/mL和1.2×103CFU/mL。Tem-PCR檢測方法有效地解決了傳統(tǒng)多重PCR引物擴(kuò)增效率不均衡的問題。

靶序列富集多重PCR方法；沙門氏菌；金黃色葡萄球菌；志賀氏菌

沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、志賀氏菌是引起食物中毒的主要常見食源性致病菌[1-6]。目前，針對食源性致病菌檢測的主要方法有傳統(tǒng)生化鑒定法[7]、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[8-13]、PCR結(jié)合變性高效液相色譜分析法[14-19]及基因芯片法[20-21]等。傳統(tǒng)生化鑒定方法操作繁瑣、檢測時間 長，完成鑒定工作通常需要5～10 d時間，不能滿足食源性致病菌快速檢測的要求。免疫學(xué)為基礎(chǔ)建立的檢測方法，雖然檢測快速，但靈敏性差、假陽性高。PCR方法因具有檢測靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等優(yōu)點，在病原微生物的檢測中發(fā)揮了巨大的作用，成為主要采用的檢測方法[8-13]。其中多重PCR檢測通量高，可以實現(xiàn)多種致病菌的同時檢測，但建立多重PCR方法時需要反復(fù)優(yōu)化各引物對的濃度，以應(yīng)對不同引物對擴(kuò)增效率的不均衡性。

靶序列富集多重PCR（target-enriched multiplex-PCR，Tem-PCR）技術(shù)是一種新穎的多重PCR技術(shù)，引物設(shè)計與擴(kuò)增方式比較獨特，它巧妙地突破了多重PCR的瓶頸。它的原理是：首先設(shè)計一對（一條）沒有親源性通用引物，再針對每一種靶序列，設(shè)計一對特異性引物，將它與通用引物連接，構(gòu)成特異性長引物。在PCR反應(yīng)中，特異性長引物濃度極低，在最初循環(huán)中先發(fā)揮作用，富集靶序列。通用引物濃度較高，在后續(xù)循環(huán)中獨立發(fā)揮作用，保持同一擴(kuò)增效率，解決了傳統(tǒng)多重PCR中不同引物擴(kuò)增效率不均衡的難題[22-25]。本研究利用該技術(shù)，建立了同時檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的Tem-PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

實驗菌株沙門氏菌（ATCC 10708、CMCC 50004、CMCC 50115）、志賀氏菌（CMCC 51592、ATCC 12022）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（CMCC 54002）、金黃色葡萄球菌（CMCC 26003、ATCC 29213、ATCC 49444）、創(chuàng)傷弧菌（ATCC 27562）、溶藻弧菌（ATCC 17749）、霍亂弧菌（ATCC 25872）、副溶血弧菌（ATCC 17802）、腸出血性大腸桿菌O157:H7（ATCC 35150）、大腸桿菌（ATCC 25922）、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ATCC 35401）、腸侵襲性大腸桿菌（ATCC 43893）、腸致病性大腸桿菌（ATCC 43887）、阪崎腸桿菌（ATCC 51329）、空腸彎曲菌（ATCC 33560）、變形桿菌（ATCC 49027）、蠟樣芽孢桿菌（ATCC 10987）由黑龍江出入境檢驗檢疫局提供。

1.1.2 試劑

細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 北京Tiangen科技有限公司；Taq DNA聚合酶、脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP） 日本TaKaRa公司；培養(yǎng)基 北京蘭伯瑞生物技術(shù)公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計

Tem-PCR引物組由特異性長引物和通用引物組成：首先設(shè)計兩段異源性基因序列，作為通用引物（表1中劃線部分）；然后分別以金黃色葡萄球菌femA基因、沙門氏菌invA基因和志賀氏菌ipaH基因為靶基因，選擇基因保守區(qū)域設(shè)計3 對特異性引物（表1中未劃線部分），將通用引物與特異性引物連接構(gòu)成特異性長引物（表1）。引物由上海生工公司合成。

表1 Tem-PCR 引物序列Table 1 Primers designed for Tem-PCR assay

1.2.2 核酸提取

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取實驗菌株基因組DNA，具體操作詳見說明書。

1.2.3 特異性長引物濃 度優(yōu)化

反應(yīng)體系（25 μL）為：10×PCR Buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTPs 2 μL，10 μmol/L通用引物2 μL，特異性長引物終濃度分別為20、40、80 nmol/L和200 nmol/L，細(xì)菌基因組DNA模板各0.5 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.2 μL，去離子水 補(bǔ)充至25 μL。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定特異性長引物的最佳濃度。

1.2.4 Tem-PCR擴(kuò)增步 驟的優(yōu)化

分別采用二步擴(kuò)增法和三步擴(kuò)增法優(yōu)化Tem-PCR反應(yīng)條件，經(jīng)凝膠電泳檢測，以確定Tem-PCR最佳反應(yīng)條件，具體方案見表2。

表2 Tem-PCR擴(kuò)增方案Table 2 Tem-PCR protocols

1.2.5 Tem-PCR方法的簡易性評價

利用設(shè)計的3 對特異性引物（表1中未劃線部分），不經(jīng)過引物濃度優(yōu)化，直接進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增效果與Tem-PCR方法進(jìn)行比較。

1.2.6 Tem-PCR方法的靈敏度實驗

分別將菌體濃度約為2.0×108、1.1×108CFU/mL和1.2×108CFU/mL的金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌純培養(yǎng)液進(jìn)行10 倍梯度稀釋，采用試劑盒法提取每個稀釋度細(xì)菌基因組DNA，以此作為模板進(jìn)行Tem-PCR檢測，經(jīng)凝膠電泳檢測以確定該方法的靈敏度。

1.2.7 Tem-PCR方法的特異性實驗

利 用建立的Tem-PCR方法檢測1.1.1節(jié)所示菌株，以驗證本方法的特異性。

1.2.8 Tem-PCR方法的應(yīng)用

將未檢出目標(biāo)菌的豬肉、牛奶和香腸食品樣品分成兩組：一組樣品人工隨機(jī)組合污染金黃色葡萄球菌、沙門氏菌和志賀氏菌。即豬肉、牛奶和香腸3 種食品各取10 g（或mL），隨機(jī)組合加入沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的培養(yǎng)液各10 mL，然后加營養(yǎng)肉湯至100 mL，以8 000～10 000 r/min轉(zhuǎn)速均質(zhì)，以此作為模擬樣品。污染量為2 個水平：第1水平沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的污染量分別為1.1×104、2×104CFU/mL和1.2×104CFU/mL，第2水平分別為1.1×103、2×103CFU/mL和1.2×103CFU/mL。另一組樣品作為陰性對照。兩組樣品分別采用Tem-PCR法和國標(biāo)法[26-28]進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果進(jìn)行符合性驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性長引物濃度優(yōu)化

圖1 特異性長引物濃度優(yōu)化Fig.1 Optimization of the concentration of specific long primers

如圖1所示，隨著特異性長引物濃度的增加，PCR產(chǎn)物濃度逐漸增大，當(dāng)特異性長引物濃度為80 nmol/L時，3種致病菌靶基因的擴(kuò)增條帶最清晰；當(dāng)特異性長引物濃度大于80 nmol/L時，PCR擴(kuò)增效率出現(xiàn)不均衡。因此，特異性長引物最佳反應(yīng)濃度為80 nmol/L。

2.2 Tem-PCR擴(kuò)增步驟的優(yōu)化

圖2 Tem-PCR擴(kuò)增步驟的優(yōu)化Fig.2 Optimization of the Tem-PCR procedure

圖2顯示，采用三步擴(kuò)增法能夠高效地擴(kuò)增出3 條目標(biāo)帶（圖2中泳道1），而二步法只擴(kuò)增出了2 條目標(biāo)帶（圖2中泳道2）。三步擴(kuò)增法中，第1步保證了特異性引物與細(xì)菌基因組DNA模板結(jié)合，完成靶基因的初步擴(kuò)增；第2步保證了特異性長引物與初步擴(kuò)增的靶基因模板結(jié)合，完成靶基因的富集；第3步保證了通用引物與富集的模板結(jié)合，完成指數(shù)級擴(kuò)增。二步擴(kuò)增法中，由于特異性長引物與模板不能有效結(jié)合，無法發(fā)揮富集作用，擴(kuò)增出現(xiàn)不均衡。因此，Tem-PCR擴(kuò)增步驟優(yōu)化為三步法。

2.3 Tem-PCR方法的簡易性

利用3 對特異性引物，未經(jīng)引物對濃度優(yōu)化，直接進(jìn)行常規(guī)多重PCR擴(kuò)增，其擴(kuò)增效果與Tem-PCR方法進(jìn)行比較。如圖3所示，經(jīng)Tem-PCR能高效地擴(kuò)增出3 條目標(biāo)帶，而常規(guī)多重PCR方法由于未優(yōu)化引物濃度，導(dǎo)致擴(kuò)增效率不均衡：沙門氏菌擴(kuò)增條帶明顯，志賀氏菌條帶微弱，金黃色葡萄球菌則完全沒有條帶。結(jié)果證明Tem-PCR方法不用優(yōu)化不同引物對濃度，簡化了方法建立的過程。

2.4 Tem-PCR方法的檢測靈敏度

圖3 Tem-PCR方法和常規(guī)多重PCR方法擴(kuò)增效果的對比Fig.3 Comparison of the amplification results using Tem-PCR and traditional multiplex PCR

將已知菌體濃度的3 種細(xì)菌分別經(jīng)105倍稀釋后，利用建立的Tem-PCR方法均能同時有效地擴(kuò)增出3 種致病菌的靶基因片段（圖4），顯示該Tem-PCR方法檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的靈敏度分別為1.1×103、2×103CFU/mL和1.2×103CFU/mL，與傳統(tǒng)多重PCR靈敏度相當(dāng)。

圖4 Tem-PCR靈敏度Fig.4 Sensitivity of the Tem-PCR assay

2.5 Tem-PCR方法的檢測特異性

利用建立的Tem-PCR方法檢測1.1.1節(jié)所示菌株，結(jié)果顯示：沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌均為Tem-PCR陽性結(jié)果，其他為陰性結(jié)果，且未見非特異性擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，顯示了良好的檢測特異性（圖5）。

圖5 Tem-PCR方法的檢測特異性Fig.5 Specificity of the Tem-PCR assay

2.6 Tem-PCR檢測方法的實用性

采用建立的Tem-PCR方 法對金黃色葡萄球菌、志賀氏菌和沙門氏菌隨機(jī)組合污染的模擬食品樣品、對照樣品進(jìn)行檢測，結(jié)果（圖6）顯示，利用該方法能夠準(zhǔn)確地檢測出第1水平污染樣品中的致病菌，與國家標(biāo)準(zhǔn)法檢測結(jié)果相符合，其他樣品為陰性。這表明Tem-PCR方法檢測模擬污染食品的靈敏度是純培養(yǎng)液的10 倍，實際應(yīng)用時靈敏度降低了10 倍。但是只要食品污染水平高于靈敏度，該方法就具有良好的實用性。

圖6 Tem-PCR的適用性Fig.6 Applicability of Tem-PCR

3 討論與結(jié)論

Tem-PCR方法的獨特之處在于特異性長引物濃度極低，用在PCR的最初幾個循環(huán)中富集目標(biāo)序列，只有通用引物濃度很高[22]，通用引物濃度通常是特異性長引物濃度的10 倍以上。在后擴(kuò)增的幾十個循環(huán)中，所有目標(biāo)基因都采用同一引物（通用引物）進(jìn)行擴(kuò)增，所以擴(kuò)增效率相同，擴(kuò)增產(chǎn)物量相當(dāng)，解決了傳統(tǒng)多重PCR中不同引物擴(kuò)增效率不均衡問題。通用引物的高濃度使用是Tem-PCR方法的核心。

Tem-PCR方法比較簡便，相比傳統(tǒng)多重PCR，不需要調(diào)整優(yōu)化各對引物濃度。Tem-PCR方法也是一種多重PCR方法，其檢測靈敏度與傳統(tǒng)多重PCR相當(dāng)。Tem-PCR方法作為一種高通量的檢測方法，其靈敏度不及熒光PCR，擴(kuò)增時間也較長，但它可開發(fā)為熒光Tem-PCR方法。

本研究建立了同時檢測沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和志賀氏菌的Tem-PCR方法，有效地解決傳統(tǒng)多重PCR方法擴(kuò)增效率不均衡的難題，方法建立簡便實用，為食源性致病菌的高通量檢測提供了新手段。

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[27] 衛(wèi)生部. GB 4789.5—2012 食品微生物學(xué)檢驗: 志賀氏菌檢驗[S].

[28] 衛(wèi)生部. GB 4789.10—2010 食品微生物學(xué)檢驗: 金黃色葡萄球菌檢驗[S].

Development of Target-Enriched Multiplex PCR Assay for Simultaneous Detection of Three Foodborne Pathogens

LIU Zhongmei1, XU Yigang1, QU Min2, MO Chunsheng2, LIU Xinliang1, LI Sulong1,*
(1. Heilongjiang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Harbin 150001, China; 2. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150076, China)

In this study, a target-enriched multiplex PCR (Tem-PCR) assay for simultaneous detection of Salmonella, Staphylococcus aureus and Shigella was developed. Based on the S. aureus femA gene, the Salmonella invA gene and the Shigella ipaH gene, three pairs of specific primers together with a universal primer were designed. Following the optimization of reaction conditions, the Tem-PCR assay was successfu lly established. Results showed that the Tem-PCR assay was highly specific to the target bacteria with a sensitivity of 1.1 × 103CFU/mL, 2 × 103CFU/mL and 1.2 × 103CFU/mL for Salmonella, S. aureus and Shigella, respectively. The Tem-PCR assay can effectively improve the balanc e of amplification efficiencies of the primers e mployed in traditional multiplex PCR.

Tem-PCR assay; Salmonella; Staphyloc occus aureus; Shigella

10.7506/spkx1002-6630-201604033

Q789；R155.5

A

1002-6630（2016）04-0186-05

劉忠梅, 徐義剛, 曲敏, 等. 3 種食源性致病菌Tem-PCR檢測方法的建立[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(4): 186-190.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201604033. http://www.spkx.net.cn

LIU Zhongmei, XU Yigang, QU Min, et al. Development of target-enriched multiplex PCR assay for simultaneous detection of three foodborne pathogens[J]. Food Science, 2016, 37(4): 186-190. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx1002-6630-201604033. http://www.spkx.net.cn

2015-03-26

公益性行業(yè)（質(zhì)檢）科研專項（201310126）

劉忠梅（1976—），女，高級農(nóng)藝師，博士，研究方向為病原檢測。E-mail：liuzhongmei@126.com

*通信作者：李蘇龍（1966—），男，研究員，碩士，研究方向為微生物檢測。E-mail：ciqlsl@aliyun.com