野生蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲生理作用的影響研究

劉　靜，陳競適，任海姣，鄒婧澤，侯愛香

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，長沙　410128； 2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙　410128)

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野生蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲生理作用的影響研究

劉靜1，陳競適1，任海姣1，鄒婧澤2，侯愛香1

(1湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，長沙410128；2湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護學(xué)院，長沙410128)

探索了不同濃度蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲整個生命周期生物學(xué)功能的影響，對蕨菜水提液的毒理性作出合理評價。實驗以秀麗隱桿線蟲為模式生物，通過給秀麗隱桿線蟲喂食0.1 mL 6種不同濃度(0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/mL)的蕨菜水提取液，觀察不同濃度蕨菜水提取液對其生理指標(biāo)(壽命、產(chǎn)卵數(shù)、運動性、細胞凋亡)的影響。研究結(jié)果表明：蕨菜能對秀麗隱桿線蟲的生理指標(biāo)產(chǎn)生較大影響，具體表現(xiàn)為隨著蕨菜水提取液濃度增加，壽命逐漸縮短，產(chǎn)卵數(shù)逐漸減少，細胞凋亡數(shù)增加，三者均呈現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，而對運動性影響不大。

蕨菜；秀麗隱桿線蟲；壽命；產(chǎn)卵數(shù)；運動性；細胞凋亡

蕨菜為蕨科多年生草本植物，我國主要集中在西北、華北、東北和西南，湖南省的蕨類資源特別豐富。20世紀(jì)80年代初，日本科學(xué)家在蕨菜中成功分離出“原蕨苷”(ptaquiloside)，并用它來喂動物，發(fā)現(xiàn)動物出現(xiàn)骨髓功能喪失、失明等癥狀，同時在生化實驗中發(fā)現(xiàn)它還可以與氨基酸反應(yīng)，也可以破壞DNA。1999年證實蕨菜是唯一能使動物發(fā)生自然癌變的高等植物，且蕨菜中的主要致癌物質(zhì)為原蕨苷[1，2]。很多學(xué)者隨后開展了蕨菜致癌物的研究。有文獻表明，原蕨苷主要集中在蕨菜的新出現(xiàn)產(chǎn)囊絲鉤中，原蕨苷最高濃度可達到3.9 mg/g bm，最低為1.98 mg/g bm。隨著葉片的不斷生長，原蕨苷濃度會慢慢降低，但是尾狀核可留住較大濃度的有毒物質(zhì)[3]。牧場中牛羊食用暴露在地表的蕨菜后，可通過乳汁將毒性傳遞給人類，這種潛在的風(fēng)險會給人類帶來健康威脅。在此種認識下，很多人對待蕨菜的態(tài)度開始轉(zhuǎn)變，從以前的“供不應(yīng)求”到現(xiàn)在的“談蕨色變”。但上述國外文獻提到的研究調(diào)查，要么是直接喂食原蕨苷，要么是整株且長期大量采食。而蕨菜在國內(nèi)傳統(tǒng)的食用方式一般為現(xiàn)采后烹飪或腌制后烹飪，作為時令野菜佐餐采食量十分有限。且國內(nèi)外有大量對蕨菜功能物質(zhì)的提取和功能性驗證方面的研究，如蕨菜多糖、黃酮類物質(zhì)在抗氧化等方面的積極作用，如于曙光等[4]對蕨菜粗多糖清除自由基的研究，還有陳乃富[5]對蕨菜中黃酮具有良好的抗氧化活性的研究。因此如何科學(xué)采食和加工蕨菜資源成為備受爭議的問題。

秀麗隱桿線蟲是第一個基因組完全被定序的多細胞真核生物。全部編碼基因中線蟲基因組約有35%的基因與人基因組同源[6，7]?，F(xiàn)已有很多研究以秀麗隱桿線蟲為模式生物，研究作用物對其致死率、壽命長短、運動軌跡、產(chǎn)卵數(shù)等的影響，并建立了較為完善的毒物毒性評估體系，如李貞景等[8]利用秀麗隱桿線蟲的產(chǎn)卵數(shù)和致死率指標(biāo)對4種不同的中藥進行毒理性評價。本研究以秀麗隱桿線蟲為研究對象，模擬人體攝入蕨菜飲食模型，以新鮮野生蕨菜水提取液為原料，研究在不同濃度蕨菜水提取液作用下秀麗隱桿線蟲生理指標(biāo)的變化情況，從而科學(xué)直觀地評價蕨菜汁對秀麗隱桿線蟲的作用規(guī)律，為蕨菜汁開發(fā)加工的可行性提供一定的科學(xué)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與儀器

1.1.1材料新鮮野生蕨菜水提取液濃度分別為(1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 g/mL)、野生型秀麗隱桿線蟲(C.elegansthe Bristol strain N2)以及大腸桿菌OP50(EscherichiacoliOP50)均由東南大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院孔璐教授惠贈。

1.1.2試劑NGM培養(yǎng)基、LB液體培養(yǎng)基、M9緩沖液[9]、吖啶橙溶液(AO)：分析純，美國Sigma公司試劑。

1.1.3儀器電熱恒溫培養(yǎng)箱(MJX-250B-Z型，上海博迅實驗有限公司)、連續(xù)變倍體式顯微鏡(Motic SMZ-168型，麥克奧迪實業(yè)集團有限公司)、單人單面超凈工作臺(SW-CJ-1FD型，蘇州凈化儀器廠)、攪拌機(KB50SA型，佛山科順?biāo)芰想娖鲗崢I(yè)有限公司)、低速大容量多管離心機(上海安亭科學(xué)儀器廠)、生化培養(yǎng)箱(SPX-250BS-Ⅱ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.2方法

1.2.1新鮮蕨菜水提取液的制備100 g新鮮蕨菜與100 mL蒸餾水按1∶1混合榨汁5 min，汁液用8層紗布過濾，得到的濾液依照上述方法再過濾兩次至無明顯蕨菜殘渣。過濾3次后的濾液放入高速離心機中以5 000 r/min快速離心20 min，除去離心杯底濾渣得1.0 g/mL的新鮮蕨菜汁。將1.0 g/mL的蕨菜汁進行梯度稀釋，配成濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8 g/mL的蕨菜汁，121 ℃高溫高壓殺菌20 min。

1.2.2E.coliOP50的培養(yǎng)取1支E.coliOP50凍存管在37 ℃水浴加熱下速溶，轉(zhuǎn)入預(yù)先殺菌的LB液體培養(yǎng)基，在37 ℃搖床中以120 r/min的速度恒溫培養(yǎng)12 h。

1.2.3秀麗隱桿線蟲的培養(yǎng)參照Brenner S[10]方法。

1.2.4秀麗隱桿線蟲的同期化處理將處于產(chǎn)卵期間的20條秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)移至NGM平板上培養(yǎng)6～8 h后挑出，將有蟲卵的NGM平板在22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后可得到300～400條同期化線蟲。

1.2.5秀麗隱桿線蟲壽命的測定將同期化后處于L4期的秀麗隱桿線蟲轉(zhuǎn)入加有0.1 mL不同濃度蕨菜水提取液和空白實驗組(即不含蕨菜汁)的9 cm NGM培養(yǎng)基中，每組實驗樣本數(shù)為30條，每個濃度組包含3個平行組。此時記為壽命0d，此后每天探視線蟲，提供相同的培養(yǎng)環(huán)境，至線蟲死亡，記錄線蟲正常死亡的條數(shù)，除去逃跑和挑飛的線蟲條數(shù)計算得到其平均壽命。對線蟲死亡判斷標(biāo)準(zhǔn)為對外部機械性刺激無應(yīng)答。

1.2.6秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的測定將同期化后處于L4期的秀麗隱桿線蟲分別挑至不同蕨菜水提取液濃度梯度和空白實驗組的NGM培養(yǎng)基中，22 ℃給藥24 h后挑至新的只含E.coliOP50不含蕨菜原液的 NGM平板中。6個濃度實驗組包含3個平行組，每個NGM平板放置1條線蟲，放置在22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，24 h轉(zhuǎn)移1次，直至秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵期結(jié)束，統(tǒng)計每條秀麗隱桿線蟲在產(chǎn)卵期的總產(chǎn)卵數(shù)。

1.2.7秀麗隱桿線蟲運動性的測定將同期化后的L4期秀麗隱桿線蟲分別挑至含有0.1 mL不同蕨菜水提取液濃度梯度和空白實驗組的NGM培養(yǎng)基中，每個平板內(nèi)1條線蟲，保證每個濃度均含有3個平行實驗組。22 ℃給藥24 h后加入放置在顯微鏡低倍鏡頭下觀察，運動速率是指在1 min內(nèi)秀麗隱桿線蟲的頭部擺動次數(shù)，彎曲度是指在20 s內(nèi)秀麗隱桿線蟲做一個完整正弦運動的次數(shù)。

1.2.8秀麗隱桿線蟲細胞凋亡的測定準(zhǔn)備6個濃度的NGM平板，每組平板內(nèi)分別挑有20條經(jīng)同期化處理的秀麗隱桿線蟲，0.1 mL蕨菜汁劑量給藥72 h。用當(dāng)場配制的吖啶橙(75μg/mL)染色。

2　結(jié)果與討論

2.1不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲壽命影響分析

由圖1可得出，與直接喂食大腸桿菌OP50的空白組相比，涂有蕨菜汁的實驗組均對秀麗隱桿線蟲的壽命起損害作用，且這種影響呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性，即隨著蕨菜水提取液濃度的不斷升高，秀麗隱桿線蟲的壽命隨之逐漸縮短，對線蟲的致死效應(yīng)增強。出現(xiàn)這種結(jié)果，可能是線蟲作為最簡單神經(jīng)系統(tǒng)的生物之一，一定濃度的蕨菜提取液能夠?qū)€蟲的神經(jīng)系統(tǒng)造成較大的損害，神經(jīng)系統(tǒng)是指導(dǎo)其正常的生理代謝的重要結(jié)構(gòu)，神經(jīng)系統(tǒng)的損害使正常代謝失去控制，造成代謝紊亂，縮短線蟲的壽命。在1.0 g/mL蕨菜汁培養(yǎng)下的秀麗隱桿線蟲壽命時間降低率為25.91%，說明高濃度的蕨菜水提取液具有較強的致死效應(yīng)。

圖1　不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲壽命的影響　　注：組分間用不同字母表示差異性顯著(P<0.05)；組分之間有1個字母相同則表示差異性不顯著，下同。

2.2不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響分析

由圖2可看出，在不同濃度蕨菜水提取液喂養(yǎng)下，秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)均低于空白實驗組，說明秀麗隱桿線蟲的生殖能力受一定濃度的蕨菜水提取液影響，隨著蕨菜水提取液濃度的增加，該種損傷影響逐步增強。秀麗隱桿線蟲體內(nèi)染色體對數(shù)較少，有5對常染色體和1對性染色體，染色體數(shù)目相對較少，在一定蕨菜提取液的作用下能夠?qū)π匀旧w造成較大的傷害，可能導(dǎo)致部分生殖功能受損。且易得出在1.0 g/mL的最高給藥濃度下，對生殖能力的損害作用最強。

圖2　不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵數(shù)的影響結(jié)果

2.3不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲運動性的影響分析

由圖3、4可以看出，雖然彎曲度和運動速率有些起伏，但整體在均值上下浮動，可認為蕨菜汁對秀麗隱桿線蟲的運動性沒有顯著影響，沒有濃度依賴性的規(guī)律特征出現(xiàn)?？梢哉J為線蟲通過消化道攝入蕨菜提取液，而線蟲的運動主要是通過表皮收縮實現(xiàn)，因此并未對線蟲的運動功能產(chǎn)生影響。

圖3　為不同濃度蕨菜水提取液液對秀麗隱桿線蟲運動速率的影響結(jié)果

圖4　為不同濃度蕨菜水提取液液對秀麗隱桿線蟲彎曲度的影響結(jié)果

2.4不同濃度蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲細胞凋亡的影響分析

由于DNA斷裂而增加的凋亡細胞經(jīng)吖啶橙染色處理后呈現(xiàn)黃色或橙色，正常細胞呈綠色，在熒光倒置顯微鏡下可觀察到明顯的綠色正常細胞[11]。由圖5 a-f可觀察出圖a綠光最強，隨著蕨菜水提取液濃度的不斷升高，綠光強度越來越弱，即秀麗隱桿線蟲體內(nèi)正常細胞越來越少，說明可能蕨菜提取液中存在某些促使線蟲DNA斷裂的毒性物質(zhì)，通過影響控制細胞凋亡的基因，來增加凋亡細胞數(shù)，從而縮短線蟲的壽命。與空白組對比，喂養(yǎng)蕨菜水提取液的線蟲綠光明顯較弱，凋亡細胞越來越多，呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。在1.0 g/mL濃度下，綠光強度最弱，蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲的毒害作用達到最強。

0.0 g/mL

0.2 g/mL

0.4 g/mL

0.6 g/mL

0.8 g/mL

1.0 g/mL

3　討論與分析

3.1蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲壽命、產(chǎn)卵數(shù)和運動性的影響

國內(nèi)已有多位學(xué)者對蕨菜進行了深加工、功能性成分的提取和驗證等方面的實驗。許文濤等[12]通過調(diào)整不同的料水比、提取溫度和提取時間，結(jié)合響應(yīng)曲面法得出了蕨菜多糖的優(yōu)化提取參數(shù)，黃建韶等通過研究不同pH、溫度、底物濃度、抑制劑條件下對蕨菜中多酚氧化酶作用的影響來抑制蕨菜的褐變[13]。國外也有研究證明牛的上消化道的鱗狀細胞癌與蕨菜的慢性毒性有關(guān)[14]。

本研究所使用的蕨菜水提液為多物質(zhì)混合物，即整株蕨菜榨汁去渣水提所得，從研究看來，在低濃度范圍下，蕨菜汁對秀麗隱桿線蟲的影響不大，如在0.2 g/mL濃度下，運動性幾乎無變化，壽命和產(chǎn)卵數(shù)的影響也不大。但隨著濃度增加，壽命和產(chǎn)卵數(shù)均呈現(xiàn)較為明顯的下降，在1.0 g/mL的最高濃度下較空白實驗組下降百分比分別為25.91%和76.34%。所以采食要注意量的把握，過量會對人體產(chǎn)生較大的損害，但對有毒物質(zhì)在水溶液中所占的具體百分比還有待下一步研究。在對運動性的研究中，不同濃度蕨菜水提取液并未對秀麗隱桿線蟲的運動系統(tǒng)功能產(chǎn)生影響，可能是蕨菜水提取液通過消化道被吸收到線蟲體內(nèi)，并未對線蟲運動系統(tǒng)造成損害，從而不能引起其運動能力的降低。但是在對秀麗隱桿線蟲壽命和產(chǎn)卵數(shù)的研究中，二指標(biāo)均在高濃度蕨菜水提取液的作用下，較空白組降低幅度較大，說明蕨菜水提取液可以損害秀麗隱桿線蟲細胞內(nèi)的基因結(jié)構(gòu)，對生殖能力的損害更為顯著，且毒理性作用呈現(xiàn)較為明顯的濃度依賴特征。

3.2蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲細胞凋亡的影響

秀麗隱桿線蟲體內(nèi)的細胞凋亡水平隨著蕨菜水提取液濃度的增加而提高，喂有1.0 g/mL蕨菜汁的實驗組內(nèi)細胞凋亡水平達到最高。細胞凋亡是主動過程，它是通過激活一系列基因進行表達以及調(diào)控，從而爭取主動死亡的過程。在高濃度蕨菜水提取液下，細胞主動死亡的過程加強說明蕨菜中的某些物質(zhì)可能刺激到秀麗隱桿線蟲的細胞凋亡基因從而實現(xiàn)大部分細胞程序性死亡的現(xiàn)象。在分子層面上隨著蕨菜水提取液濃度增加，細胞凋亡數(shù)增多，更好地印證了在個體層面上壽命縮短的情況，由圖五的綠色熒光強度即可看出，正常細胞越多，綠色熒光越強，反之則說明體內(nèi)正常細胞較少。在1.0 g/mL蕨菜水提取液濃度喂養(yǎng)下的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)綠色熒光強度達到最低，代表此時線蟲體內(nèi)凋亡細胞數(shù)最多。結(jié)合個體層面上，秀麗隱桿線蟲在不同濃度蕨菜水提取液飼養(yǎng)情況下壽命和產(chǎn)卵數(shù)的變化，其作用規(guī)律表現(xiàn)出較為顯著的濃度依賴性，可以說明蕨菜水提取液能夠作用于線蟲細胞的凋亡信號通路從而實現(xiàn)促進凋亡、縮短壽命的毒性功能。同時產(chǎn)卵數(shù)的減少可能是蕨菜水提取液對秀麗隱桿線蟲的生殖腺細胞產(chǎn)生了影響，導(dǎo)致大批量生殖腺細胞開始程序性死亡從而無法進行產(chǎn)卵行為的結(jié)果。但本實驗對蕨菜中有毒理性作用的物質(zhì)并未進行深入探究，可以作為未來的研究方向，使蕨菜得到更為合理的利用與發(fā)展。

4　結(jié)論

本研究模擬人類飲食習(xí)慣，將蕨菜加水整株榨汁后，以其水提液喂養(yǎng)秀麗隱桿線蟲，試驗結(jié)果顯示，這樣處理的蕨菜水提液對秀麗隱桿線蟲的生殖系統(tǒng)和細胞凋亡機制都有一定的影響。一方面，對蕨菜僅采取去除根部的加工或食用方法，輔以高溫殺菌或高溫烹飪也未能有效去除蕨菜的有毒物質(zhì)，原蕨苷等其他有毒物質(zhì)不可避免地被攝入；另一方面，對蕨菜采用榨汁水提處理的方式，也并未有效去除原蕨苷等有害物質(zhì)，說明部分有害物質(zhì)可能為水溶性的。因此，在后續(xù)的研究中，可采取去除根和蕨菜產(chǎn)囊絲鉤部分的蕨菜榨汁水提，進一步研究蕨菜的處理方式和毒理特性之間的聯(lián)系?！?/p>

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(責(zé)任編輯李燕妮)

Physiological Effects of Wild Pteridium aquilinum Water Extract on Caenorhabditis elegans

LIU Jing1，CHEN Jing-shi1，REN Hai-jiao1，ZOU Jing-ze2，HOU Ai-xiang1

(1College of Food Science and Technology，Hunan Agricutural University，Changsha 410128，China；2College of Plant Protection，Hunan Agricutural University，Changsha 410128，China)

To investigate the effect of different concentrations ofPteridiumaqulinumionCaenorhabditiselegansin the whole life，macle a proper comment on the toxic properties of it.This experiment selectedCaenorhabditiselegansas a model organism in order to find the impact of different concentrations ofPteridiumaqulinumion the physiological(life-span，eggs laying，motility，apoptosis)signs ofCaenorhabditiselegansby feeding the volume of 0.1 mL from six kinds of concentrations which were 0.0，0.2，0.4，0.6，0.8 and 1.0 g/mL respectively.The results showed thatPteridiumaqulinumiexactly had the capability of affecting the index of physiological.With the rising concentration，mean life-span decreased，reproductive output decreased and apoptosis increased were observed，all the changes appeared in concentration-dependent，but there came to be ineffective about its apoptosis.

Pteridiumaqulinumi；Caenorhabditiselegans；life-span；eggs laying；motility；apoptosis

湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)2015年大學(xué)生創(chuàng)新性實驗項目(項目編號：XCX1519)。

劉靜(1996—)，女，在讀本科，研究方向：食品微生物技術(shù)。

侯愛香(1982—)，女，講師，研究方向：食品微生物技術(shù)。