HPLC法測(cè)定黨參中煙酸和黨參炔苷的含量＊

高歡，李陽(yáng)，閆輝，李燦，呂青濤，容蓉

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355）

HPLC法測(cè)定黨參中煙酸和黨參炔苷的含量＊

高歡，李陽(yáng)，閆輝，李燦，呂青濤，容蓉

（山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250355）

建立HPLC法同時(shí)測(cè)定黨參中煙酸及黨參炔苷含量的方法。采用Syncronis AQ色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）作流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，流量為1 mL/min，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為285 nm，柱溫為30 ℃，煙酸和黨參炔苷可在24 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)與其它成分良好分離。煙酸的質(zhì)量濃度在9.6～57.6 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 2），檢出限為0.94 μg/mL，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%（n=6），平均加標(biāo)回收率為99.5%；黨參炔苷的質(zhì)量濃度在9.92～59.52 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 6），檢出限為0.12 μg/mL，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.9%（n=6），平均加標(biāo)回收率為101.1%。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性，可作為黨參中煙酸、黨參炔苷測(cè)定的有效方法。

黨參；煙酸；黨參炔苷；HPLC

黨參（Codonopsis Radix）是臨床常用中藥材，《中華人民共和國(guó)藥典》2015版收載的黨參主要有桔梗科植物黨參、素花黨參或川黨參3種［1］。黨參有補(bǔ)中益氣，健脾益肺之功效，主治脾肺虛弱，氣短心悸，食少便溏，虛喘咳嗽，內(nèi)熱消渴等癥，是人參的替代品［2］?，F(xiàn)代藥理研究表明，黨參有治療冠心病、高血脂癥，調(diào)節(jié)胃腸功能，抗?jié)儯鰪?qiáng)機(jī)體免疫力，抗缺氧，抗腫瘤，抗衰老等方面的藥理作用［3-7］。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黨參中主要有聚炔類、三萜、甾類、有機(jī)酸、苯丙素類、倍半萜、黃酮、生物堿等多種化學(xué)成分［8-9］。

煙酸為水溶性B族維生素，對(duì)于由低密度脂蛋白膽固醇增多和高密度脂蛋白膽固醇減少所導(dǎo)致的血脂異常有治療效果［10］，可以減少冠心病死亡率［11］，減緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)程，降低心血管疾病的發(fā)生率和死亡率［12］。這與黨參的傳統(tǒng)中醫(yī)臨床應(yīng)用及現(xiàn)代藥理研究一致，可見(jiàn)煙酸是黨參中重要的有效成分。黨參炔苷具有抗氧化、抗?jié)?、激活NF-kB等藥理活性［13-15］，與傳統(tǒng)中醫(yī)用藥相符合。黨參炔苷在不同產(chǎn)地黨參中含量均較高，有很好的專屬性和特征性，藥典將黨參炔苷作為黨參質(zhì)量標(biāo)志性成分［16-17］。目前，對(duì)黨參中黨參炔苷的HPLC含量測(cè)定方法和煙酸的高效毛細(xì)管電泳測(cè)定方法已有文獻(xiàn)報(bào)道［17-18］，但黨參中煙酸的HPLC含量測(cè)定方法尚未建立。筆者首次建立了同時(shí)測(cè)定黨參中煙酸和黨參炔苷含量的HPLC方法，該方法測(cè)定黨參中煙酸與文獻(xiàn)［18］方法相比，分離度更好，基線平穩(wěn)，峰形良好。雖然高效液相色譜法和高效毛細(xì)管電泳法都能在較短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)黨參中煙酸的分離，但由于毛細(xì)管直徑小使光路太短導(dǎo)致用紫外吸收光譜法時(shí)靈敏度較低且電滲會(huì)因樣品組成而變化進(jìn)而影響分離重現(xiàn)性，相對(duì)而言高效液相色譜法有更好的靈敏度和重現(xiàn)性，更適用于定量分析。筆者對(duì)8批黨參藥材中兩種成分的含量進(jìn)行了測(cè)定，為黨參的質(zhì)量控制和開(kāi)發(fā)利用提供了參考依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)部分

1.1主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Waters e2695型，附帶Waters 2998 PDA檢測(cè)器、在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱，美國(guó)沃特世公司；

電子天平：AE240型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒公司；

煙酸、黨參炔苷對(duì)照品：純度均大于98%，批號(hào)分別為D-026-150728，Y-062-150801，成都瑞芬思生物科技有限公司；

乙腈：特級(jí)色譜純，湖北昌泰興業(yè)科技有限公司；

磷酸：色譜純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

實(shí)驗(yàn)所用其它試劑均為分析純；

實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

1.2對(duì)照品溶液的制備

分別精密稱取煙酸、黨參炔苷對(duì)照品適量，以純水溶解并定容至25 mL容量瓶中，得到煙酸、黨參炔苷質(zhì)量濃度分別為480，496 μg/mL的對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述溶液各1 mL于10 mL量瓶中，得煙酸、黨參炔苷質(zhì)量濃度分別為48，49.6 μg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密量取上述對(duì)照品儲(chǔ)備液各2 mL，于10 mL量瓶中配制成煙酸、黨參炔苷的混合對(duì)照品溶液，質(zhì)量濃度分別為96，99.2 μg/mL。

1.3供試品溶液的制備

精密稱取黨參藥材粉末1 g（過(guò)450 μm孔徑篩），置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇80 mL，密塞，稱量，超聲提取30 min（45℃，200 W，40 kHz），放冷，再次稱量，用甲醇補(bǔ)足減少的質(zhì)量，搖勻，濾過(guò)。精密量取濾液50 mL，蒸干，殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至標(biāo)線，搖勻。用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取濾液作為供試品溶液。

1.4色譜條件

色譜柱：Syncronis AQ柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0～6 min，0%～3% A；6～15 min，3%～25% A；15～24 min，25%～28% A）；流量：1 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：285 nm；進(jìn)樣體積：20 μL。

1.5色譜圖

在1.4色譜條件下，對(duì)混合對(duì)照品溶液及供試品（批號(hào)為20150301）溶液進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖1、圖2。

圖2　供試品液相色譜圖

2　結(jié)果與討論

2.1提取條件的優(yōu)化

以煙酸、黨參炔苷的含量為指標(biāo)，進(jìn)行了黨參的提取條件考察，分別考察了30，45，60℃下的提取效率，結(jié)果顯示在45℃下提取效率高?？疾炝?0，60 min的提取效率，差別不明顯，為節(jié)約時(shí)間提取時(shí)間選擇30 min。最終選擇用100%甲醇在45℃下超聲提取30 min。

2.2檢測(cè)波長(zhǎng)的考察

采用PDA檢測(cè)器在210～400 nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，采集光譜圖。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在285 nm時(shí)煙酸和黨參炔苷的色譜峰面積都相對(duì)較高，色譜峰形和分離度良好，基線平穩(wěn)，因此選擇285 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.3流動(dòng)相的選擇

為實(shí)現(xiàn)多組分的良好分離，實(shí)驗(yàn)考察了等度洗脫和梯度洗脫，并分別比較了甲醇-0.2%磷酸水溶液、乙腈-水、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.2%甲酸水溶液、乙腈-0.2%乙酸水溶液5種流動(dòng)相系統(tǒng)，最終以乙腈-0.2%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫（0～6 min，0%～3% A；6～15 min，3%～25% A；15～24 min，25%～28% A），樣品的分離度高、基線平穩(wěn)，各指標(biāo)峰峰形良好，重復(fù)性良好。

2.4色譜柱的選擇

煙酸極性較大，為實(shí)現(xiàn)較好分離，對(duì)Syncronis AQ色譜柱和ZORBAX SB C18色譜柱進(jìn)行了考察。當(dāng)采用水性柱Syncronis AQ色譜柱時(shí)，能夠使用含水比例更高的流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，色譜圖基線平穩(wěn)、分離度高、峰形良好。

2.5線性方程和檢出限

分別精密吸取煙酸和黨參炔苷混合對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，置于10 mL容量瓶中，用超純水稀釋定容，制成含煙酸分別為9.6，19.2，28.8，38.4，48，57.6 μg/mL，含黨參炔苷分別為9.92，19.84，29.6，39.68，49.6，59.52 μg/mL的系列混合對(duì)照品工作溶液。以質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，以峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸，得線性方程及線性范圍，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，煙酸和黨參炔苷的線性范圍較寬、線性擬合較好，均能滿足分析要求，可以準(zhǔn)確定量。分別精密量取煙酸和黨參炔苷對(duì)照品溶液，逐步稀釋，按1.4色譜條件進(jìn)行測(cè)定，至信噪比S/N≥3，此時(shí)進(jìn)樣濃度即為對(duì)照品的檢出限，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，檢出限能夠滿足分析要求。

表1　線性方程、線性范圍及檢出限

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一供試品溶液（產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)為20150301），分別于0，2，4，8，12，24 h進(jìn)樣，在1.4色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄煙酸和黨參炔苷的色譜峰峰面積，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，煙酸和黨參炔苷測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.9%，1.0%，說(shuō)明該樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2　穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.7重現(xiàn)性試驗(yàn)

精密稱取同一批號(hào)黨參粉末（產(chǎn)地：甘肅；批號(hào)：20150301，過(guò)450 μm篩）共6份，每份1 g，按1.3方法制備供試品溶液，在1.4色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，記錄煙酸和黨參炔苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　重現(xiàn)性試驗(yàn)結(jié)果

由表3可知，藥材中煙酸和黨參炔苷平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.181 4，0.347 3 mg/g，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.4%，2.3%，說(shuō)明該方法重現(xiàn)性良好。

2.8加標(biāo)回收試驗(yàn)

稱取同一批號(hào)黨參粉末（產(chǎn)地：甘肅，批號(hào)為20150301，過(guò)450 μm篩）共6份，每份0.5 g，精密稱定，分別精密加入適量煙酸和黨參炔苷對(duì)照品溶液，按1.3方法制備供試品溶液，在1.4色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知，煙酸和黨參炔苷的平均回收率分別為99.5%和101.1%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.5%和1.9%（n=6），表明該方法具有較高的準(zhǔn)確度和良好的精密度。

表4　黨參中煙酸和黨參炔苷的加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

2.9樣品測(cè)定

精密稱取8批不同產(chǎn)地和批次的黨參藥材，按1.3制備供試品溶液，按照1.4色譜條件測(cè)定煙酸和黨參炔苷的色譜峰面積，計(jì)算樣品中二者的含量，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，不同產(chǎn)地和批號(hào)的黨參中煙酸、黨參炔苷含量差異較大，甘肅產(chǎn)黨參的煙酸、黨參炔苷含量較高。

3　結(jié)語(yǔ)

采用100%甲醇超聲提取，建立了HPLC法測(cè)定黨參中煙酸、黨參炔苷含量的分析方法。優(yōu)化了色譜條件，在選擇的最佳測(cè)試條件下，該方法的線性范圍、檢出限、精密度、穩(wěn)定性及重復(fù)性均能滿足檢測(cè)要求。該法能快速、準(zhǔn)確地測(cè)定黨參中煙酸、黨參炔苷的含量，對(duì)于黨參的質(zhì)量控制及開(kāi)發(fā)利用具有重要價(jià)值。

表5　黨參藥材中煙酸和黨參炔苷含量測(cè)定結(jié)果（n=3）

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2015年便攜分析儀器市場(chǎng)規(guī)模為81億美元

根據(jù)一家調(diào)查公司最新發(fā)布的一項(xiàng)關(guān)于便攜式分析儀器的市場(chǎng)研究報(bào)告顯示，2015年該市場(chǎng)的規(guī)模為81億美元，2020年將達(dá)到95.5億美元；2015～2020年間的年均復(fù)合增長(zhǎng)率為3.3%。

對(duì)于食品和環(huán)境問(wèn)題更加關(guān)注，低成本、易于操作的便攜式分析儀器的實(shí)用性不斷增強(qiáng)，醫(yī)療保健支出費(fèi)用的日漸增加，這些是驅(qū)動(dòng)便攜式分析儀器市場(chǎng)發(fā)展的主要因素。

便攜式分析儀器市場(chǎng)按照產(chǎn)品、技術(shù)和最終用戶進(jìn)行了細(xì)分。細(xì)分產(chǎn)品市場(chǎng)包括TOC分析儀、溶解氧、滴定儀、折射儀、pH計(jì)、光度計(jì)、氣體分析儀、電導(dǎo)率/電阻率、比色計(jì)、熱分析儀等。由于pH計(jì)廣泛應(yīng)用于化工、醫(yī)藥、生物技術(shù)、食品飲料、水測(cè)試、石油化工和造紙等行業(yè)，其預(yù)計(jì)將占有最大市場(chǎng)份額，并將以最高的年復(fù)合增長(zhǎng)率增長(zhǎng)。

按照技術(shù)進(jìn)行劃分，便攜式分析儀器市場(chǎng)可以分為光譜分析、元素分析、熱分析和電化學(xué)分析等。光譜分析可以進(jìn)一步子分為X射線熒光（XRF）、近紅外光譜（NIR）、拉曼光譜、傅里葉變換紅外光譜（FTIR）、激光誘導(dǎo)擊穿光譜（LIBS）、離子遷移光譜和光譜成像等。相比其它紅外光譜，預(yù)計(jì)FTIR將是增長(zhǎng)最快的，因?yàn)樗哂懈叩木群头直媛?、更短的掃描時(shí)間以及更廣泛的掃描范圍。

便攜式分析儀器的最終用戶包括本食品飲料工業(yè)、制藥、生物技術(shù)、環(huán)境檢測(cè)、學(xué)術(shù)和政府機(jī)構(gòu)等。2015年食品飲料行業(yè)主宰了便攜式分析儀器市場(chǎng)，原因是越來(lái)越多的便攜式分析儀器應(yīng)用于食品安全檢測(cè)領(lǐng)域。

便攜式分析儀器的區(qū)域性市場(chǎng)分為北美、歐洲、亞太及其他地區(qū)。北美地區(qū)市場(chǎng)又可進(jìn)一步細(xì)分為美國(guó)和加拿大市場(chǎng)。2015年北美占據(jù)了這一市場(chǎng)的最大份額，而亞太地區(qū)則以最高速度增長(zhǎng)。隨著亞太地區(qū)不斷增加對(duì)糧食、環(huán)境、藥品安全的關(guān)注，這一地區(qū)對(duì)便攜式分析儀器的需求預(yù)計(jì)將增長(zhǎng)，這將使一些便攜分析儀器供應(yīng)商擴(kuò)大其在這一地區(qū)的市場(chǎng)存在，同樣，這將促進(jìn)該地區(qū)便攜式分析儀器市場(chǎng)的發(fā)展。

（儀器信息網(wǎng)）

Determination of Nicotinic Acid and Lobetyolin in Codonopsis Pilosula by HPLC

Gao Huan， Li Yang， Yan Hui， Li Can， Lyu Qingtao， Rong Rong
（Shandong University of Traditional Chinese Medicine， Jinan 250355， China）

A HPLC method was established for the determination of nicotinic acid and lobetyolin in Codonopsis pilosula. A Syncronis AQ column （250 mm×4.6 mm，5 μm） was used with acetonitrile （A）-0.2% phosphoric acid solution （B） as the mobile phase at the flow rate of 1 mL/min，the detection wavelength was set at 285 nm and the column temperature was kept at 30℃. The results showed that nicotinic acid and lobetyolin could be separated within 24 min. The mass concentration of nicotinic acid had good linearity with chromatographic peak area in the range of 9.6-57.6 μg/mL（r=0.999 2）， and the detection limit was 0.94 μg/mL，the relative standard deviation of determination results was 1.5%（n=6），the average recovery was 99.5%. The mass concentration of lobetyolin had good linearity with chromatographic peak area in the range of 9.92-59.52 μg/mL （r=0.999 6）， and the detection limit was 0.12 μg/mL，the relative standard deviation of determination results was 1.9%（n=6），the average recovery was 101.1%. The method is convenient，rapid，accurate，which can be applied to the determination of nicotinic acid and lobetyolin in Codonopsis pilosula.

Codonopsis pilosula； nicotinic acid； lobetyolin； HPLC

O657.7

A

1008-6145（2016）03-0016-04

10.3969/j.issn.1008-6145.2016.03.004

*科技部“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)（2014ZX09509001-001）；山東省高校中醫(yī)藥抗病毒協(xié)同創(chuàng)新中心（XTCX2014C01-02）

聯(lián)系人：容蓉；E-mail∶ rong_sdutcm@hotmail.com

2016-03-25