楊艷華，林素靜，劉西京，杜 斌

（1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055）

長(zhǎng)裂苦苣菜萃取物對(duì)胰島素抵抗 HepG2
細(xì)胞糖代謝的影響*

楊艷華1，2，林素靜2*，劉西京2，杜 斌1

（1.鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450001；2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳 518055）

使用高濃度胰島素來誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞，使之出現(xiàn)葡萄糖代謝的異常，以此建造胰島素抵抗HepG2/IR細(xì)胞模型，利用葡萄糖測(cè)定試劑盒檢測(cè)長(zhǎng)裂苦苣菜石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位組葡萄糖消耗量，研究長(zhǎng)裂苦苣菜不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型糖代謝的影響.結(jié)果顯示，10-6mol/L濃度的胰島素誘導(dǎo)處理HepG2細(xì)胞24 h是產(chǎn)生胰島素抵抗的最佳條件；與HepG2/IR模型組相比，各萃取部位均可以改善HepG2/IR細(xì)胞的葡萄糖消耗情況，以乙酸乙酯部位效果最佳.結(jié)果表明長(zhǎng)裂苦苣菜提取物有一定的改善胰島素抵抗的作用.

長(zhǎng)裂苦苣菜；胰島素抵抗；HepG2細(xì)胞；葡萄糖消耗量

糖尿?。╠iabetes mellitus，DM）患者中超過90%為Ⅱ型糖尿?。═ype 2 diabetes mellitus， T2DM），其顯著的病理生理學(xué)特征為胰島素調(diào)節(jié)與控制葡萄糖代謝能力的下降，即胰島素抵抗（Insulin Resistance, IR）[1].HepG2 細(xì)胞存在于動(dòng)物肝細(xì)胞，其肝胚胎瘤細(xì)胞株的表型與肝細(xì)胞很相似，HepG2 細(xì)胞中的胰島素受體數(shù)目在高劑量的胰島素條件下呈下降趨勢(shì)，且下降程度與刺激持續(xù)時(shí)間及胰島素劑量呈正相關(guān).因此，以HepG2細(xì)胞模型來研究體外胰島素抵抗機(jī)制和降糖活性物質(zhì)篩選是理想d的選擇[2-3].

長(zhǎng)裂苦苣菜（ Sonchus brachyotus DC.）又名苦菜、苦曲菜、苦曲曲、苦苣菜、苣荬菜、苦荬菜等，具有清熱解毒、涼血止血之功，常用于治療急性咽炎、急性痢疾、闌尾炎、腸炎、痔瘡腫痛等[4-6].研究表明，長(zhǎng)裂苦苣菜具有降糖、抗菌、降壓和降膽固醇、抗心律失常、抗腫瘤、保肝、抗炎、清除自由基等作用[4-8].本文以人肝癌細(xì)胞HepG2建立胰島素抵抗模型，探究長(zhǎng)裂苦苣菜不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗 HepG2 細(xì)胞糖代謝的影響.

1 材 料

1.1 藥品與試劑

長(zhǎng)裂苦苣菜（ Sonchus brachyotus DC.）采自蘭州郊區(qū)； DMEM高糖培養(yǎng)基（Corning公司）；胰酶、四氮甲唑藍(lán)（MTT）、胎牛血清（Gibco公司）；二甲基亞砜（DMSO）、乙醇（分析純）、鹽酸二甲雙胍（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)：S16O5G1）；精蛋白生物合成人胰島素注射液（規(guī)格400IU/10mL/支，諾和諾德中國制藥有限公司，批號(hào)：EVG2553）；葡萄糖測(cè)定試劑盒（上海榮盛生物藥業(yè)有限公司）；磷酸鹽緩沖液（PBS），D-Hank’s溶液.

1.2 儀器

DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋（鄭州南北儀器設(shè)備有限公司）；Milli-Q超純水機(jī)（Milipore）；4001 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph）；HERA cell 240 型CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo）；DM IRB 型熒光倒置顯微鏡（德國Leica ）；BHC-ⅡA2系列生物安全柜（蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司）； 電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；SS-325高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械有限公司）；Multiskan MK3 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Thermo）；BS224s電子天平（德國賽多利斯）；可調(diào)式移液器（Eppendorf）；細(xì)胞培養(yǎng)瓶（25cm2）、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板（美國Corning公司）.

1.3 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞株HepG2，由深圳市大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)和細(xì)胞資源庫技術(shù)平臺(tái)王妍教授饋贈(zèng).將HepG2細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度設(shè)定37℃，培養(yǎng)基放置在5% CO2培養(yǎng)箱中.傳代間隔為2～3天1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn).

2 方 法

2.1 樣品制備與溶液配制

2.1.1 樣品制備

取長(zhǎng)裂苦苣菜全草粉碎，過10目篩(2.0 mm)，稱取60g，70%乙醇回流提取3次，每次1h，合并濾液，減壓回收溶劑，所得浸膏加蒸餾水溶解混懸，分別用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇進(jìn)行萃取，隨后減壓回收各有機(jī)溶劑，并于60℃烘干，即得不同提取部位，得率分別是0.45%、1.12%和3.25%.精密稱量，用完全培養(yǎng)液分別配成0.001、0.01、0.1、0.25 mg/mL備用.

2.1.2 配制完全培養(yǎng)液

取胎牛血清和DMEM高糖培養(yǎng)液按照1: 9比例配置完全培養(yǎng)液.

2.2 胰島素濃度對(duì)胰島素抵抗細(xì)胞模型的影響考察

使用完全培養(yǎng)基將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞進(jìn)行稀釋，設(shè)定細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/mL，將其接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)，單孔200 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中.當(dāng)細(xì)胞貼壁達(dá)瓶底80%時(shí)，棄上清液，以D-Hank’s液清洗2次，加入新鮮調(diào)配的含10-6，10-7，10-8，10-9mol/L胰島素的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞，每孔200 μL，一組3個(gè)復(fù)孔，并設(shè)正常培養(yǎng)細(xì)胞的平行對(duì)照組.培養(yǎng)時(shí)間24h，取各組的細(xì)胞上清液，以葡萄糖氧化酶法依次測(cè)定各組的葡萄糖含量，同時(shí)觀察記錄細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化.

2.3 胰島素抵抗細(xì)胞模型時(shí)間影響考察

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，同2.2項(xiàng)下方法培養(yǎng)細(xì)胞，加入10-6mol/L的胰島素后，各組于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)8、12、24、36和48 h，取各組的細(xì)胞上清液，用葡萄糖氧化酶法依次測(cè)定每組的葡萄糖含量，同時(shí)觀察記錄細(xì)胞在顯微鏡下的形態(tài)學(xué)變化.

通過上述試驗(yàn)選取最優(yōu)的胰島素作用時(shí)間和胰島素濃度，建立適宜的HepG2 胰島素抵抗細(xì)胞模型.

2.4 不同濃度各萃取物對(duì)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗的影響

根據(jù)上述考察參數(shù)建立HepG2細(xì)胞胰島素抵抗模型，設(shè)置二甲雙胍濃度梯度組、胰島素抵抗模型組、正常對(duì)照組和萃取部位石油醚、乙酸乙酯、正丁醇濃度梯度組，其中空白組不接種細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔.正常對(duì)照組每孔各加完全培養(yǎng)液200μL，胰島素抵抗模型組加10-6mol/L胰島素的完全培養(yǎng)液200 μL/孔，其余給藥組每孔分別加入不同濃度溶液200 μL，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).24h后取各組上清培養(yǎng)液，以葡萄糖氧化酶法測(cè)定其葡萄糖含量.隨后移出上清培養(yǎng)液，每孔加入180 μL完全培養(yǎng)液和20 μL 0.5% MTT，培養(yǎng)4h，將培養(yǎng)液吸棄，每孔加入150 μL DMSO，震搖10 min，于490 nm處用酶標(biāo)儀測(cè)OD值.

2.5 計(jì)算

葡萄糖消耗量（mmol/L）=對(duì)照組葡萄糖含量-給藥組葡萄糖含量.

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

3 結(jié) 果

3.1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1，可見隨著胰島素濃度的增大，葡萄糖消耗率越來越大，但當(dāng)濃度達(dá)到10-6mol/L時(shí)，葡萄糖消耗率突然下降，幾乎與正常對(duì)照組一致，說明在較低濃度范圍時(shí)，胰島素對(duì)葡萄糖的消耗具有一定的促進(jìn)作用，當(dāng)達(dá)到一定量時(shí)，導(dǎo)致了胰島素抵抗，細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗急劇降低.當(dāng)胰島素濃度在10-6mol/L時(shí)，胰島素誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞胰島素抵抗程度達(dá)到最大.倒置顯微鏡下觀察，正常組HepG2細(xì)胞為菱形或梭形的貼壁細(xì)胞，與典型的腫瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征相似，10-6mol/L濃度模型組細(xì)胞邊緣變成稍圓形，說明高濃度胰島素對(duì)HepG2的活性有一定的抑制作用.

3.2 胰島素作用不同時(shí)間對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響

加入10-6mol/L的胰島素完全培養(yǎng)液，分別作用8、12、24、36、48h，測(cè)得細(xì)胞葡萄糖消耗情況見表2.根據(jù)結(jié)果可知，在最初達(dá)到12h時(shí)，胰島素對(duì)HepG2的葡萄糖消耗率達(dá)到了最大，為41.58%，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，葡萄糖消耗率逐漸降低，在24、36、48h分別為20.29%、17.33%、8.98%，說明在24h小時(shí)已開始出現(xiàn)胰島素抵抗，故本實(shí)驗(yàn)建立胰島素抵抗模型中最佳胰島素濃度為10-6mol/L，最佳作用時(shí)間為24h.

3.3 不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測(cè)結(jié)果

由結(jié)果可知，正常組（p<0.05）單位細(xì)胞葡萄糖消耗量明顯高于模型組，說明胰島素抵抗HepG2細(xì)胞模型建立成功.另一方面，MTT檢測(cè)的OD值卻顯著降低（p<0.05），說明高濃度的胰島素對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生了一定的毒性，這也可能是導(dǎo)致模型組葡萄糖消耗量下降的原因之一.與HepG2/IR 模型組相比較，二甲雙胍不同濃度作用于模型細(xì)胞后，模型細(xì)胞的葡萄糖消耗量均有不同程度增加，其中葡萄糖消耗量最多的是0.25和0.1 mg/ml濃度組，但由于模型組的OD值（p<0.05）明顯高于0.25 mg/ml濃度組的OD值，說明此濃度下二甲雙胍的細(xì)胞毒性較強(qiáng)，這也可能是二甲雙胍在高濃度時(shí)對(duì)葡萄糖的消耗量反而降低的緣故.

不同濃度石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部位作用于模型細(xì)胞后，均不同程度地改善了模型細(xì)胞的胰島素消耗量.尤以較高的濃度組0.1、0.25mg/ml對(duì)葡萄糖的消耗具有較顯著的作用（分別為p < 0.01和 p < 0.05）.

3組隨著濃度的增加，OD值也隨之增加，表明3個(gè)不同萃取部位對(duì)HepG2細(xì)胞的增殖有一定的促進(jìn)作用，抵消了胰島素對(duì)細(xì)胞的毒性作用，同時(shí)三組的對(duì)葡萄糖的消耗也隨之增加，這也可能是長(zhǎng)裂苣荬菜改善胰島素抵抗的機(jī)制之一.從整體葡萄糖消耗量分析可見，模型細(xì)胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明顯，說明乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗效果最佳.結(jié)果見表3.

表1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（±S ，n=5）

表1 不同濃度胰島素對(duì)HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（±S ，n=5）

胰島素濃度/（mol·L-1）葡萄糖含量/（mmol·L-1）葡萄糖消耗率/（%）0 6.407±0.267 -10-95.770±0.256 9.94 10-85.513±0.286 13.95 10-75.566±0.270 13.12 10-66.589±0.247 -

表2 胰島素作用不同時(shí)間對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（±S，n=5）

表2 胰島素作用不同時(shí)間對(duì) HepG2 細(xì)胞葡萄糖消耗量的影響（±S，n=5）

時(shí)間/h正常組葡萄糖含量/（mmol·L-1）胰島素組葡萄糖含量/（mmol·L-1）葡萄糖消耗率/（%）8 3.534±0.0778 2.748±0.0769 22.24 12 2.109±0.386 1.232±0.463 41.58 24 7.224±0.207 5.758±0.214 20.29 36 9.450±0.178 7.812±0.464 17.33 48 10.340±0.371 9.411±0.447 8.98

表3 不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測(cè)結(jié)果（±S，n=5）

表3 不同萃取部位對(duì)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及MTT檢測(cè)結(jié)果（±S，n=5）

注：與正常組對(duì)比：#p < 0.05，##p < 0.01；與模型對(duì)照組對(duì)比：* p < 0.05，** p < 0.01

組別 葡萄糖消耗量/（mmol·L-1） OD值正常對(duì)照組 3.833±0.077 0.586±0.063 HepG2/IR 模型組 3.079±0.052#0.501±0.030#0.25 3.842±0.144** 0.459±0.026*二甲雙胍組（mg/mL）0.10 4.310±0.085** 0.608±0.063** 0.01 3.596±0.264* 0.594±0.072* 0.001 3.436±0.184* 0.570±0.109 0.25 3.496±0.225* 0.598±0.074*石油醚部位（mg/mL）0.10 3.783±0.074** 0.636±0.095* 0.01 3.256±0.136 0.424±0.086* 0.001 3.131±0.036 0.308±0.091* 0.25 4.254±0.078 ** 0.692±0.061 **乙酸乙酯（ mg/mL）0.10 3.953±0. 055** 0. 587±0.067* 0.01 3.367±0.137* 0.454±0.023* 0.001 3.498±0.197* 0.346±0.076* 0.25 3.996±0.043** 0.643±0.038**正丁醇部位（mg/mL）0.10 3.461±0.180* 0.593±0.065* 0.01 3.348±0.132* 0.466±0.014* 0.001 3.197±0.089* 0.423±0.047*

4 討 論

胰島素抵抗參與了Ⅱ型糖尿病的發(fā)生和發(fā)展的全過程，是T2DM的重要機(jī)制之一[9].因此，從胰島素抵抗的防治著手尋找抗糖尿病的新藥是一個(gè)重要的方向.肝臟及周圍組織是胰島素作用的靶器官，HepG2 細(xì)胞在高濃度胰島素作用下，HepG2 細(xì)胞表面胰島素受體數(shù)目下降程度與胰島素水平及刺激持續(xù)時(shí)間呈正相關(guān)[2-3].實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以10-6mol/L的胰島素誘導(dǎo)的模型效果較佳，在培養(yǎng)24h后細(xì)胞對(duì)胰島素的攝取顯著降低，說明了模型的成功.

實(shí)驗(yàn)表明，各萃取部位對(duì)模型細(xì)胞的胰島素抵抗敏感度各異，模型細(xì)胞的葡萄糖消耗量在乙酸乙酯部位作用后增加最明顯，表明乙酸乙酯部位改善胰島素抵抗效果最佳.從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可推測(cè)：有效范圍內(nèi)的高濃度萃取物對(duì)胰島素抵抗模型細(xì)胞的增殖起到促進(jìn)作用，保護(hù)和增強(qiáng)細(xì)胞的生命狀態(tài)免受損傷，以此促進(jìn)胰島素抵抗HepG2細(xì)胞的葡萄糖消耗；而低濃度的萃取物則是增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性，來改善胰島素抵抗?fàn)顩r，但這有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)證明.

根據(jù)試驗(yàn)情況，石油醚萃取部位主要含大量的葉綠素、脂肪烴和少量萜等極性較小的化合物；乙酸乙酯主要含倍半萜類、三萜類、黃酮類等化合物；正丁醇部位主要是苷類化合物，其中活性以乙酸乙酯和正丁醇部位相對(duì)較好.從各萃取部位的收率上來說，石油醚部位也遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其它2個(gè)部位，不是長(zhǎng)裂苦苣菜的主要活性部位.可見，長(zhǎng)裂苦苣菜萃取部位中改善胰島素抵抗效果最佳的是乙酸乙酯部位，為長(zhǎng)裂苦苣菜在抗糖尿病領(lǐng)域中的應(yīng)用研究提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù).

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電子與通信學(xué)院學(xué)子勇奪“華為網(wǎng)院杯”

2015全國大學(xué)生ICT技能大賽桂冠

2015年12月6日“華為網(wǎng)院杯”2015全國大學(xué)生ICT技能大賽決賽在深圳圓滿閉幕，我校電信學(xué)院學(xué)生吳惠民與林曉東勇奪桂冠，王隆杰老師獲得優(yōu)秀指導(dǎo)教師獎(jiǎng)。本次大賽由華為技術(shù)有限公司舉辦，來自全國29個(gè)省市400多所院校、近5000名在校大學(xué)生參加。本次大賽取得的成績(jī)不僅表現(xiàn)了我院學(xué)生良好的技能水平和職業(yè)素養(yǎng)，更體現(xiàn)出我院貫徹“三育人”教育理念取得了實(shí)際成果。

（深職院 電子與通信工程學(xué)院）

Effect of Bioactive Components from Sonchus Brachyotus D C. on Glucose Metabolism in Insulin Resistant HepG2 Cells

YANG Yanhua1,2, LlN Sujing2*, LlU Xijing2, DU Bin1

（1.College of Pharmacy, Zhengzhou University, Zhengzhou, Henan 450001, China;
2. School of Applied Chemistry & Biotechnology, Shenzhen Polytechnic, Shenzhen, Guangdong 518055, China）

The purpose of the present paper is to study the different extraction parts from Sonchus brachyotus D C. on glucose metabolism in insulin resistant HepG2 cells. The model of insulin resistance in HepG2 cells induced high concentrations of insulin. Glucose consumption is tested on petroleum ether, ethyl acetate and n-butanol extraction. Concentration of 10-6mol/L insulin is found to be the best condition for HepG2 cells 24 h to generate insulin resistance. Compared with model group Hepg2/IR, the Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can reduce the HepG2 / IR glucose consumption. It works especially well on the ethyl acetate extract. The results show that Sonchus brachyotus D C.’s extraction parts can improve the effect of insulin resistance.

Sonchus brachyotus D C.; insulin resistance; HepG2 cell; glucose consumption

R285

A

1672-0318（2016）01-0045-05

10.13899/j.cnki.szptxb.2016.01.010

2015-06-18

*項(xiàng)目來源：深圳市大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)與細(xì)胞資源庫公共技術(shù)服務(wù)平臺(tái)（合同號(hào)：GGJS20130331152344401）、深圳市科創(chuàng)委2015年基礎(chǔ)研究（JCYJ2015 0630 1141 40632）、深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院青年創(chuàng)新基金（2011年）資助項(xiàng)目

楊艷華（1988-），女，河南人，在讀碩士，研究方向：天然藥用植物的提取分離與純化.

*通訊作者：林素靜（1977-），女，海南人，碩士，副教授，主要研究方向：中藥質(zhì)量控制研究、藥物制劑.