呂燕寧 李潔 盧桂蘭 杜軼威 陳麗娟 竇相峰 孫瑛 黎新宇 龐星火 王全意

100013 北京市疾病預(yù)防控制中心傳染病與地方病控制所 北京預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心

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·論著·

不同類型樣本對(duì)黃熱病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的意義

呂燕寧 李潔 盧桂蘭 杜軼威 陳麗娟 竇相峰 孫瑛 黎新宇 龐星火 王全意

100013 北京市疾病預(yù)防控制中心傳染病與地方病控制所 北京預(yù)防醫(yī)學(xué)研究中心

目的 探討不同類型的樣本對(duì)黃熱病實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的意義。方法 采用實(shí)時(shí)熒光RT-PCR法檢測(cè)5例黃熱病病例不同時(shí)間采集的不同類型樣本中黃熱病毒的核酸。結(jié)果 5例病例中，1例患者在病程≤6 d時(shí)采集的樣本中，僅在血清中檢測(cè)到病毒核酸；另外4例患者在病程≥6 d時(shí)采集的樣本中，僅在尿液中檢測(cè)到病毒核酸。結(jié)論 黃熱病感染早期，病毒核酸檢測(cè)為快速靈敏的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法，血清樣本為病毒核酸檢測(cè)的適宜臨床樣本，隨著病程的推移，尿液樣本逐漸成為病毒核酸檢測(cè)的適宜臨床樣本。

黃熱病是由黃熱病毒引起的蚊媒傳染病，是一種以發(fā)熱、黃疸、蛋白尿、相對(duì)緩脈和出血等為主要臨床特征的急性傳染病，在非洲和南美洲的熱帶地區(qū)呈地方性流行。有33個(gè)國(guó)家約4．5億人處在黃熱病感染危險(xiǎn)中[1]，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)估計(jì)，現(xiàn)在每年全球約有20萬(wàn)黃熱病病例，死亡6萬(wàn)例，病死率高達(dá)20%-50%，嚴(yán)重威脅人類健康。隨著全球經(jīng)濟(jì)發(fā)展，國(guó)際間人際交往的頻繁，使黃熱病的傳播加速，其疫區(qū)不斷擴(kuò)大，黃熱病疫情進(jìn)入非黃熱病流行區(qū)的風(fēng)險(xiǎn)日益增加，不僅成為地區(qū)性的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問(wèn)題，而且也是全球性的嚴(yán)重威脅。黃熱病是WHO，也是我國(guó)《國(guó)境衛(wèi)生檢疫法》規(guī)定的國(guó)境衛(wèi)生檢疫三大傳染病之一。因此，及時(shí)發(fā)現(xiàn)病例對(duì)預(yù)防和控制該病的傳播和流行具有重要意義。

本研究報(bào)道了北京市5例輸入性黃熱病病例不同時(shí)間、不同類型的樣本的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)過(guò)程與結(jié)果，探討不同時(shí)間、不同類型樣本的檢測(cè)意義，對(duì)提高該類病例的檢測(cè)能力、及時(shí)發(fā)現(xiàn)可疑病例、防止該病傳入我國(guó)具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 患者樣本 2016年3月11日至2016年4月11日，共收集北京市5例黃熱病輸入病例的臨床樣本(表1)，包括非抗凝全血、唾液、咽拭子、尿液等，于4 ℃條件下運(yùn)輸至北京市疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 樣本處理與保存 實(shí)驗(yàn)室收到全血樣本后，4 ℃、4 000rpm、5min離心分離血清，將血清進(jìn)行分裝，唾液、咽拭子和尿液也進(jìn)行分裝，除了即時(shí)用于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的樣本外，均于-80 ℃保存。

1.3 核酸提取 血清、唾液、尿液與咽拭子樣本均取140μl，采用Qiagen公司生產(chǎn)的試劑盒QIAampViralRNAKit(52906)提取病毒RNA。

1.4 實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè) 黃熱病毒核酸檢測(cè)采用生科源技術(shù)有限公司生產(chǎn)的試劑盒(SKY-8612)。儀器采用LightCycler480II實(shí)時(shí)熒光PCR儀，反應(yīng)條件及結(jié)果判斷參照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。結(jié)果以LightCycler480II軟件(版本1.5.0)分析。樣本結(jié)果判定：陽(yáng)性樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤30，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)；可疑樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值在30-35范圍，此時(shí)應(yīng)對(duì)樣本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如果重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在30-35范圍，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性。陰性樣本檢測(cè)結(jié)果Ct值>35或無(wú)Ct值。

表1 5例病例的基本信息及不同樣本的檢測(cè)結(jié)果

1.5 測(cè)序 將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行克隆測(cè)序。序列通過(guò)NCBI的BLAST進(jìn)行DNA序列比對(duì)。

2 結(jié)果

2.1 病例基本信息和不同病程、不同類型樣本的檢測(cè)結(jié)果 5例病例采樣時(shí)間距發(fā)病時(shí)間最長(zhǎng)者為13天，最短為2天。除第一例病例在血清中檢測(cè)到病毒核酸外，其余4例病例均只在尿液中檢測(cè)到黃熱病毒核酸，其中第5例病例曾于11個(gè)月前接種過(guò)黃熱病疫苗(表1)。

注：Gambia 2001-AY572535.1為黃熱病毒Gambia 2001株(GenBank: AY572535.1)，以此類推，每個(gè)序列以毒株名稱及其GenBank收錄號(hào)命名， positive control為本實(shí)驗(yàn)所用試劑盒中陽(yáng)性對(duì)照的擴(kuò)增產(chǎn)物序列，BJYF01-BJYF05為本研究中5個(gè)病例樣本中的黃熱病毒序列。圖1 5例病例樣本擴(kuò)增序列進(jìn)化樹(shù)分析Note: Grambia 2001-AY572535.1 is yellow fever virus Grambia 2001 Strain(GenBank:AY572535.1).Equally, every sequence was named as strain name and its Genbank No., positive control is the sequence of positive control in the kit. BJYF01-BJYF05 are sequences from 5 cases in this studyFig.1 Phylogenotic tree analysis of the amplified sequences from 5 cases’ samples

2.2 5例病例擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定與比對(duì)結(jié)果 將5例病例的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆測(cè)序，得到88個(gè)堿基的序列，在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行BLAST，結(jié)果顯示5例病例擴(kuò)增產(chǎn)物的序列均與黃熱病毒Angola71株相匹配，相似度為95%。而試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增產(chǎn)物為86 bp的核酸片段，序列與黃熱病毒疫苗株17D、17D-204、17D/Tiantan、YF/Vaccine/USA/Sanofi-Pasteur-17D-204/UF795AA/YFVax等相匹配，相似度為100%。擴(kuò)增序列進(jìn)化樹(shù)分析見(jiàn)圖1。

3 討論

黃熱病是由黃熱病毒引起經(jīng)埃及伊蚊、南美洲Haemogogus蚊和少數(shù)伊蚊屬蚊種等傳播的一種病死率高、危害性較大的傳染病。人對(duì)該病毒普遍敏感，不分年齡、性別和種族。本病一般呈散發(fā)，如果媒介蚊蟲(chóng)大量繁殖，感染能在人群中引起暴發(fā)流行，危害極大。我國(guó)不是黃熱病的流行區(qū)，既往也從未發(fā)現(xiàn)黃熱病的傳入，隨著我國(guó)改革開(kāi)放以及對(duì)外交流的增多，自2016年3月起我國(guó)陸續(xù)從非洲黃熱病流行區(qū)安哥拉經(jīng)多個(gè)口岸輸入了多起黃熱病病例，因此，黃熱病的檢疫和快速敏感的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)對(duì)嚴(yán)防病例輸入顯得至關(guān)重要。

黃熱病的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法主要有病毒分離、血清特異性IgM/IgG抗體檢測(cè)、病毒抗原以及黃熱病毒RNA檢測(cè)等，疑似病例的任一實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性均可以確診[2,3]。而常規(guī)的黃熱病毒培養(yǎng)對(duì)實(shí)驗(yàn)室的要求較高，需要在生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室(BSL-3)內(nèi)進(jìn)行，且操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)?？乖瓩z測(cè)的靈敏度不高，抗體檢測(cè)與其他黃病毒有明顯的交叉反應(yīng)，這給血清學(xué)診斷帶來(lái)了一定的困難。PCR方法以其快速、靈敏、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)在黃病毒屬病毒的快速檢測(cè)和鑒別方面有著廣泛的應(yīng)用[4]。

由于國(guó)內(nèi)之前從未有過(guò)黃熱病確診病例的出現(xiàn)，因此對(duì)于此類病例的病毒核酸檢測(cè)樣本的采集時(shí)機(jī)以及需要采集的樣本類型缺乏了解。有資料推薦采集全血、血清、腦脊液、腹腔液或胸腔液以及肝組織活檢等[5]，但各種樣本采集的難易程度、患者的可接受程度以及檢測(cè)的敏感性均不同，對(duì)于診斷的意義也不同。如何在最佳時(shí)機(jī)采集最佳樣本是關(guān)系到能否對(duì)病例進(jìn)行迅速準(zhǔn)確的診斷，并將對(duì)患者的損害降到最低。對(duì)此查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)鮮有論述，僅有的研究報(bào)道為接種黃熱病疫苗后，健康者和出現(xiàn)疫苗相關(guān)副反應(yīng)者尿液中能夠檢測(cè)到疫苗株病毒核酸，可持續(xù)到20多天，甚至可達(dá)198 d[5，6]。國(guó)內(nèi)外關(guān)于同屬病毒，如登革和寨卡病毒的適宜檢測(cè)樣本類型研究較多，研究發(fā)現(xiàn)這些病毒感染后可在患者唾液、尿液中檢測(cè)到病毒核酸[7-12]，但對(duì)于黃熱病未能查到相關(guān)的研究和報(bào)道。

我國(guó)往從未有本地或輸入性黃熱病病例的報(bào)道[13]。隨著我國(guó)與非洲、南美等黃熱病流行區(qū)交流的增多，北京市于2016年3月11日發(fā)現(xiàn)中國(guó)首例黃熱病輸入病例[14-16]，截至4月11日一個(gè)月的時(shí)間內(nèi)又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)4例輸入病例。我們對(duì)這有限的5例病例嘗試采集了不同類型的樣本，觀察了在不同病程時(shí)間、不同樣本對(duì)黃熱病毒核酸檢測(cè)的意義。由于首例患者入院后即出現(xiàn)了嚴(yán)重的腎功能衰竭，采取了透析治療，未能及時(shí)采集到患者的尿液樣本，其余患者均采集到了血液、唾液和尿液樣本。

由于樣本量有限以及現(xiàn)有試劑的局限性，不能對(duì)所有樣本進(jìn)行多次重復(fù)檢測(cè)，僅在初次檢測(cè)時(shí)進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)，也不能對(duì)樣本中病毒核酸的拷貝數(shù)進(jìn)行精確定量，僅能根據(jù)Ct值來(lái)進(jìn)行評(píng)估和討論。因此本次研究采取了嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)控，每次核酸提取均采用相同的樣本量、相同的提取流程，并設(shè)提取對(duì)照。每次實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)均設(shè)陰性及陽(yáng)性對(duì)照。每個(gè)病例同次采集的樣本均作了重復(fù)實(shí)驗(yàn)。將不同時(shí)間采集的不同樣本采用相同的實(shí)驗(yàn)過(guò)程和條件進(jìn)行檢測(cè)，盡量去除其他因素的影響以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可比性。檢測(cè)陽(yáng)性的樣本均采用二代測(cè)序技術(shù)進(jìn)行了序列測(cè)定，并獲得了病毒的全基因組序列(結(jié)果尚未發(fā)表)。

研究結(jié)果顯示，不同時(shí)間采集的血清樣本中，病毒核酸量隨病程進(jìn)展而降低。黃熱病典型臨床過(guò)程可分為病毒血癥期、緩解期、肝腎損傷期和恢復(fù)期。其中病毒血癥期可持續(xù)3-5 d，可以在患者血液中檢測(cè)到病毒核酸。在我們觀察的5例病例中，只有首例病例由于病情較重，并最終在發(fā)病9 d時(shí)死亡，因此病毒血癥期持續(xù)存在，在發(fā)病6 d時(shí)采集的樣本中仍然可以檢測(cè)到病毒核酸。其他病例在病程≥6 d時(shí)采集的血清樣本中均未檢測(cè)到病毒核酸。

不同類型樣本中，5例患者有4例采集到唾液樣本，除首例病例唾液樣本病毒核酸檢測(cè)值處于灰區(qū)外，其他3例患者的唾液檢測(cè)均為陰性，因此從這幾例病例的檢測(cè)實(shí)踐來(lái)看，唾液并不適合作為黃熱病急性期的指示樣本來(lái)采集。5例病例中，有2例采集了咽拭子，但也均未檢出病毒核酸。5例病例中有4例采集到了尿液樣本，病毒核酸檢測(cè)均為陽(yáng)性，這4例患者的病程≥6 d，血清檢測(cè)均為陰性。

綜合上述結(jié)果，血清和尿液可作為黃熱病毒核酸檢測(cè)的有效樣本。血清適宜在發(fā)病早期采集，發(fā)病超過(guò)5-6 d后尿液的檢測(cè)對(duì)病例診斷更有意義。而唾液樣本的檢測(cè)敏感性很低，不適宜采用。

擴(kuò)增產(chǎn)物的序列測(cè)定與比對(duì)顯示5例病例樣本擴(kuò)增子的序列均與黃熱病毒Angola71株的序列相匹配，而試劑盒陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增子序列則與黃熱病毒的17D、17D-204、17D/Tiantan等多種疫苗株的序列100%匹配，因此我們目前采用的試劑盒不能區(qū)分黃熱病疫苗株和野毒株Angola71，而Angola71是目前疫區(qū)的流行株。由于部分人群接種黃熱疫苗后會(huì)出現(xiàn)不良反應(yīng)[17]，而且接種者尿液中能夠檢測(cè)到疫苗株病毒核酸[6]，因此，對(duì)于近期由安哥拉疫區(qū)輸入的疑似病例，采用本試劑盒進(jìn)行檢測(cè)時(shí)一定要詢問(wèn)患者的疫苗接種史，了解其是否接種了疫苗、接種了多長(zhǎng)時(shí)間等，以便對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出正確解釋和判斷，必要時(shí)要采用測(cè)序方法進(jìn)行確證。本研究中的第5例患者，在11個(gè)月前接種過(guò)黃熱病疫苗，但測(cè)序結(jié)果顯示此次發(fā)病是由于感染了疫區(qū)的野毒株所致。

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Significance of different types of samples for the laboratory detection of yellow fever

LyuYanning,LiJie,LuGuilan,DuYiwei,ChenLijuan,DouXiangfeng,SunYing,LiXinyu,PangXinghuo,WangQuanyi

InstituteofInfectiousandEndemicDiseasesControl,BeijingCenterforDiseasesControlandPrevention,BeijingCenterforPreventiveMedicine,Beijing100013,China

WangQuanyi,Email:bjcdcxm@126.com

ObjectiveToinvestigatethesignificanceofdifferenttypesamplesforthelaboratorydetectionofyellowfever.MethodsDifferenttypesofsampleswerecollectedatdifferenttimefrom5yellowfevercases,andtheyellowfevervirusRNAwasdetectedbyreal-timePCR.ResultsForthe5casesamongthesamplescollectedin≥6daysfromtheonset,onlytheserumsamplefrom1patientwaspositiveandtheurinesamplesfromtheother4patientswerepositive.ConclusionsIntheearlyphaseofyellowfever,theviralRNAdetectionisafastandsensitivelaboratorytestmethod,andserumistheappropriateclinicsamplefortheviralRNAdetection.Withthelapseoftime,urinebecomestheappropriateclinicsamplefortheviralRNAdetection.

Yellowfever；Laboratorydetection；ViralRNA；Sample

王全意，Email: bjcdcxm@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.007

黃熱??；實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)；病毒核酸；樣本

2016-06-04)