張蓉芳 謝志萍 高寒春 劉東海 石永生 王永軍 李桂榮 王衛(wèi)凱 蔣成鵬 段招軍

730050 蘭州，甘肅省婦幼保健院(張蓉芳、劉東海、石永生、王永軍、李桂榮、王衛(wèi)凱、蔣成鵬)；100052 北京，中國疾病控制中心病毒病預(yù)防控制所(謝志萍、高寒春、段招軍)

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·論著·

蘭州地區(qū)難治性肺炎病毒病原檢測及臨床研究

張蓉芳 謝志萍 高寒春 劉東海 石永生 王永軍 李桂榮 王衛(wèi)凱 蔣成鵬 段招軍

730050 蘭州，甘肅省婦幼保健院(張蓉芳、劉東海、石永生、王永軍、李桂榮、王衛(wèi)凱、蔣成鵬)；100052 北京，中國疾病控制中心病毒病預(yù)防控制所(謝志萍、高寒春、段招軍)

目的 探討蘭州地區(qū)難治性肺炎患兒中病毒病原的感染狀況及臨床特點 方法 收集2013年1月至2013年12月甘肅省婦幼保健院難治性肺炎患兒肺泡灌洗液100例，應(yīng)用PCR及RT-PCR方法檢測9種常見呼吸道病毒：鼻病毒(HRV-A，B，C)，呼吸道合胞病毒(RSV)，偏肺病毒(hMPV)，流感病毒(IFVA，IFVB)，副流感病毒1-3(HPIV1-3)，冠狀病毒(HCoV-HKU1、 HCoV-NL63)，腸道病毒(EV)及腺病毒(AdV)，博卡病毒(HBoV)。結(jié)果 53例標(biāo)本病毒病原檢測陽性，其中AdV陽性標(biāo)本40例，檢出率40%;其中AdV7型占大多數(shù)，共33例;其次為AdV2有6例，AdV1有1例;RSV 18例;檢出率18%，IFVB5例，檢出率5%;HRV4例，檢出率4%;EV-68 1例;13例混合感染，混合感染率為24.53%(13/53)。腺病毒陽性和陰性患兒的臨床特征比較顯示：發(fā)熱、呼吸衰竭、發(fā)紺和肺部實變4個臨床表現(xiàn)在腺病毒陽性患兒中發(fā)生率高。結(jié)論 病毒在蘭州地區(qū)難治性肺炎中占有很重要的地位，其中腺病毒、尤其是AdV7型為當(dāng)?shù)亓餍械淖钪饕牟《静≡?，在臨床治療中應(yīng)給與高度關(guān)注。

Fundprograms:HealthCareIndustryProjectPlan(GSWST2012-12);NationalNaturalScienceFoundationofChina(81260001)

急性呼吸道感染(Acuterespiratorytractinfection，ARTI)是世界范圍內(nèi)威脅嬰幼兒健康的主要疾病，其中難治性肺炎占有很大的比例，ARTI的病原學(xué)十分復(fù)雜，目前引起我國兒童急性呼吸道感染的病原體仍以病毒最為突出[1-3]，我們研究組前期工作證實蘭州地區(qū)呼吸道感染患兒病毒感染率為73.92%[4]。

難治性肺炎是指病情嚴(yán)重或病程長、經(jīng)抗感染藥物積極治療無改善、遷延不愈甚至惡化的一類肺炎，目前難治性肺炎是臨床醫(yī)生面臨的一大難題。蘭州地處西北經(jīng)濟(jì)欠發(fā)達(dá)地區(qū)，難治性肺炎病毒病原的資料很少，而新發(fā)呼吸道病毒，包括鼻病毒C群、偏肺病毒、博卡病毒在難治性肺炎患兒中的感染狀況不清楚，了解難治性肺炎的病毒病原譜對臨床治療提供幫助。

本研究對2013年1月-2013年12月間甘肅省婦幼保健院收治的100例難治性肺炎患兒肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid)，采用PCR和RT-PCR的方法進(jìn)行了病毒病原[RSV、IFV(A，B)、PIV1-3、HRV(A，B，C)、AdV、hMPV、HCoV-HKU1、HCoV-NL63、HBoV]的檢測，對臨床資料進(jìn)行了回顧性分析，探討病毒病原的分布及臨床特點。

1.1 資料及方法

1.1 臨床標(biāo)本的收集 選擇2013年1月- 2013年12月甘肅省婦幼保健院收治的難治性肺炎患兒100例，均符合實用兒科學(xué)第七版肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)，且病程3 周以上療效不佳或病程在1 周以內(nèi)，但X線胸片或胸部CT有明顯實變或不張，經(jīng)常規(guī)治療1周癥狀、體征和胸部X線表現(xiàn)無明顯改善的患兒，所有患兒血CRP<1mg/L，痰細(xì)菌培養(yǎng)陰性。于就診當(dāng)日采集患兒肺泡灌洗液，入一次性滅菌痰液收集器，采集過程征得家屬同意。第1管送細(xì)菌培養(yǎng)，第2管送細(xì)胞學(xué)檢查，第3管送-80 ℃冰箱保存，轉(zhuǎn)運至中國疾病預(yù)防控制中心做進(jìn)一步研究。

1.2 臨床標(biāo)本的處理 肺泡灌洗液標(biāo)本室溫化凍，高速漩渦振蕩至成水樣。在超凈工作臺內(nèi)轉(zhuǎn)至2mlEP管中。5000轉(zhuǎn)離心5min，取上清液, 用于病毒RNA，DNA的提取，剩余的標(biāo)本-80 ℃冰箱保存。

1.3 病毒RNA/DNA的提取 用QIAampviralDNAminikitandQIAampviralRNAminikit(Qiagen,Beijing,China)提取患兒肺泡灌洗液標(biāo)本上清中的總RNA和DNA，操作按試劑盒說明書進(jìn)行。用RNA為模板，應(yīng)用隨機(jī)引物(Invitrogen)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后進(jìn)行PCR的擴(kuò)增，實驗引物及反應(yīng)條件參考[4,5]。

1.5 結(jié)果檢測 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，陽性產(chǎn)物送北京華大基因研究中心進(jìn)行核苷酸序列測定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，率或構(gòu)成比的比較采用χ2檢驗和Fisher精確概率法，檢驗水準(zhǔn)設(shè)為0.05。

2 結(jié)果

2.1 臨床標(biāo)本中一般資料 100例難治性肺炎患兒中：男性61例，女性39例，年齡2個月-13歲，其中2個月-1歲13例、1歲-3歲42例、3歲-7歲38例、7歲-13歲7 例，病程 8d-1年， 其中發(fā)熱81例、咳嗽98例、喘息48例、紫紺21例、咯血2例、呼吸困難18例、肺部啰音89例、肺部實變體征11例、呼吸衰竭16例。肺部CT或X線胸片表現(xiàn)為滲出性病變 62例、實變11例、氣腫2 例、肺不張4 例、胸腔積液2例。其中2例死亡病例。

2.2 病毒病原的檢測 本組肺泡灌洗液病毒陽性標(biāo)本共53例；陽性率為53%，其中AdV40例(AdV7型33例，AdV1型1例，AdV2型6例)，RSV18例，IFVB5例，HRV4例，EV68 1例;其中13例混合感染，AdV和RSV混合感染8例，IFVB和AdV，RSV混合感染為1例，AdV和HRV混合感染1例，IFVB和AdV3例，混合感染率為13%。

2.3 年齡分布特點 病原檢出情況的年齡分布如表1所示。各年齡組間病原檢出率均差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=3.37 P>0.05)。

2.4 腺病毒陽性陰性患兒的臨床特征 在40例腺病毒陽性患兒中，男女性別比為2.7∶1，在47例病毒檢測陰性患兒中性別比僅為1.2∶1，兩者之間無統(tǒng)計學(xué)差異(χ2=3.13 P>0.05)。表2顯示了腺病毒陽性和陰性患兒的臨床特征。發(fā)熱、呼吸衰竭、發(fā)紺和肺部實變四個臨床表現(xiàn)在腺病毒陽性患兒中發(fā)生率較陰性患兒高。

表1 不同年齡病原檢出情況

表2 腺病毒陽性和陰性患兒中臨床特征分析

注：采用Fisher精確概率法

Note: Using Fisher’s exact test

本次檢測1至4季度分別收集難治性肺炎患兒肺泡灌洗液標(biāo)本28、20、18和34份。圖1顯示了不同季度腺病毒陽性檢出率。各季度間腺病毒陽性檢出率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.20P>0.05)。

圖1 不同季度腺病毒陽性檢出率Fig.1 Quarterly distribution of AdVs infections

3 討論

我們共檢測了100例難治性肺炎肺泡灌洗液標(biāo)本，其中病毒檢出率為53%，和國外的報道一致，既往多認(rèn)為導(dǎo)致難治性肺炎的病原體主要是細(xì)菌、真菌、結(jié)核等病原，對病毒在難治性肺炎中所起的作用，了解十分有限。國外已有較多報道證實病毒病原是難治性肺炎患兒主要病因：Akhtar等[6]采用PCR方法在需要機(jī)械通氣的肺炎患兒的氣管導(dǎo)管吸取物中檢測腺病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒、EB病毒、腸道病毒、RSV、IFV-A和IFV．B八種呼吸道病毒，其病毒總檢出率為56%。Van de Pol等在入住PICU急性下呼吸道感染的患兒中采用病毒培養(yǎng)和直接免疫熒光方法病毒總檢出率為48%，同時采用熒光定量PCR病毒檢出率則高達(dá)96%[7]。

腺病毒的檢出率為40%，40例腺病毒陽性標(biāo)本中AdV 7型占33例，AdV 2型6例，AdV 1型1例，而在蘭州地區(qū)普通呼吸道感染患兒中腺病毒的感染率為6.33%[8]，腺病毒在難治性肺炎中的感染率明顯高于普通呼吸道感染。因為取材相對容易，國內(nèi)外大多數(shù)對兒童呼吸道病原的研究采用的標(biāo)本為鼻咽分泌物，而本研究對象為支氣管肺泡灌洗液(BALF)，纖支鏡下BAL直接取材于病變部位，對支氣管肺泡灌洗液成分的分析，較痰培養(yǎng)更能客觀地反映患兒下呼吸道病原的狀況。

人類腺病毒屬于雙股DNA病毒，迄今已發(fā)現(xiàn)58種血清型，歸為A-G 7個亞群，既往的研究顯示：AdV7是兒童呼吸道感染的一個重要的病毒病原，往往導(dǎo)致嚴(yán)重的下呼吸道感染和高的死亡率，尤其是在小嬰兒和免疫缺陷的患兒中。一項阿根廷的研究顯示，呼吸道感染的死亡病例28.6%是由AdV7感染導(dǎo)致[10]，本組資料顯示AdV7同樣是蘭州地區(qū)難治性肺炎的一個重要的病毒病原，在難治性肺炎中占有很高的感染比例(33%)，腺病毒陽性和陰性患兒的臨床特征比較顯示，發(fā)熱、呼吸衰竭、發(fā)紺和肺部實變四個臨床表現(xiàn)在腺病毒陽性患兒中發(fā)生率更高。AdV引起的呼吸道感染可以全年散發(fā)，流行或暴發(fā)流行，大多數(shù)的研究中，AdV呈地方性的全年散發(fā)，但是AdV引起的暴發(fā)流行在過去幾十年常有報道[4,5,9],。本研究中，AdV呈全年散發(fā)，未觀察到季節(jié)流行特點。新發(fā)病毒如HRV-C在本研究共檢測出2例，EV68檢測出1例，而偏肺病毒(Human Metapneumovirus, HMPV)，人博卡病毒(Human Bocavirus, HBoV)，冠狀病毒NL-63和HKU1(HCoV-NL63，HCoV-HKU1)在本次研究中未檢測到。

本研究采用靈敏度和特異性均很高的PCR及RT-PCR，分析了難治性肺炎患兒數(shù)種常見和新發(fā)呼吸道病毒感染情況，本組數(shù)據(jù)證明病毒在難治性肺炎病原譜中占有很重要的地位，其中腺病毒的感染尤其重要。本研究對蘭州地區(qū)難治性肺炎兒童中病毒感染狀況、臨床特點做初步的研究，為臨床醫(yī)生提供科學(xué)理論依據(jù)并指導(dǎo)臨床的治療，避免抗生素的濫用，并為疫苗的研制提供流行病學(xué)資料。

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Analysis of respiratory viruses detection and clinical feature analysis in children with refractory pneumonia in Lanzhou area

ZhangRongfang,XieZhiping,GaoHanchun,LiuDonghai,ShiYongsheng,WangYongjun,LiGuirong,WangWeikai,JiangChengpeng,DuanZhaojun

GansuProvincialMaternityandChildrenCareHospital,Lanzhou, 730050,China(ZhangRF,ShiYS,WangYJ,LiuDH,LiGR,WangWK,JiangCP);NationalInstituteforViralDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing100052,China.(XieZP,GaoHC,DuanZJ)

s:ZhangRongfang,Email:lazyrfang@126.com;DuanZhaojun,zhaojund@126.com

ObjectiveThestudywastoinvestigationthecontributionof9respiratoryvirusesandclinicalfeaturesofrefractorypneumoniainchildreninLanzhouarea.MethodsIntotal, 100bronchoalveolarlavagefluidwerecollectedfromchildrenyoungerthan14yearswithrefractorypneumoniabetweenJanuary2013andDecember2013.Thepolymerasechainreaction(PCR)wasusedtoscreenhumanrespiratorysyncytialvirus(HRSV),humanmetapneumovirus(HMPV),influenzavirusesAandB(IFVA,IFVB),parainfluenzavirustypes1to3 (PIV1-3),humanrhinoviruses(HRVs),andhumancoronaviruses(HCoV-NL63andHKU1),enterovirus(EV)usingastandardreverse-transcriptionPCRtechnique,adenovirus(AdVs)andhumanBocavirus(Bcov)usingtraditionalPCRmethods.AllPCR-positiveproductsweresequenced.ResultsViralagentswereidentifiedin53% (53/100)ofspecimens,includingAdVin40%(40/100),followedbyRSVin18%(18/100),IFVBin5% (5/100),HRVin4%(4 /100),EV-68wasfoundinonecase.AmongAdVpositivecases,AdV7 (33/40)wasdetectedmostfrequently,followedbyAdV2in15% (6/40),AdV1in2.5%(1/40),Thecoinfectionrateofpositivesamplewas24.53%(13/53).ConclusionsVirusesplayanimportantroleinrefractorypneumoniainchildreninLanzhouarea.AdVisanimportantviralagentinchildrenwithrefractorypneumoniainLanzhouCity,especiallyAdV7.Thefrequencyoffever,respiratoryfailure,cyanosis,andpulmonaryconsolidationweresignificantbetweenAdVpositivesampleandnegativesample.

Refractorypneumonia;PCR;Viralpathogens;Children

張蓉芳，Email:lazyrfang@126.com；段招軍，Email：zhaojund@126.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.012

難治性肺炎;PCR; 病毒病原; 兒童

甘肅省衛(wèi)生行業(yè)項目計劃(GSWST2012-12);國家自然科學(xué)基金(81260001)

2016-01-16)