余煉 何小周 王琬玓 馮霞 徐柯 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院病毒與藥理室(余煉、曾毅)；中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室(何小周、王琬玓、馮霞、曾毅、徐柯)

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·論著·

重組腺病毒載體HIV-1 env疫苗合用佐劑的免疫效果研究

余煉 何小周 王琬玓 馮霞 徐柯 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院病毒與藥理室(余煉、曾毅)；中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室(何小周、王琬玓、馮霞、曾毅、徐柯)

目的 探討添加IL-7、IL-21基因佐劑及Poly(I:C)、CpG ODN對艾滋病疫苗的免疫效果有無增強作用。方法 構(gòu)建了表達(dá)IL-7、IL-21基因的質(zhì)粒pVR-IL7、pVR-IL21，以DNA疫苗(pVR-HIVenv)對小鼠進(jìn)行初免，以腺病毒載體疫苗(Ad5-HIVenv)添加佐劑進(jìn)行加強免疫，末次免疫后兩周分別采用酶聯(lián)免疫斑點法(ELISPOT)和酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測免疫小鼠誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)。結(jié)果 ELISPOT結(jié)果顯示Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合IL7組小鼠每百萬個脾淋巴細(xì)胞中分泌IFN-γ的細(xì)胞數(shù)(SFC)/106高于疫苗單獨免疫組小鼠(P<0.05)；IL-7和CpG ODN作為佐劑同時使用可以進(jìn)一步的提高免疫反應(yīng)(P<0.05)。結(jié)論 Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合IL7佐劑及CpG ODN具有較強的細(xì)胞免疫反應(yīng)，而聯(lián)用IL21佐劑則未見明顯的免疫增強作用。

Fund programs: National Science and Technology Major Project of China for Infectious Diseases (2012ZXl0001009-005,2012ZX10001009-002-002)

人類免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus, HIV)因其高度的變異性和獨特的復(fù)制周期，直到現(xiàn)在仍然沒有有效的疫苗問世。相較于疫苗單獨免疫，添加佐劑能誘導(dǎo)出更高強度針對病原體的保護性免疫反應(yīng)[1]。有研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞因子及Toll樣受體激動劑在免疫應(yīng)答過程中起重要作用，因而可作為疫苗佐劑使用[1,2]。IL-7是一類主要由非骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞和上皮細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，在促進(jìn)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生和發(fā)育成熟的過程中發(fā)揮重要作用。IL-21與其受體結(jié)合后可以調(diào)節(jié)B細(xì)胞的增殖，促進(jìn)T細(xì)胞、NK細(xì)胞的增殖等。Poly(I:C)是人工合成的雙鏈RNA類似物，目前Poly(I:C)被用于基于樹突狀細(xì)胞疫苗等疫苗的佐劑[3]。CpG ODN是一種寡脫氧核苷酸，國外有臨床研究證明，CpG ODN能顯著增強受體的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，作為乙肝疫苗佐劑能提高人體免疫應(yīng)答[4]。本研究通過比較DNA疫苗(pVR-HIVenv)初免之后，Ad5-HIVenv疫苗單獨免疫小鼠，以及分別與IL-7、IL-21基因佐劑以及Poly(I:C)、CpG ODN聯(lián)合免疫小鼠的效果，來探究一種更強的佐劑聯(lián)合免疫方案。

1 材料與方法

1.1 材料 表達(dá)密碼子優(yōu)化的HIV-1 B 亞型env基因的E1、E3缺失的重組5 型腺病毒載體疫苗Ad5-HIVenv、表達(dá)密碼子優(yōu)化的HIV-1 B亞型env基因的pVR質(zhì)粒pVR-HIVenv由本室構(gòu)建[5]，pVR質(zhì)粒由本室保存，4-6周齡的雌性BALB/c小鼠(SCXK2012-0004，中國食品藥品檢定研究院)，Mice IFN-γ ELISPOT Kit(Mabtech公司)，PMA、ionomycin(Sigma-Aldrich公司)，env多肽(旭和源生物技術(shù)公司合成)，F(xiàn)uGENE HD(Promega公司)，Poly(I:C)、CpG ODN(InvivoGen公司)，gp120、gp41蛋白(Immune technology公司)，限制性內(nèi)切酶Xbal、BglII(上海捷瑞生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)小鼠IL-7、IL-21基因的質(zhì)粒pVR-IL7、pVR-IL21的構(gòu)建：本研究以GenBank中小鼠的IL-7、IL-21的氨基酸參考序列出發(fā)，進(jìn)行密碼子優(yōu)化后人工合成IL-7、IL-21基因序列并克隆至pVR質(zhì)粒載體中，構(gòu)建成表達(dá)小鼠IL-7、IL-21的基因佐劑pVR-IL7、pVR-IL21質(zhì)粒，并進(jìn)行酶切、測序及Western Blot鑒定。

1.2.2 Ad5-HIVenv疫苗添加IL-7、IL-21基因佐劑及Poly(I:C)、CpG ODN的小鼠分組及免疫：4-6周齡的雌性BALB/c小鼠隨機分為8組，每組5只，按表1所示方案免疫小鼠，免疫小鼠采用后肢肌肉注射。免疫劑量分別為：PBS，100 μl/只；DNA(pVR-HIV env)，100 μg/只；Ad5(Ad5-HIVenv)，2×108VP/只；pVR-IL7、pVR-IL21質(zhì)粒、Poly(I:C)、CpG ODN均為100 μg/只。各組小鼠于末次免疫后兩周脫頸處死，眼眶靜脈叢采血并分離血清，同時取脾臟并分離脾淋巴細(xì)胞。

表1 表達(dá)HIV env的Ad5疫苗與不同佐劑聯(lián)用

1.2.3 HIV-1 env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)的檢測：實驗采用ELISPOT法檢測免疫小鼠誘導(dǎo)的HIV-1 env特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，以1.2.2中分離得到的脾淋巴細(xì)胞作為樣本按照MABTECH公司的Mice IFN-γ ELISPOT試劑盒說明書進(jìn)行操作，調(diào)整細(xì)胞濃度為4×106個/ml，配制陽性刺激物ionomycin(2 μg/ml)和PMA(50 ng/ml)、env多肽(4 μg/ml)。陽性孔每孔加入50 μl陽性刺激物，實驗孔每孔加入50 μl env多肽，陰性孔每孔加入50 μl 10% FBS的1640培養(yǎng)基，各孔再加入細(xì)胞懸液50 μl，空白孔不加細(xì)胞和刺激物(終體積為100 μl/孔)，置37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h，顯色后記錄斑點數(shù)目，計算每百萬淋巴細(xì)胞中的斑點形成細(xì)胞數(shù)(SFC)/106。

1.2.4 HIV-1 env特異性體液免疫反應(yīng)的檢測：實驗采用ELISA法檢測1.2.2中分離得到的血清樣本中g(shù)p120、gp41抗體IgG滴度。在4 ℃過夜包被gp120、gp41抗原(0.5 μg/ml)的96孔滴定板中，加入從1∶50開始4倍梯度稀釋的小鼠血清，37 ℃溫浴1 h；棄血清，洗板機洗5次，加入辣根氧化酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶5000)，37 ℃溫浴1 h；棄二抗，洗板機洗5次，加顯色液室溫30 min，遮光顯色；最后，加入終止液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀450/630 nm波長測OD值，計算抗體滴度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，組間兩兩比較采用Dunn′s Multiple Comparison 檢驗，各組間結(jié)果采用非參數(shù)檢驗Kruskal-Wallis test，以P<0.05 有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

1：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：pVR酶切圖譜；3：pVR-IL7酶切圖譜圖1 pVR和pVR-IL7雙酶切電泳結(jié)果1：DNA Marker;2:Result of pVR;3:Result of pVR-IL7Fig.1 Gel electrophoresis of pVR and pVR-IL7 and their double-digestion patterns

1：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；2：pVR酶切圖譜；3：pVR-IL21酶切圖譜圖2 pVR和pVR-IL21雙酶切電泳結(jié)果1：DNA Marker;2:Result of pVR;3:Result of pVR-IL21Fig.2 Gel electrophoresis of pVR and pVR-IL21 and their double-digestion patterns

2.1 表達(dá)小鼠IL-7、IL-21基因的重組質(zhì)粒的鑒定。 構(gòu)建的兩個重組質(zhì)粒(pVR-IL7)和(pVR-IL21)，經(jīng)Xbal和BglII雙酶切鑒定后，均符合預(yù)期結(jié)果(如圖1和圖2所示)。兩質(zhì)粒均送至北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司測序鑒定，連接框架和準(zhǔn)確性均符合要求，說明兩個重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。2.2 蛋白表達(dá)與鑒定 以測序和酶切鑒定結(jié)果正確的重組質(zhì)粒pVR-IL7和pVR-IL21按照FuGENE HD的說明書分別轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，培養(yǎng)48-72 h后，采用Western Blot鑒定IL-7、IL-21的蛋白表達(dá)，顯示均有外源蛋白表達(dá)，相對分子質(zhì)量與預(yù)期大小一致。

1：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)； 2：轉(zhuǎn)染pVR-IL7的293細(xì)胞; 3：正常的293細(xì)胞圖3 質(zhì)粒pVR-IL7中IL7基因表達(dá)水平鑒定1：Prestained Protein Manker; 2:293 cells transfected with pVR-IL7; 3:Mock 293 cellsFig.3 Expression of pVR-IL7 in vitro

1：蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);2：轉(zhuǎn)染pVR-IL21的293細(xì)胞; 3：正常的293細(xì)胞圖4 質(zhì)粒pVR-IL21中IL21基因表達(dá)水平鑒定1：Prestained Protein Manker; 2:293 cells transfected with pVR-IL21; 3:Mock 293 cellsFig.4 Expression of pVR-IL21 in vitro

2.3 Ad5-HIV env疫苗添加IL-7、IL-21基因佐劑及Poly(I:C)、CpG ODN的小鼠ELISPOT和ELISA結(jié)果 ELISPOT結(jié)果顯示Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑組小鼠(SFC)/106高于疫苗單獨免疫組小鼠(P<0.05)；Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑及CpG ODN組的(SFC)/106高于Ad5-HI env疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑組(P<0.05)；而添加IL-21基因佐劑組的(SFC)/106與疫苗單獨免疫組小鼠相比，并沒有增強作用，如圖5所示。

圖5 免疫小鼠的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)Fig.5 Cellular immune response in immunized mice

通過ELISA方法進(jìn)一步研究表明，添加佐劑組小鼠血清中g(shù)p120、gp41抗體IgG滴度與疫苗單獨免疫組相比，并無顯著性差異(結(jié)果未顯示)。

3 討論

艾滋病毒因其基因具有較大變異性，目前仍沒有有效的艾滋病預(yù)防性疫苗問世，研制治療性疫苗因此成為目前艾滋病疫苗研發(fā)的主要方向，同時利用各種佐劑如細(xì)胞因子佐劑和Toll樣受體激動劑佐劑增強艾滋病疫苗的免疫效力也是目前研究中的新策略。SIN等證實IL-7作為疫苗佐劑可以增強抗原特異性CTL反應(yīng)[6]。近年來，一些研究報道以細(xì)胞因子作為HIV疫苗佐劑可以增強疫苗的免疫效果，其中包括白細(xì)胞介素21[2]。Poly(I:C)、CpG ODN均為Toll樣受體激動劑，均能夠通過與相應(yīng)的受體結(jié)合，激活機體免疫系統(tǒng)，并增強特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)。

本課題組前期的研究中提出的使用多載體HIV疫苗進(jìn)行重復(fù)和序貫免疫的策略證實，在接受多載體疫苗序貫免疫的動物體內(nèi)能誘導(dǎo)持續(xù)時間較長、反應(yīng)強度較高的HIV特異性免疫反應(yīng)。本研究構(gòu)建了表達(dá)小鼠IL7、IL21的質(zhì)粒pVR-IL7和pVR-IL21，經(jīng)酶切、測序鑒定均正確，并將這兩個質(zhì)粒瞬

時轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，Western blot顯示IL7、IL21均能在293細(xì)胞中有效表達(dá)。我們將pVR-IL7和pVR-IL21質(zhì)粒及Poly(I:C)、CpG ODN以不同的組合聯(lián)合免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑及CpG ODN組的細(xì)胞免疫水平高于 Ad5-HIVenv疫苗聯(lián)合pVR-IL7佐劑組，并且顯著高于疫苗單獨免疫組；而添加IL-21基因佐劑組與疫苗單獨免疫組小鼠相比，并沒有增強作用。這一結(jié)果提示添加pVR-IL7基因佐劑及CpG ODN可以增強艾滋疫苗DNA初免，載體疫苗加強免疫策略誘導(dǎo)的特異性細(xì)胞免疫反應(yīng)，為艾滋病疫苗添加佐劑的應(yīng)用提供了參考。

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Adjuvants enhance cellular immune response induced by recombinant adenoviral vector encoding HIV-1 env gene in mice

YuLian,HeXiaozhou,WangWandi,FengXia,XuKe,ZengYi

LaboratoryofVirologyandPharmocology,CollegeofLifeScienceandBioengineering,BeijingUniversityofTechnology,Beijing100124,China(YuL,ZengY); (HeXZ,WangWD,FengX,XuK)

XuKe,Email:xukecdc@163.com;ZengYi,Email:zengyicdc@163.com

Objective To study the immune effects of IL-7, IL-21 as gene adjuvants, Poly(I:C) and CpG ODN for HIV vaccine. Methods Mouse interleukin 7 DNA adjuvant (pVR-IL7) and mouse interleukin 21 DNA adjuvant (pVR-IL21) were constructed. BALB/c mice received DNA prime-adenoviral vector boost immunization with pVR-HIVenv-Ad5-HIVenv alone or combined with pVR-IL7,pVR-IL21, Poly(I:C) and CpG ODN. Cellular and humoral immune responses were assessed by IFN-g enzyme-linked immunosorbent spot assay and enzyme-linked immunosorbent assay. Results Compared with those immunized with vaccines alone, the mice immunized with pVR-IL7 had increased specific cellular response (P<0.05), CpG ODN had synergic effects with IL7 as adjuvants(P<0.05) Conclusion IL7 but not IL21 can enhance the specific cellular immune response of Ad5-HIVenv in mice.

HIV vaccine；Adjuvant；IL-7；IL-21

徐柯，Email：xukecdc@163.com；曾毅，Email：zengyicdc@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2016.05.011

HIV疫苗；佐劑；IL-7；IL-21

國家科技重大專項艾滋病和病毒性肝炎等重大傳染病防治(2012ZXl0001009-005,2012ZX10001009-002-002)

2016-03-15)