黃曉宇,袁軍虎,楊巧麗,馬艷萍，滾雙寶,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.河南省漯河市畜牧局,河南 漯河 462000;3.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州 730070)

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煙臺黑豬SLA-DQA基因編碼區(qū)多態(tài)性及生物信息學(xué)分析

黃曉宇1,袁軍虎2,楊巧麗1,馬艷萍1，滾雙寶1,3

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,甘肅 蘭州 730070;2.河南省漯河市畜牧局,河南 漯河 462000;3.甘肅省現(xiàn)代養(yǎng)豬工程技術(shù)研究中心,甘肅 蘭州 730070)

采用 PCR-SSCP、克隆測序和生物信息學(xué)等方法對煙臺黑豬SLA-DQA基因多態(tài)性進(jìn)行研究,預(yù)測其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)并分析其功能特征。結(jié)果顯示:SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 分別檢測出4 種等位基因,5 種基因型、6 種等位基因,8 種基因型、4 種等位基因,7 種基因型,包括3種新等位基因。SLA-DQA基因共編碼 255 個氨基酸,編碼區(qū)共發(fā)現(xiàn) 32 個核苷酸突變和 13 個氨基酸變異,exon 2 多態(tài)性最為豐富。蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示二級結(jié)構(gòu)中無規(guī)則卷曲和延伸鏈比例最高,α 螺旋數(shù)量多且集中,β 折疊最少。功能預(yù)測結(jié)果顯示，SLA-DQA基因蛋白質(zhì)在能量代謝、結(jié)構(gòu)蛋白和生長因子等方面幾率較高。本研究結(jié)果可為SLA-DQA基因在豬抗病分子育種中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

煙臺黑豬;SLA-DQA基因;編碼區(qū);多態(tài)性;蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)

豬的主要組織相容性復(fù)合體即豬白細(xì)胞抗原復(fù)合體(Swine lymphocyte antigen,SLA),是豬染色體上一組緊密連鎖、與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的高度多態(tài)的基因群。SLA抗原定位于 7p12-q12,按其抗原結(jié)構(gòu)和功能主要分為三大類,其中 Ⅱ 類抗原位于SLA-D區(qū),是由34 kDa 的 α 鏈和 29 kDa 的 β 鏈以非共價(jià)鍵結(jié)合的異質(zhì)二聚體,主要包括DRA、DRB、DQA、DQB、DOB、DPA、TAP、LMP等基因[1-3]。SLAⅡ類DQA和DRA基因位于抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面,能夠?qū)⒖乖蔬f給 CD4+T細(xì)胞,從而參與并調(diào)控機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)。基因產(chǎn)物間的變異是特異的抗原結(jié)合和排斥反應(yīng)的基礎(chǔ),抗原結(jié)合位點(diǎn)的多態(tài)性可確定免疫識別相關(guān)的功能性多態(tài),在研究機(jī)體的抗病能力方面具有非常重要的作用。SLA基因是豬染色體中最富有特性的區(qū)域，大量研究表明,具有SLAⅡ 類基因不同基因型的個體對疾病抵抗能力具有明顯差異,不同DQA和DRA基因型顯著影響仔豬腹瀉情況[4-9]。研究顯示不同地域品種豬有各自獨(dú)特的生物多樣性和遺傳穩(wěn)定性特征,使得不同地域特征性的豬種SLAⅡ 基因表現(xiàn)出不同程度的多態(tài)性,人們通過克隆測序等技術(shù)對廣西巴馬豬、海南五指山豬、八眉豬、榮昌豬及湖南沙子嶺豬等不同地域豬種SLAⅡ類基因DQ和DR基因的多態(tài)性水平、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能、同源性進(jìn)行分析[10-14],發(fā)現(xiàn)豬SLA與人類HLA基因之間具有高度的同源性,這種相對低度的免疫排斥反應(yīng),將有助于豬-人異種器官移植免疫排斥反應(yīng)的研究,但目前尚未見到對煙臺黑豬SLAⅡ類基因多態(tài)性的報(bào)道。

煙臺黑豬始產(chǎn)于膠東半島,是以膠東地方灰皮黑豬為基礎(chǔ),經(jīng)選育而成的一種優(yōu)良豬種,具有耐粗飼、易飼養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)、產(chǎn)仔率高等特點(diǎn),對當(dāng)?shù)厣i生產(chǎn)和品種改良起到了重要作用,又因其豬肉品質(zhì)、色澤、口感及風(fēng)味較好,近年來更是倍受消費(fèi)者青睞[15]。因此,探討煙臺黑豬腹瀉的抗病性或易感性對于更好地利用其品種資源優(yōu)勢具有重要意義。

試驗(yàn)以甘肅紅古區(qū)引入的煙臺黑豬為研究對象,采用 PCR-SSCP、克隆測序和生物信息學(xué)軟件等方法,研究煙臺黑豬SLA-DQA基因編碼區(qū)(Coding region,CDS)多態(tài)性,氨基酸組成并對其CDS 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行預(yù)測分析,以期探究煙臺黑豬SLA-DQA基因的遺傳特性、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系以及其作為候選基因在豬抗病育種方面的潛力,為今后在豬遺傳育種候選基因的研究提供一定可靠的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)對象為甘肅省紅古區(qū)黑豬飼養(yǎng)場飼養(yǎng)條件相同的 290頭煙臺黑豬。采集耳組織樣品約 3 g 置于盛有 75% 乙醇的 5 mL EP 管中,并在 DNA 降解前立即送到實(shí)驗(yàn)室保存于-20 ℃。根據(jù) Sambrook等[16]的常規(guī)酚/氯仿抽提法提取基因組 DNA,TE 溶解,用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測 DNA 的純度和濃度,再稀釋成終濃度為 100 ng/μL 置于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 引物設(shè)計(jì)和 PCR 擴(kuò)增

參照 NCBI 數(shù)據(jù)庫SLA-DQA基因序列 (登錄號 AY 303988),采用 Primer 5.0 引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 擴(kuò)增引物,預(yù)期擴(kuò)增片段分別為 378,388,278 bp,引物由大連寶生物公司合成。引物序列參見表 1。

表1 SLA-DQA 基因 exon 2、exon 3、exon 4 的引物序列和 SSCP 反應(yīng)條件

PCR 擴(kuò)增采用 25 μL 的反應(yīng)體系:10×Buffer 緩沖液 2.5 μL,dNTP 1 μL(2.5 mmol/μL),上下游引物各 0.5 μL(10 pmol/μL),TaqDNA聚合酶0.5 μL(5 U/μL),模板 DNA 1 μL(50～100 ng/μL),滅菌 ddH2O 19 μL。PCR 擴(kuò)增條件:預(yù)變性 94 ℃ 3 min;變性 94 ℃ 30 s,退火溫度詳見表 1,延伸 72 ℃ 30 s,35 個循環(huán);最后延伸 72 ℃ 10 min,4 ℃ 保存,PCR 產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的 SSCP 檢測

分別取 3 μLSLA-DQAPCR 產(chǎn)物,加入 7 μL 變性劑(98% 去離子甲酰胺、0.025% 溴酚藍(lán)、0.025% 二甲苯青、10 mmol/L EDTA(pH 值0.8)混合),經(jīng) 98 ℃變性 10 min,迅速冰浴 10 min,上樣于充分預(yù)冷的 10% 非變性聚丙烯酰胺凝膠(Acr∶Bis=39∶1),SLA-DQA基因3個外顯子 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物混合液 4 ℃ 條件下進(jìn)行電泳,電泳條件見表 1,電泳結(jié)束后銀染法顯色。

1.4 基因的克隆測序

根據(jù)不同 SSCP 模型條帶,每種基因型隨機(jī)挑取 3 個不同個體的 PCR 產(chǎn)物,用瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒回收純化,純化后的產(chǎn)物用載體pMD?19-T Vector 連接,構(gòu)建重組質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌(Escherichiacoli)DH5α 菌株;挑選陽性克隆培養(yǎng),培養(yǎng)后進(jìn)行菌液 PCR 擴(kuò)增;菌液 PCR 產(chǎn)物與初始 PCR 產(chǎn)物同時進(jìn)行 SSCP 檢測,再次通過 10% 的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(39∶1),顯色后進(jìn)行模型條帶比較,進(jìn)一步確定測序菌落的正確性,每一種基因型挑選 2 個克隆的菌液 PCR 產(chǎn)物送上海生物工程有限公司進(jìn)行測序。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

PopGene 32 軟件和 PIC軟件(Bostein)[17]計(jì)算基因的多態(tài)性信息,MEGA 5.0 軟件進(jìn)行 DNA 分析和比對;NCBI dbSNP 數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/index.html)分析單核苷酸多態(tài)性;利用 CBS的 Protfun在線軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/ProtFun)預(yù)測蛋白質(zhì)的功能;ExPASY 服務(wù)器 SWISS-MODEL(http://us.expasy.org/)預(yù)測蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu),三維結(jié)構(gòu)同源建模和模型分析。

2 結(jié)果與分析

2.1SLA-DQA基因核苷酸序列多態(tài)性分析

2.1.1 PCR 擴(kuò)增及 SSCP 檢測SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 的 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,目的條帶清晰且無非特異擴(kuò)增者,判斷其擴(kuò)增產(chǎn)物為目的基因,可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)分析。經(jīng) SSCP 檢測,exon 2 檢測到 4 種等位基因(A、B、C、D),共形成 5 種基因型(AA、BB、AB、AC、AD,圖 1-A);exon 3 檢測到了 6 種等位基因(A、B、C、D、E、F),共形成 8 種基因型(AA、BB、AB、CC、BC、DD、EF、CF,圖 1-B);exon 4 檢測到了 4 種等位基因(A、B、C、D),共形成 7 種基因型(AA、BB、AB、CC、BC、AD、BD,圖 1-C)。3個外顯子的等位基因頻率和基因型頻率見表 2。

2.1.2SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 的序列分析 根據(jù)參考序列(AY303988),將克隆測序得到的序列去除引物序列及內(nèi)含子序列,得到有效的外顯子序列,exon 2、exon 3、exon 4 序列長度分別為 249,281,154 bp。將3個外顯子的等位基因序列利用 dbSNP 進(jìn)行比對,結(jié)果發(fā)現(xiàn) exon 2、exon 3、exon 4 序列分別檢測到 20,9,3 個核苷酸突變位點(diǎn)(表 3),共導(dǎo)致 13 個氨基酸發(fā)生變異。SLA-DQA基因3個外顯子中共包括3種新等位基因：exon 2 中 D等位基因含有7個核苷酸突變位點(diǎn),exon 3 中 C等位基因包括一個新的突變位點(diǎn)(c.4828T>C),F等位基因包含一個新的突變位點(diǎn)(c.4617T>C)。各等位基因序列提交至GenBank,獲得的登錄號見表2。核苷酸的突變引起氨基酸的變異,exon 2中D等位基因含有7個核苷酸的突變位點(diǎn),導(dǎo)致3個氨基酸發(fā)生變異,c.3945C>T導(dǎo)致了脯氨酸轉(zhuǎn)化為絲氨酸,c.4086A>G導(dǎo)致了蘇氨酸轉(zhuǎn)化為丙氨酸,c.4099A>C的突變導(dǎo)致了天冬酰胺轉(zhuǎn)化為蘇氨酸;exon 3中C等位基因c.4828T>C的變異導(dǎo)致半胱氨酸轉(zhuǎn)化為精氨酸,F等位基因c.4617T>C導(dǎo)致絲氨酸轉(zhuǎn)化為脯氨酸,均屬于錯義突變。

SLA-DQA基因exon 2(A)、exon 3(B)、exon 4(C)分別檢測到 5,8,7 個SSCP不同的帶型。每種帶型代表一種基因型。

位置Locus等位基因Allele基因型Genotype登錄號AccessionNo.頻率Frequencies頻率Frequencies雜合度Ne有效等位基因數(shù)He多態(tài)信息含量PIC外顯子2A已知 KM4119710.71(412)AA0.46(133)0.391.650.43exon2B已知 KM4119720.15(87)BB0.04(12)C已知 KM4119730.08(46)AB0.22(64)D新發(fā)現(xiàn)KM4119740.06(35)AC0.16(46)AD0.12(35)外顯子3A已知 KM4855550.09(50)AA0.04(12)0.382.630.58exon3B已知 KM4855560.56(325)BB0.40(116)C新發(fā)現(xiàn)KM4855570.15(87)AB0.10(29)D已知 KM4855580.04(23)CC0.02(6)E已知 KM4855590.15(87)BC0.23(67)F新發(fā)現(xiàn)KM4855600.01(6)DD0.04(10)EE0.15(44)CF0.02(6)外顯子4A已知 KM4855510.55(319)AA0.47(138)0.392.550.54exon4B已知 KM4855520.28(162)BB0.18(54)C已知 KM4855530.11(64)AB0.08(22)D已知 KM4855540.06(35)CC0.08(24)AD0.07(20)BC0.06(16)BD0.06(16)

2.1.3SLA-DQA基因 exon 2、 exon 3、 exon 4 遺傳多態(tài)性分析 煙臺黑豬SLA-DQA基因 exon 2、exon 3、exon 4 的基因型和等位基因頻率見表 2。遺傳雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)和多態(tài)信息含量(PIC)是評價(jià)群體遺傳變異的重要指標(biāo),不同的遺傳參數(shù)體現(xiàn)各群體的遺傳差異性。由表 2可以看出,煙臺黑豬SLA-DQA基因3個外顯子的 He 值為1.65～2.63,雜合度較高;根據(jù) Vaiman 等[18]的研究結(jié)論,exon 2的PIC值為 0.43,表現(xiàn)為中度多態(tài)性(PIC<0.50),exon 3、exon 4 的PIC值分別為 0.58,0.54,表現(xiàn)為高度多態(tài)性(PIC>0.50)。

表3 煙臺黑豬 SLA-DQA 基因 exon 2、exon 3、exon 4 突變位點(diǎn)

注:方框標(biāo)記為新突變位點(diǎn)。

Note:The box marked are the novel mutation sites.

2.2SLA-DQA基因 CDS 區(qū)蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)功能預(yù)測

2.2.1SLA-DQA基因蛋白質(zhì)功能特性預(yù)測 對比 GenBank 數(shù)據(jù)庫SLA-DQA基因的參考序列登錄號AY303988，煙臺黑豬SLA-DQA基因CDS核苷酸序列長度為768 bp，共編碼255個氨基酸，SLA-DQA基因與AY303988的CDS氨基酸對比結(jié)果詳見圖 2。SLA-DQA基因與 AY303988 的 CDS 蛋白質(zhì)功能預(yù)測詳見表 4,由表 4可以看出，預(yù)測的磷酸化位點(diǎn),轉(zhuǎn)移數(shù)差異較大,能量代謝、結(jié)構(gòu)蛋白、脂肪酸代謝和等電點(diǎn)數(shù)值均較高。SLA-DQA基因蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測見圖 3,其中 α 螺旋率 22.35%(57個),β 折疊率6.67%(17個),無規(guī)則卷曲率 40.00%(102個),延伸鏈率為 30.98%(79個)。

箭頭標(biāo)記的氨基酸為配位體,由氨基酸序列的第144位天冬酰胺(N),192位谷氨酸(E)和193位組氨酸(H)組成。

功能類別FunctionalcategorySLA-DQA AY303988 氨基酸生物合成Aminoacidbiosynthesis0.4140.567能量代謝Energymetabolism2.3412.313轉(zhuǎn)化Translation -1.117信號轉(zhuǎn)導(dǎo)Signaltransducer0.3980.390受體Receptor0.0440.047結(jié)構(gòu)蛋白Structuralprotein5.6485.830轉(zhuǎn)錄Transcription1.7151.708離子通道Ionchannel0.1470.147生長因子Growthfactor5.5645.564預(yù)測的磷酸化位點(diǎn)Putativephosphorylationsites10個(93、155、231、335、416、473、474、557、712、741)14個(93、155、172、173、231、335、354、355、416、473、474、557、712、741)信號肽概率Signalpeptideprobability0.8590.859信號錨概率Signalanchorprobability0.0490.049脂肪酸代謝Fattyacidmetabolism1.2651.265等電點(diǎn)Isoelectricpoint5.095.09

c.無規(guī)則卷曲區(qū);e.延伸鏈區(qū);h.α-螺旋區(qū);t.β-折疊區(qū)。

2.2.2SLA-DQA基因蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)的同源建模 通過在線軟件 SWISS-MODEL 數(shù)據(jù)庫 Blast 進(jìn)行分析,以序列 3pl6.1.A(2.55?)[19]為模板,對提交的SLA-DQA基因氨基酸序列進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)同源建模,預(yù)測了第 25-206 位氨基酸的三維結(jié)構(gòu),占氨基酸總長度的70.6%，模型結(jié)果見圖 4。SLA-DQA基因與模板序列相似性為 0.55%,序列覆蓋率為 76%,序列一致性達(dá)到 80.93%。全球模型質(zhì)量評估(GMQE)得分為 0.69[20-21]。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)1個 N-糖蛋白配位體(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG),分子式為 C8H15NO6,分子量為 221.208 g/mol。在SLA-DQA基因蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)模型中還預(yù)測到一個配位體，該配位體是由蛋白質(zhì)序列上的第144位N(天冬酰胺)，第192位E(谷氨酸)和第193位H(組氨酸)3個氨基酸組成(圖2， 4)。

圖4 煙臺黑豬 SLA-DQA基因蛋白三級結(jié)構(gòu)模型預(yù)測

2.2.3SLA-DQA基因三維結(jié)構(gòu)合理性分析 運(yùn)用 DeepView 軟件拉式構(gòu)圖檢測模擬SLA-DQA基因蛋白質(zhì)三維模型的合理性。模擬蛋白質(zhì)三維模型包括 182 個氨基酸,其中 178 個氨基酸殘基(97.8%)的二面角落在允許的范圍內(nèi)(a區(qū)域),僅有 4 個氨基酸殘基(2.2%)的二面角落在不允許范圍內(nèi)(a區(qū)域外,b區(qū)域內(nèi)為不完全允許區(qū)，c區(qū)域內(nèi)為不允許區(qū))(圖 5)。結(jié)果表明，SLA-DQA基因的三維模型的二面角分布和立體構(gòu)象合理,均符合立體化學(xué)的二面角 (φ,ψ)分布要求。

a.允許區(qū);b.臨界限制區(qū);c.不允許區(qū)。

3 討論與結(jié)論

豬的SLA基因是基因組中最具遺傳多態(tài)性的基因,截至目前,在豬的 MHC數(shù)據(jù)庫中僅定義了 20DQA、44DQB、13DRA、82DRB1 種等位基因,相較于 β 鏈DQB和DRB基因的高度多態(tài)性,α 鏈DQA基因一般呈現(xiàn)出中等程度多態(tài)性,這種核苷酸的多態(tài)性將會導(dǎo)致相應(yīng)氨基酸的變化,可能會影響SLAⅡ類 α 鏈基因的功能[22],較低的DQA基因多態(tài)性可能是由降低的積極選擇壓力造成的[2]。自然選擇過程中等位基因的積累和融合、生存環(huán)境、個體對外來抗原的選擇壓力的差異以及病原體驅(qū)動下的核苷酸替換都有利于等位基因多態(tài)性的進(jìn)化[23],通過MHC基因的變異對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行分析和預(yù)測,可有效地評估種群遺傳多樣性水平,為更加深入的研究SLA-DQA基因作為疾病和生產(chǎn)的候選基因提供理論基礎(chǔ)。

本試驗(yàn)在SLA-DQA基因 CDS 區(qū)共檢測到 32 個SNPs,具有豐富的遺傳多態(tài)性。其中 exon 2 檢測 4 種等位基因和5種基因型(AA、BB、AB、AC和AD),沒有檢測到 BC 型,與孔晶晶[24]的研究結(jié)果相比,發(fā)現(xiàn)有2種基因型完全一致,2種等位基因不相同,進(jìn)一步說明SLA-DQA基因外顯子 2 具有非常豐富的多態(tài)性。SLA-DQA基因的3個外顯子多態(tài)性分布極不平衡,exon 2 包括20 個核苷酸變異位點(diǎn),A 等位基因頻率為 0.71,屬于優(yōu)勢等位基因,多態(tài)性最豐富,exon 3 和 exon 4 分別包括 9,3 個核苷酸變異位點(diǎn),exon 3 中 B 等位基因和 exon 4 中 A等位基因的基因頻率分別為0.56和0.55,高于其他等位基因頻率,屬于優(yōu)勢等位基因,exon 3 和 exon 4 基因多態(tài)性較低,這種現(xiàn)象可能與基因的保守性有關(guān)。保守性機(jī)制是由基因在動物機(jī)體擔(dān)任重要功能所決定,具有調(diào)節(jié)和控制機(jī)體的免疫應(yīng)答、抵御外源環(huán)境壓力、維持正常生理功能和自身進(jìn)化的作用。煙臺黑豬作為地方性選育豬種,長期受到人工選擇的壓力作用,打破了個體交配的隨機(jī)性,造成基因分布的不平衡,使得某種基因型成為特定基因位點(diǎn)的優(yōu)勢基因型。SLA-DQA基因 exon 2 的 PIC值為 0.25～0.50。表現(xiàn)為中度多態(tài),這與Liu 等[5]、Yang等[8]、Ho等[22]和 Lunney等[1]的研究結(jié)果一致。MHC 基因組外顯子功能區(qū)堿基的變異將導(dǎo)致功能區(qū)氨基酸的突變,從而影響蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性,最終在抗原的識別與遞呈、免疫應(yīng)答與調(diào)控等方面發(fā)揮作用。

本試驗(yàn)中SLA-DQA基因氨基酸序列包含α螺旋、β折疊、無規(guī)則卷曲和延伸鏈的氨基酸數(shù)分別為 57,17,102,79個。α 螺旋和 β 折疊2種結(jié)構(gòu)均含有氫鍵,鍵能較高,能夠牢固地維持蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)且常位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部;延伸鏈和無規(guī)則卷曲區(qū)域所占比例最高,屬柔型結(jié)構(gòu),易發(fā)生扭曲,常出現(xiàn)于蛋白表面并與表面抗原結(jié)合。SLA-DQA基因與 AY303988 編碼蛋白的能量代謝、脂肪酸代謝、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、生長因子的幾率均呈現(xiàn)相對較高現(xiàn)象(表 4),其中結(jié)構(gòu)蛋白和生長因子的幾率最高,說明該基因可能對豬的抗原結(jié)合能力和生產(chǎn)力起到較高的調(diào)節(jié)作用[23]。

同源建模是一種根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)保守穩(wěn)定性遠(yuǎn)大于蛋白氨基酸序列的理論預(yù)測蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的方法,如果氨基酸序列相似性達(dá) 30% 以上,則可用已知蛋白結(jié)構(gòu)作為模板[21,25]模擬蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)。本試驗(yàn)中預(yù)測的SLA-DQA基因蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)只含有一條 α 鏈,由第 25-206 位氨基酸組成 α 鏈的編碼區(qū),占編碼氨基酸總長度的 70.6%,是蛋白質(zhì)行使生物功能的主要區(qū)域。SLA-DQA基因三維結(jié)構(gòu)合理性分析中,α-螺旋主要出現(xiàn)在坐標(biāo)軸的第三象限,β-折疊主要出現(xiàn)在第二象限,且均在a區(qū)域內(nèi),說明所形成的二面角(φ,ψ)構(gòu)象能量最低且穩(wěn)定,符合立體化學(xué)所允許的構(gòu)象圖。對蛋白質(zhì)分子高級結(jié)構(gòu)的研究有助于闡明SLA分子與多肽的結(jié)合規(guī)律及其免疫應(yīng)答的特征,使人們對SLA-DQA基因蛋白的生物分子結(jié)構(gòu)更加直觀、形象,便于今后深入探究SLA-DQA的致病機(jī)理、免疫機(jī)制等分子生物學(xué)功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。

配位體能夠提供電子與中心原子反應(yīng),保護(hù)中心原子的官能團(tuán)而穩(wěn)定化合物。本試驗(yàn)中預(yù)測到一個配位體,由 α 鏈上第 144 位 N(天冬酰胺),第 192 位 E(谷氨酸),第 193 位 H(組氨酸)形成,可與 NAG 接觸產(chǎn)生反應(yīng)形成髓鞘堿性蛋白多肽(Myelin basic protein peptide,MBP)結(jié)合位點(diǎn)。MBP 是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘的主要蛋白質(zhì),位于髓鞘漿膜面,能夠維持髓鞘結(jié)構(gòu)和功能的穩(wěn)定性,具有神經(jīng)組織特異性。1962 年,Laatsch 等[26]首先從豚鼠腦中分離出 MBP,血清中 MBP 的含量可作為判斷 CNS 破壞程度的重要指標(biāo)。信號肽是蛋白多肽鏈中用于指導(dǎo)蛋白質(zhì)跨膜轉(zhuǎn)移(定位)的 N-末端的氨基酸序列,一般由 15～30 個氨基酸組成,蛋白成熟后信號肽將被剪切掉。該試驗(yàn)中沒有預(yù)測到信號肽存在,這個結(jié)果可避免試驗(yàn)中所預(yù)測到的 N-糖基化位點(diǎn),磷酸化位點(diǎn)和抗原表位等落在信號肽區(qū)域而被剪切掉。蛋白質(zhì)的糖基化是最重要的翻譯后修飾之一,與蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系密切。糖基化調(diào)控蛋白質(zhì)在組織和細(xì)胞中的定位、功能和活性[27],糖基化位點(diǎn)發(fā)生變化可能與疾病的發(fā)生有關(guān)[28],在DQ基因 α 鏈上,第 82 和 121 位的氨基酸是2個糖基化位點(diǎn)[29],其中第 82 位氨基酸位置對應(yīng)于 exon 2 區(qū)域 4 134～4 145 bp 的核苷酸,即為糖基化修飾區(qū)域。蛋白質(zhì)的糖基化修飾能夠影響多肽的構(gòu)象,使多肽鏈具有一定剛性,達(dá)到增強(qiáng)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的作用。因此,SLA-DQA基因潛在的糖基化位點(diǎn)有可能與某些疾病密切相關(guān)。

SLA多態(tài)性的差異與豬對疾病抵抗能力的強(qiáng)弱有關(guān)。通過開展煙臺黑豬SLA-DQA 基因多態(tài)性研究,建立和探討了 CDS 區(qū)蛋白質(zhì)的二級、三級結(jié)構(gòu)模擬圖,并對蛋白質(zhì)的功能和作用有了更進(jìn)一步的了解,本研究結(jié)果為更好地了解 MHC 復(fù)合體及其在豬的抗病育種中的應(yīng)用提供了重要的理論依據(jù)。

[1] Lunney J K,Ho C S,Wysocki M,et al.Molecular genetics of the swine major histocompatibility complex,the SLA complex[J].Developmental and Comparative Immunology,2009,33(3,SI):362-374.

[2] Moutou K A,Koutsogiannouli E A,Stanmatis C,et al.Domestication does not narrow MHC diversity inSusscrofa[J].Immunogenetics,2013,65(3):195-209.

[3] Luetkemeier E S,Malhi R S,Beever J E,et al.Diversification of porcine MHC class Ⅱ genes:evidence for selective advantage[J].Immunogenetics,2009,61(2):119-129.

[4] Bao W B,Ye L,Pan Z Y,et al.Microarray analysis of differential gene expression in sensitive and resistant pig toEscherichiacoliF18[J].Animal Genetics,2012,43(5):525-534.

[5] Liu L X,Zhao S G,Lu H N,et al.Association between polymorphisms of the swineMHC-DQAgene and diarrhoea in three Chinese native piglets[J].International Journal of Immunogenetics,2015,42(3):208-216.

[6] Huang X Y,Yang Q L,Yuan J H,et al.Polymorphism and haplotype analyses of swine leukocyte antigen DQA exons 2,3,4,and their associations with Piglet diarrhea in Chinese native pig[J].Genetics and Molecular Research,2015,14(3):10461-10472.

[7] Yang Q L,Zhao S G,Wang D W,et al.Association between genetic polymorphism in the Swine Leukocyte antigen-DRA gene and piglet diarrhea in three Chinese pig breeds[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2014,27(9):1228-1235.

[8] Yang Q L,Kong J J,Wang D W,et al.Swine leukocyte antigen-DQA gene variation and its association with piglet diarrhea in large white,landrace and duroc[J].Asian-Australasian Journal of Animal Sciences,2013,26(8):1065-1071.

[9] 楊巧麗,孔晶晶,趙生國,等.豬SLA-DRA基因外顯子2多態(tài)性及其與仔豬腹瀉的關(guān)聯(lián)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(7):1020-1027.

[10] 劉子展,王在貴,李 奎,等.廣西巴馬小型豬白細(xì)胞抗原經(jīng)典Ⅱ類基因克隆及生物信息學(xué)分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(9):1353-1359.

[11] Zheng X L,Wang F,Wei L M,et al.Cloning and cDNA sequence analysis ofSLA-DQAgene from Hainan wuzhishan miniature pig[J].Animal Husbandry and Feed Science,2009,1(1):17-21.

[12] 劉麗霞,張 麗,趙生國,等.八眉豬DQA基因編碼區(qū)多態(tài)性及生物信息學(xué)分析[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào),2015,30(1):103-108.

[13] 白小青,劉 文,黃 微,等.榮昌豬SLA-DQB基因β1結(jié)構(gòu)域突變分析及蛋白質(zhì)序列模式預(yù)測[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào),2012,43(8):1306-1309.

[14] 唐醫(yī)亞,邢曉為,薛立群,等.湖南沙子嶺豬SLA-DR基因克隆及生物信息學(xué)分析[J].遺傳,2007,29(12):1491-1496.

[15] 許剛璞,許瑜偉.煙臺黑豬的調(diào)查報(bào)告[J].中國畜禽種業(yè),2011,7(6):61-62.

[16] Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning:A laboratory manual[M].Beijing:Science Press,1996:464-467.

[17] Botstein D,White R L,Skolnick M,et al.Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms[J].American Journal of Human Genetics,1980,32(3):314-331.

[18] Vaiman D,Mecier D,Moazmi-Goudarzi K,et al.A set of 99 cattle mircosatellites:characterization,synteny mapping and polymorphism[J].Mammalian Genome,1994,5(5):288-297.

[19] Sethi D K,Schubert D A,Anders A,et al.A highly tilted binding mode by a self-reactive T cell receptor results in altered engagement of peptide and MHC[J].Journal of Experimental Medicine,2011,208(1):91-102.

[20] Lee K H,Wucherpfennig K W,Wiley D C.Structure of a human insulin peptide HLA-DQ8 complex and susceptibility to type 1 diabetes[J].Nature Immunology,2001,2(6):501-507.

[21] Arnold K,Bordoli L,Kopp J,et al.The SWISS-MODEL workspace:a web-based environment for protein structure homology modelling[J].Bioinformatics,2006,22(2):195-201.

[22] Ho C S,Lunney J,Ando A,et al.Nomenclature for factors of the SLA system,update 2008[J].Tissue Antigens,2009,73(4):307-315.

[23] Garamszegi L Z,De Groot N G,Bontron R E.Correlated evolution of nucleotide substitution rates and allelic variation in MHC-DRB lineages of primates[J].BMC Evolutionary Biology,2009,9:73.

[24] 孔晶晶.三個豬品種SLA-DQA基因多態(tài)性與仔豬腹瀉的相關(guān)性分析[D].蘭州:甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[25] Biasini M,Bienert S,Waterhouse A,et al.SWISS-MODEL:modelling protein tertiary and quaternary structure using evolutionary information[J].Nucleic Acids Research,2014,42(W1):W252-W258.

[26] Laatsch R L.Glycerol phosphate dehydrogenase activity of developing rat central nervous system[J].Journal of Neurochemistry,1962(9):487-492.

[27] Arnold J N,Wormald M R,Sim R B,et al.The impact of glycosylation on the biological function and structure of human immunoglobulins[J].Annual Review of Immunology,2007,25:21-50.

[28] Litynska A,Przybyuulo M,Pochec E,et al.Comparison of the lectin-binding pattern in different human melanoma cell lines[J].Melanoma Research,2001,11(3):205-212.

[29] Chardon P,Renard C,Vaiman M.The major histocompatibility complex in swine[J].Immunological Reviews,1999,167(1):179-192.

Polymorphism and Bioinformatics Analysis ofSLA-DQAGene CDs in Yantai Black Pig

HUANG Xiaoyu1,YUAN Junhu2,YANG Qiaoli1,MA Yanping1，GUN Shuangbao1,3

(1.College of Animal Science and Technology,Gansu Agricultural University,Lanzhou 730070,China;2.Henan Luohe Animal Husbandry Bureau,Luohe 462000,China;3.Gansu Research Center for Swine Production Engineering and Technology,Lanzhou 730070,China)

The PCR-SSCP,cloning sequencing and bioinformatics methods were used to explore the Yantai black pigSLA-DQAgene coding polymorphisms,structural prediction and functional characteristics of the protein.The results showed thatSLA-DQAgene exon 2,exon 3 and 4 were detected 4,6,4 alleles and 5,8,7 genotypes,respectively,and three new alleles were found for the first time.TheSLA-DQAcoding region encoded 255 amino acids,32 nucleotide mutations and 13 amino acid mutations were found,and exon 2 showed the most polymorphism.Protein prediction results showed that random coil and extended chain accounted for the highest level,alpha helix distribution concentrated,beta sheet appeared the least.The putative result ofSLA-DQAgene protein function showed that the odds of energy metabolism,structural protein and growth factor were higher.These results could provide the theory foundation for the application ofSLA-DQAgene to pig disease resistance molecular breeding.

Yantai black pig;SLA-DQAgene;Coding region;Polymorphism;Protein structure

2016-06-18

DQA和DRA基因與仔豬腹瀉死亡的分子標(biāo)記技術(shù)項(xiàng)目(GNSW-2008-04);高繁殖力豬新品系選育研究項(xiàng)目(092NKDA036);甘肅省優(yōu)質(zhì)豬肉生產(chǎn)配套技術(shù)研究與示范項(xiàng)目(0804NKCA065)

黃曉宇(1989-),女,河南蘭考人,在讀博士,主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。

滾雙寶(1967-),男,甘肅張掖人,教授,博士,主要從事動物遺傳育種與繁殖研究。

S828;Q78

A

1000-7091(2016)05-0086-08

10.7668/hbnxb.2016.05.013