黃瓜棒孢葉斑病病菌產毒條件及毒素活性檢測

高葦　王勇　張春祥

摘要：為明確黃瓜棒孢葉斑病病原菌多主棒孢的最佳產毒培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間，本研究從天津地區(qū)采集的黃瓜棒孢葉斑病葉片上分離到強致病菌株HG2，通過種子萌發(fā)生長法、葉片萎蔫法、葉片圓盤法及懸滴接種法4種方法測定其粗毒素的生物活性。結果表明，黃瓜多主棒孢菌最適產毒培養(yǎng)基為改良Czapek培養(yǎng)基，培養(yǎng)時間為21～25d，種子萌發(fā)生長法和葉片萎蔫法更適合粗毒素活性測定。

關鍵詞：多主棒孢菌；培養(yǎng)條件；粗毒素；毒素活性

中圖分類號：S436.421.1⁺9 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2016）04-0094-04

黃瓜棒孢葉斑病是由多主棒孢菌（Corynspo-ra cassiicola）引起的一種真菌性病害，主要侵染植物葉片、莖、花和果實，嚴重時造成落葉、落果等現(xiàn)象。在我國，1993年，河南、遼寧等報道過黃瓜栽培地普遍受到多主棒孢菌侵染。近年來，山東、河北、北京、遼寧、吉林、河南、海南等絕大多數(shù)黃瓜栽培地棒孢葉斑病危害嚴重，給農民帶來巨大的經濟損失，成為黃瓜生產中的主要病害。在黃瓜棒孢葉斑病的防治中，抗病品種選育是最經濟、有效的措施。因此，選育抗黃瓜棒孢葉斑病綜合性狀優(yōu)良的黃瓜品種對其產業(yè)發(fā)展具有重要意義。

植物病原真菌可以分泌產生毒素，使寄主植物產生特定的病癥反應，在植物病害的發(fā)生過程中具有明顯的致病作用。近年來，人們日益關注植物病原真菌產生的一系列毒素在寄主品種抗病性快速鑒定、抗病性突變體篩選等抗病育種研究方面的應用，探索誘導病原菌產毒條件的研究成為新的熱點。目前，關于侵染橡膠樹的病原真菌多主棒孢菌毒素的分離提取、活性成分鑒定方面已有部分研究報道，發(fā)現(xiàn)多主棒孢菌產生的毒素cassiicolin是一種寄主選擇性毒素。同時，研究顯示侵染橡膠和黃瓜的多主棒孢菌在菌株的形態(tài)學、致病力及系統(tǒng)發(fā)育上都存在顯著差異，而對于侵染黃瓜的多主棒孢菌毒素的研究報道較少。本研究對黃瓜多主棒孢菌產毒最適條件及毒素活性檢測方法進行研究，以期找到該病原菌產毒的最適培養(yǎng)基及培養(yǎng)時間，建立簡單、可比較的毒素活性檢測方法，為黃瓜抗棒孢葉斑病毒素致病機制及其在抗病品種、抗病突變體篩選等方面的應用研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

黃瓜棒孢葉斑病典型的發(fā)病標本于2012年9月采集于天津市西青區(qū)張家窩村。按常規(guī)組織分離方法分離獲得病原菌，經純化及單孢分離獲得12株黃瓜多主棒孢菌純培養(yǎng)菌株。該菌株可以侵染黃瓜，在黃瓜真葉上形成黃色的圓形或不規(guī)則形病斑。依據(jù)柯赫氏法則進行致病力鑒定，獲得致病力較強的菌株HG2，作為產毒培養(yǎng)基篩選的靶標菌株。

1.2 黃瓜多主棒孢菌粗毒素濾液的制備

本試驗采用以下4種液體培養(yǎng)基：（1）改良Fries培養(yǎng)基：蔗糖30g，酒石酸銨5g，NH₄NO₃1g，MgSO₄0.5g，NaCl0.5g，CaCl₂0.1g，酵母膏0.5g，蒸餾水1L，調pH值至7.0。（2）PD培養(yǎng)基：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，加蒸餾水至1L。（3）改良Czapek培養(yǎng)基：蔗糖30g，L-谷氨酸2.2g，KCl1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.01g，ZnSO₄·7H₂O0.01g，CuSO₄·7H₂O0.01g，蒸餾水1L，調pH值至7.0。（4）Richard培養(yǎng)基：蔗糖50g，KNO₃10g，K₂HPO₄5g，MgSO₄2.5g，F(xiàn)eCl₃0.02g，蒸餾水1L。

在250mL三角瓶中分別加入150mL上述液體培養(yǎng)基，每種液體培養(yǎng)基24瓶。將供試黃瓜多主棒孢菌菌株移至PDA培養(yǎng)基上活化，于25℃下培養(yǎng)10d，用直徑4mm的打孔器在長勢一致的菌落邊緣打取菌餅，每瓶接種5塊菌餅，在黑暗條件下，25℃、120r/min搖床振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)第3、5、7、10、15、21、25、30d每種培養(yǎng)液每次分別取3瓶。將培養(yǎng)液通過雙層滅菌濾紙過濾除去菌絲體，后用0.22μm微孔濾膜加壓抽濾，獲得無菌濾液，即多主棒孢菌粗毒素濾液。-4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 黃瓜多主棒孢菌粗毒素生物活性的測定

1.3.1 對黃瓜種子的活性 采用種子萌發(fā)生長法測定粗毒素濾液對黃瓜種子的活性。選擇中農5號黃瓜品種，將50粒黃瓜種子置于鋪有雙層滅菌濾紙的培養(yǎng)皿內，分別加入不同處理獲得的粗毒素濾液5mL，以加無菌水為空白對照。每處理3皿。在28℃培養(yǎng)箱中催芽36h，統(tǒng)計種子發(fā)芽情況，測量芽長，計算發(fā)芽率。

1.3.2 對黃瓜離體葉片的活性 ①葉片萎蔫法。取20mL燒瓶，分別加入各處理獲得的粗毒素濾液5mL，將采集的同一生長期的黃瓜葉片浸入濾液中，以浸入5mL無菌水為空白對照。每處理重復3瓶。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d（光周期為12h）。毒素作用會使黃瓜葉片發(fā)生萎蔫，通過葉片干重和濕重的百分比，來確定毒素作用導致葉片的萎蔫程度。萎蔫強度（%）=（處理的干重濕重百分比-對照的干重濕重百分比）/對照的干重濕重百分比×100。

②葉片圓盤法。將采集的同一生長期的黃瓜葉片用直徑1cm的打孔器打取葉盤，然后每20個葉盤為一個重復，立即浸入含有10mL多主棒孢粗毒素濾液的直徑為9cm的培養(yǎng)皿中（將葉盤背面朝下），以浸入10mL無菌水為空白對照。每處理重復3次。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d（光周期為12h）。毒素作用會使黃瓜葉盤褪綠變黃，通過葉盤的變黃程度來衡量毒素活性。

③毒素懸滴接種葉片法。采集同一生長期的黃瓜葉片，將其放在鋪有兩層浸濕濾紙的大培養(yǎng)皿中，在黃瓜葉片背面左右兩側懸滴接種20μL粗毒素濾液，以接種20μL無菌水為空白對照。每處理重復3皿，每皿放入1片黃瓜葉片。25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d（光周期為12h）。毒素作用會使黃瓜葉片自接種點位置褪綠變黃，采用十字交叉法測定形成的圓形病斑大小，通過病斑面積、接種點葉片變黃程度衡量毒素活性大小。

2 結果與分析

2.1 菌株粗毒素濾液對黃瓜種子生長的抑制作用

該病原菌在4種培養(yǎng)基中均能正常生長，其中在PD液體培養(yǎng)基中菌絲生長較快，培養(yǎng)10d后菌絲量較多，培養(yǎng)濾液顯著少于其它培養(yǎng)基，菌絲聚集纏繞形成較大的菌球。在其它3種培養(yǎng)基中，菌絲生長緩慢，形成較小的菌絲球。

通過不同培養(yǎng)基、不同時間收集的定量培養(yǎng)濾液對黃瓜種子萌發(fā)和胚芽生長的影響試驗測定發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)基處理的出芽率和芽長隨培養(yǎng)時間的增長均呈現(xiàn)先減少再增加的趨勢，其中改良Fries培養(yǎng)基和Richard培養(yǎng)基處理在培養(yǎng)15～21d、PD培養(yǎng)基培養(yǎng)基處理在培養(yǎng)10～15d、改良Czapek培養(yǎng)基處理在培養(yǎng)21～25d最低。在所有處理中，PD培養(yǎng)基培養(yǎng)的多主棒孢菌產生的毒素濾液對黃瓜種子萌發(fā)和生長的抑制作用相對較小，改良Czapek培養(yǎng)基培養(yǎng)的多主棒孢菌培養(yǎng)濾液對黃瓜種子萌發(fā)生長的影響最為顯著，在培養(yǎng)的21d濾液毒素濃度最大，抑制作用最強（表1）。

2.2 葉片萎蔫法測定粗毒素濾液對黃瓜離體葉片的活性

4種培養(yǎng)基在不同培養(yǎng)時間產生的濾液對黃瓜離體葉片的萎蔫強度比較試驗結果（表2）發(fā)現(xiàn)，毒素濾液可使黃瓜葉片的萎蔫強度顯著增加，經清水對照處理的葉片萎蔫強度在10%左右，而粗毒素培養(yǎng)濾液處理后萎蔫強度可達18%左右。其中，各培養(yǎng)基處理葉片萎蔫強度隨培養(yǎng)時間的增長均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，改良Fries培養(yǎng)基和Richard培養(yǎng)基處理在培養(yǎng)21d、PD培養(yǎng)基培養(yǎng)基處理在培養(yǎng)15d、改良Czapek培養(yǎng)基處理在培養(yǎng)25d最低。在所有處理中，改良Czapek培養(yǎng)基培養(yǎng)的多主棒孢菌在第25d產生的毒素濾液活性最大，達18.380%，顯著高于其它培養(yǎng)基產生的濾液活性。

2.3 葉片圓盤法測定粗毒素濾液對黃瓜離體葉片的活性

利用不同培養(yǎng)基和培養(yǎng)時間獲得的粗毒素濾液侵泡葉盤，在多主棒孢菌培養(yǎng)5d后PD和改良Czapek培養(yǎng)基獲得的粗毒素濾液對處理的黃瓜葉盤出現(xiàn)毒害作用，使其褪綠變黃；而改良Fries培養(yǎng)基和Richard培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后獲得的粗毒素濾液對黃瓜葉盤產生毒害作用，說明其產生的毒素活性弱于PD和改良Czapek培養(yǎng)基獲得的毒素濾液。第15d時4種培養(yǎng)基獲得的毒素濾液均產生顯著的毒害作用（表3）。

2.4 毒素懸滴接種葉片法測定粗毒素濾液對黃瓜離體葉片的活性

多主棒孢菌液體培養(yǎng)7d的毒素濾液懸滴接種黃瓜葉片，在接種后第5d調查時均未有發(fā)病癥狀，毒素濾液對黃瓜葉片不具有毒害作用。培養(yǎng)10d后的濾液懸滴接種黃瓜離體葉片時，在第5d觀察時表現(xiàn)出接種點褪綠變黃，發(fā)病面積小于1cm²，產生較小毒害作用。培養(yǎng)15～30d后產生的毒素濾液對黃瓜離體葉片的毒害作用較強，產生面積較大的毒素侵染斑（表4）。

3 結論與討論

本試驗結果說明，多主棒孢菌產毒能力與其培養(yǎng)基成分密切相關，在改良Czapek培養(yǎng)基中培養(yǎng)產生毒素的活性最高，可作為其最適培養(yǎng)基；在PD培養(yǎng)基中產毒活性較低，但菌絲生長量最大，更適合該病原菌的營養(yǎng)繁殖。在相同培養(yǎng)條件下，培養(yǎng)時間對毒素活性也具有顯著影響，改良Czapek培養(yǎng)基中培養(yǎng)21～25d，產毒活性最大，培養(yǎng)時間過長對毒素活性具有抑制作用。種子萌發(fā)生長法和葉片萎蔫度法均可對毒素活性進行量化比較，而葉盤法及懸滴接種法主要通過癥狀觀察衡量毒素活性強弱，因此筆者認為在粗毒素產生條件的篩選試驗中，在獲得的毒素濃度有限的條件下，種子萌發(fā)生長法和葉片萎蔫度法兩種活性測定方法更適用。