黃昌謀

(新疆阿瓦提縣拜什艾日克鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,新疆阿瓦提 843200)

犢牛腹瀉腸球菌分離鑒定及生物膜篩選條件分析

黃昌謀

(新疆阿瓦提縣拜什艾日克鎮(zhèn)畜牧獸醫(yī)站,新疆阿瓦提 843200)

基于臨床上犢牛腹瀉的高發(fā)病率，致使犢牛死亡嚴重，給養(yǎng)牛業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。本實驗采用細菌常規(guī)分離鑒定方法和96孔板微量滴定法。篩選出腸球菌及其生物膜；研究生物膜的生長特性。共篩得細菌214株，其中，腸球菌24株；腸球菌所占的比例為11.21%。利用96孔微量板測定，得到生物膜陽性菌1株。生物膜陽性率為4.17%。為臨床上犢牛腹瀉的診斷和治療提供依據(jù)。

犢牛腹瀉生物膜腸球菌

犢牛腹瀉是犢牛常發(fā)的一種胃腸疾病。犢牛常在出生后2～3d開始發(fā)病，對犢牛的發(fā)育、生長、成活等有很大影響。在大群飼養(yǎng)時，犢牛腹瀉發(fā)生率常達90%～100%，死亡率最高可達50 %以上，對奶業(yè)的發(fā)展威脅很大。本實驗采取在腸球菌培養(yǎng)基中添加奶粉，以期促進其生物膜生長，并且尋找到最適宜生物膜生長的脫脂奶粉梯度和培養(yǎng)時間梯度，為犢牛腹瀉的診斷和治療提供依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗樣品

本試驗樣品全部為犢牛腹瀉的糞樣，采自新疆生產(chǎn)建設兵團農(nóng)一師某團牛場的犢牛樣品共計16份。其中所有犢牛年齡均在15日以下。

1.2 實驗試劑

腦心浸液瓊脂培養(yǎng)基[BHI]（BD生產(chǎn)）；脫脂奶粉（BD生產(chǎn)）；普通瓊脂；過氧化氫；革蘭氏染色所需試劑（結晶紫，酒精，沙黃，碘液）；腸球菌瓊脂即膽汁七葉苷疊氮鈉（BD生產(chǎn)）；pH試紙；生理鹽水。

1.3 試驗儀器

全波長酶標儀（Power Wave XS美國產(chǎn)）；隔水式恒溫培養(yǎng)箱（GHP-9080上海一恒科學儀器有限公司）；無菌操作臺（SWCJ-2F上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；進口U型96孔板（3599）購自Corning Costar產(chǎn)品；立式壓力蒸汽滅菌器（LZDX－50KB上海申安醫(yī)療器械廠）；電子天平（XM4039SHMAD-ZU Corporation）；顯微鏡；燒杯；量筒；錐形瓶；注射器；載玻片；移液器；平皿。

2 實驗方法

2.1 樣品采集及處理

樣品接種于LB液體培養(yǎng)基中，振搖24h，再于LB固體平板上劃線培養(yǎng)。37℃24h培養(yǎng)，挑取單菌落，接種于另一LB平板上，繼續(xù)37℃24h培養(yǎng)。挑取每一菌落的部分做革蘭氏染色，進行鏡檢。

2.2 生化實驗鑒定

進一步確定具體菌種，接種單菌落于膽汁七葉苷疊氮鈉培養(yǎng)基（腸球菌鑒別培養(yǎng)基），腸球菌在此培養(yǎng)基上變黑，故可分離出腸球菌。

2.3 溶血試驗

根據(jù)腸球菌溶血現(xiàn)象的不同，可分αβγ型血平板：普通瓊脂加熱待其冷卻至50℃+5%的家兔鮮血，即每100m1普通瓊脂加入5m1兔血。

2.4 保菌

細菌懸浮液取1m1在離心機轉速為13000rpm/min離心3min，棄上清液取1m1繼續(xù)離心（13000rpm/min，3min），棄上清液，加等量80%的甘油混合，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 菌株活化

移液器吸取離心管中50μ1菌液入LB液體培養(yǎng)基，靜置過夜培養(yǎng)；

2.6 菌株固化

接種環(huán)勾取活化了的菌株在BHI固體培養(yǎng)基上，37℃靜置過夜培養(yǎng)；

2.7 混菌

接種環(huán)勾取固化了的菌落，入BHI液體培養(yǎng)基；36℃靜置過夜培養(yǎng)；

用移液槍分別吸取菌液和BHI培養(yǎng)基以1/100的比例混勻加至U型96孔板中。A～F孔加入混液，而GH兩排空加入200μ1空白BHI培養(yǎng)基，作為對照。36℃36h培養(yǎng)，后將液體輕輕拍下，用PBS液體沖洗96孔板3次，60℃ 1h烘干固定；加入0.4%草酸銨結晶紫，覆蓋孔底即可，染色5min，流水沖洗無紫色流下，晾干后在酶標儀讀取數(shù)值。

判定標準：空白平均值

臨界值=空白平均值+3*標準差

生物膜生長=菌的平均值—臨界值

0.14＞生物膜生長，判定為陰性，符號表示“—”

0.14≤生物膜生長＜0.28，判定為陽性，符號表示為“+”

0.28≤生物膜生長＜0.56，判定為中等陽性，符號表示為“++”

0.56≤生物膜生長，判定為強陽性，符號表示為“+++”

2.8 脫脂奶粉梯度探索實驗

對凍菌進行活化固化后，配制不同奶粉濃度的BH I培養(yǎng)基（奶粉濃度分別設置為0，0.25%，0.5%，0.75%），115℃高壓滅菌15min（此條件既可以達到滅菌效果又不致使蛋白質變質）；然后吸取菌液和BHI培養(yǎng)基以1/100的比例混勻，A～F孔每孔加入200μL混液，而G，H兩排空加入與上6孔相對應奶粉濃度的BHI培養(yǎng)基200μL作為對照；36℃36h培養(yǎng)。后將液體輕輕拍下，用PBS液體沖洗96孔板3次，60℃ 1h烘干固定；加入0.4%草酸銨結晶紫，覆蓋孔底即可，染色5min，流水沖洗無紫色流下，晾干后在酶標儀讀取數(shù)值。

2.9 培養(yǎng)時間梯度實驗

對凍菌進行活化固化后，配制0.5%奶粉濃度的BHI培養(yǎng)基，115℃高壓滅菌15min，吸取菌液和BHI培養(yǎng)基以1/100的比例混勻上96孔板，37℃36h培養(yǎng)；后將液體輕輕拍下，用PBS液體沖洗96孔板3次，60℃ 1h烘干固定；加入0.4%草酸銨結晶紫，覆蓋孔底即可，染色5min，流水沖洗無紫色流下，晾干后在酶標儀讀取數(shù)值。

3 實驗結果

3.1 腸球菌篩選結果

16份樣品共篩選出214株菌，其中腸球菌24株（顯微鏡視野下腸球菌呈圓形或橢圓形的革蘭氏陽性球菌），腸球菌比例11.21%。

3.2 腸球菌溶血實驗結果

24株腸球菌中9株菌呈β溶血現(xiàn)象：（S16-1，S14-1，S16-11，S16-6，S16-13，S9-1，S13-13，S8-23，S14-1）。余下15株菌呈γ溶血。

3.3 腸球菌的生長曲線實驗

腸球菌菌數(shù)0～36h呈現(xiàn)遞增趨勢，在36h達到峰值；36h后逐漸減少，到48h幾乎全部死亡見圖1

圖表 1 腸球菌生長曲線結果

3.4 生物膜篩選結果

24株菌腸球菌篩出一株陽性菌（菌名為S9-2）。腸球菌陽性比例4.17%。結果見圖2

圖表 2 腸球菌生物膜篩選結果

3.5 脫脂奶粉對生物膜生長的促進結果

奶粉對腸球菌生物膜生長具有明顯的促進作用。研究結果表明添加牛奶能夠產(chǎn)生生物膜，不同牛由于基因型變異使酪蛋白的濃度、b和k-casein不同。因此，不同的效率酪蛋白變成提高生物膜的形成表明牛奶主體也可能影響到蛋白質的增長uberis和感染的發(fā)展模式。我們曾表明，在美國抗生素耐藥性主要由壓力UV-1ight等因素誘導誘變。物種的快速適應能力導致DNA損傷。生物膜會造成廣泛的遺傳多樣性被認為是細菌的生存策略，確保各種各樣的環(huán)境條件。生物膜種群包括與不同的細胞基因型和表型可能。這至少可以部分解釋為什么根除環(huán)境病原體經(jīng)常失敗。結果見圖3

圖表 3 加奶粉對腸球菌生物膜影響結果圖

3.6 奶粉梯度與時間梯度的探索結果

圖表 4 腸球菌生物膜在24h生長結果

圖表 5　腸球菌生物膜在36h生長結果

圖表 6 腸球菌生物膜在48h生長結果

4 結論

依據(jù)實驗數(shù)據(jù)分析，可得出如下次結論。

（1）加入奶粉對腸球菌生物膜陽性的細菌具有非常明顯的促進作用，但對本身生物膜陰性菌無作用。

（2）腸球菌的最適宜生長條件是：恒溫箱37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為36h，BHI培養(yǎng)基加入0.5%的奶粉。奶粉濃度繼續(xù)提高，對結果影響不大，故為了經(jīng)濟原則，培養(yǎng)的最適宜奶粉濃度控制在0.5%，即100mLBHI培養(yǎng)基中加入0.5g奶粉。

（3）腸球菌的生長最好的時間 為36h，此時活菌數(shù)最多。在0～36h呈現(xiàn)遞增趨勢，在36h達到峰值，而在36h以后活菌數(shù)遞減。至48h腸球菌已近乎全部死亡。

5 討論

（1）脫脂奶粉中的蛋白質，碳水化合物較全脂奶粉高1/3，鈣磷維生素也較全脂奶粉高。故本實驗選用脫脂奶粉研究對腸球菌生物膜影響。奶粉中的成分（酪蛋白）對腸球菌生物膜生長具有不同程度促進作用。

（2）根據(jù)圖5可以得出脫脂奶粉促進腸球菌生物膜生長的最適濃度為0.5%，符合研究。

（3）根據(jù)圖4，5，6比較可以得出生物膜生長的最適培養(yǎng)時間為36h，符合研究。

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