陳尚坤王旭東張曉嘉王佳琦張更謙

（1　吉林警察學(xué)院　吉林　長春　130117；2　西南政法大學(xué)　重慶　401120；3　山西醫(yī)科大學(xué)　山西　太原　030001）

土壤微生物16S rDNA的T-RFLP法醫(yī)學(xué)應(yīng)用分析

陳尚坤1王旭東2張曉嘉3王佳琦3張更謙3

（1吉林警察學(xué)院吉林長春130117；2西南政法大學(xué)重慶401120；3山西醫(yī)科大學(xué)山西太原030001）

用T-RFLP法觀察不同地域土壤微生物的多態(tài)性，為法醫(yī)學(xué)土壤分析提供適當(dāng)?shù)难芯糠椒ā２杉约趾椭貞c兩地的土壤樣本，用PowerSoil?試劑盒提取土壤細(xì)菌DNA。PCR擴(kuò)增16S rDNA基因的多態(tài)性區(qū)域，引物的5’端采用FAM標(biāo)記。擴(kuò)增產(chǎn)物分別用HaeⅢ，AluⅠ內(nèi)切酶消化后，在3130 Genetic Analyzer電泳分離。采用主成分分析（PCA） 法和主效可加護(hù)作用可乘模型（AMMI）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過采用HaeⅢ酶切后，T-RFLP法可以明確分離重慶和吉林兩地的土壤樣本；AluⅠ酶切后分離效果稍差。得出T-RFLP法可以區(qū)分來自不同地域的土壤樣本，為法醫(yī)學(xué)土壤多樣性分析提供了可靠的分析方法和結(jié)論。

土壤細(xì)菌16S rDNA末端-限制性長度多態(tài)性主效可加護(hù)作用可乘模型

土壤中含有豐富的細(xì)菌、真菌、病毒等微生物，其多態(tài)性組成深度影響著土壤的性質(zhì)和環(huán)境。土壤微生物在農(nóng)業(yè)，環(huán)境分析等領(lǐng)域得到充分的重視和研究。土壤微生物的多態(tài)性表現(xiàn)為地域、時(shí)間、土壤性質(zhì)、環(huán)境影響等方面。土壤中的眾多微生物至今未在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng)，例如土壤中的細(xì)菌有95%～98%未能在實(shí)驗(yàn)室成功培養(yǎng)。因此，通過其多態(tài)性集中的DNA區(qū)域如16S rRNA、18S rRNA基因等去分析土壤的宏基因組。近年來，法醫(yī)也越來越重視土壤微生物分析［1］。相關(guān)的探索領(lǐng)域包括微生物的個(gè)體識(shí)別，土壤細(xì)菌的改變與死亡時(shí)間的關(guān)系等［2］。

末端-限制性長度多態(tài)性（Terminal-Ristriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP） 是研究土壤宏基因組的方法之一。本文采用T-RFLP結(jié)合主成分分析的方法（PCA）和主效可加護(hù)作用可乘模型（AMMI）研究不同地域土壤的細(xì)菌DNA多態(tài)性，觀察其變異程度，探討用不同的酶切和分析方法來區(qū)分不同地域土壤的可行性，為法醫(yī)學(xué)應(yīng)用該類多態(tài)性和方法進(jìn)行技術(shù)探討［3-4］。

1　材料

1.1土壤收集

土壤樣本共24個(gè)，分別來自吉林省和重慶市，具體見下表。

1.2實(shí)驗(yàn)材料

PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒（MO BIO，美國）；內(nèi)切酶HaeⅢ和AluⅠ（New England Biolabs，英國）；rTaq和dNTP（Takara，日本）；引物序列為8F：5'FAM-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，785R：5'-ACTACCTGGGTATCTAATCC，擴(kuò)增產(chǎn)物總長度約777bp［5］；引物合成和標(biāo)記由生工生物工程（上海）股份公司完成。

2　方法

2.1土壤DNA提取與擴(kuò)增

采用MO BIO PowerSoil?土壤微生物DNA提取試劑盒，取250mg的樣品加入power Bead管中，加入C1溶液混勻10min，10000g離心10min，轉(zhuǎn)移上清液，分別加入C2、C3、C4液，每次10000g離心1min。每次取600μL加入過濾柱中，10000g離心1min，重復(fù)3次，C5、C6液分別洗滌一次。收集離心管中的DNA。將樣本跑瓊脂糖電泳確認(rèn)DNA分離結(jié)果，并測(cè)定樣本OD值，計(jì)算其濃度。

用ABI PCR 9700擴(kuò)增儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件如下：緩沖液（PCR Buffer）5μL、dNTP4μL、上游引物（8F）2μL、下游引物（785R）2μL、rTaq 0.6μL、樣本DNA 100ng、加超純水至總體積50μL。PCR反應(yīng)條件：95℃5min預(yù)變性；95℃10s，55℃1min，72℃30s，共36個(gè)循環(huán)；72℃10min，4℃保存。

表　土壤樣本

2.2酶切

擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增產(chǎn)物分別用HaeⅢ，AluⅠ酶切。酶切體系為25μL體系：buffer2.5μL、內(nèi)切酶（HaeⅢ，AluⅠ） 1μL，超純水11.5μL、擴(kuò)增產(chǎn)物10μL。放置于37℃水浴條件下過夜后煮沸滅活內(nèi)切酶。

2.3電泳和自動(dòng)分析

電泳在ABI公司Genetic Analyzer 3130分析儀上進(jìn)行。具體步驟如下：取去離子甲酰胺9.5μL、0.2μL內(nèi)標(biāo)（LIZ 500）、1.5μL酶切產(chǎn)物混合后95℃3min，立即冰浴。然后在3130機(jī)器中上樣電泳。用GeneMapper3.2分析電泳結(jié)果。顯示每個(gè)實(shí)際位置，BIN設(shè)置為±0.5bp，大于此值的被認(rèn)為是不同的峰，即不同的OTU（Operational Taxonomic Units）。

2.4統(tǒng)計(jì)分析

選取90～500bp之間的所有峰高大于50的峰。記錄峰的大小、峰高和峰面積，作為原始數(shù)據(jù)。將其用T-REX軟件進(jìn)行在線匹配（http：//trex.biohpc.org/），并生成矩陣。對(duì)于該矩陣分別采用IMMA分析和PCA分析。IMMA分析由T-REX在線完成，PCA分析由IBM SPSS23.0完成。樣本分析采用兩種指標(biāo)：①峰的有無；②峰面積。

3　結(jié)果

3.1T-RFLP圖譜在不同地域的土壤的差別

T-RFLP結(jié)果顯示用HaeⅢ酶切后來自同一地區(qū)的土壤有著更多的形態(tài)相同的峰：樣本4、樣本9、樣本10取自重慶市，樣本15、樣本16、樣本17取自吉林??；而來自不同地區(qū)的土壤峰形差別較大，其特征峰（箭頭所示）的片段大小和高度及峰度都相差較大，一些峰為某些地域所特有的，而在其他地區(qū)沒有，能夠區(qū)別來自不同地區(qū)的土壤，如圖1所示。用AluⅠ酶切后，同一地區(qū)的土壤樣本仍有相同特征峰，但不同地區(qū)土壤峰形差別較小，沒有顯著差別，效果不及HaeⅢ酶，如圖2所示。

圖1　用HaeⅢ酶切不同地域土壤樣本的T-RFLP圖譜

3.2重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

所得T-RFLP圖有一定的相似性，土壤樣本距離越近，T-RFLP圖譜越相似，其特征峰的片段大小高度相近，即采自于同一片區(qū)域的樣本重復(fù)性較好。樣本4、樣本9均為在登山道右側(cè)菜地2m內(nèi)所采集的土壤，樣本10為與樣本4、9距離50m，樣本4和樣本9更為接近，T-RFLP圖譜更相似。如圖1所示。

圖2　用AluⅠ酶不同地域的土壤樣本切的T-RFLP圖譜

3.3PCA分析

用HaeⅢ酶切后，分別用T-RFLP的峰的有無和峰面積進(jìn)行PCA分析，得到散點(diǎn)圖。兩地區(qū)土壤樣本集中，不能將地域分開，如圖3所示。用AluⅠ酶切后，進(jìn)行PCA分析后，較HaeⅢ酶切離散，也不能區(qū)分地域，如圖4所示。

圖3　HaeⅢ酶切后的PCA分析圖

圖4　AluⅠ酶切后的PCA分析圖

3.4AMMI分析

分別以峰高、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素和峰面積、取樣位置、取樣高度作為環(huán)境因素，對(duì)兩種酶切后的樣本的T-RFLP進(jìn)行分析。HaeⅢ酶切后在設(shè)定兩種環(huán)境因素條件下的AMMI圖分布一致，并且能夠區(qū)分兩地區(qū)的土壤。吉林土壤樣本集中，重慶的土壤樣本較為離散，取樣的環(huán)境對(duì)土壤的性質(zhì)有影響，主要是取樣位置不同，如不同高度位置（13號(hào)樣本山頂，7號(hào)樣本山腳），不同濕度（2號(hào)樣本水塘，10號(hào)樣本路邊干燥處）顯示出了較大的差異性，如圖5所示。AluⅠ酶切后AMMI分析，不能區(qū)分兩地區(qū)土壤樣本，如圖6所示。

圖5　HaeⅢ酶切的AMMI分析數(shù)據(jù)圖

圖6　AluⅠ酶切后的AMMI分析數(shù)據(jù)圖

4　討論

影響土壤環(huán)境的因素眾多，造成微生物群落組成的差別，這種差別是T-RFLP法區(qū)分不同土壤的理論基礎(chǔ)——即用內(nèi)切酶切割后產(chǎn)生不同大小的DNA片段，通過末端標(biāo)記的熒光PCR產(chǎn)物的電泳差異顯示出來。每一份不同的土壤應(yīng)該顯示不同的DNA圖譜和特征峰，即OUT［6］。法醫(yī)學(xué)者最關(guān)心的是如何用適當(dāng)?shù)姆椒ㄈピu(píng)估區(qū)分這種差別。

本文用T-RFLP分析不同地域土壤細(xì)菌16S rRNA基因的多態(tài)性。結(jié)果表明，采用該方法可以成功提取大部分不同地域土壤的DNA并成功擴(kuò)增和分析。不同地域的土壤微生物采用適當(dāng)?shù)姆治龇椒ê?，可以得到有效的分離。采用適當(dāng)引物和內(nèi)切酶的T-RFLP分析方法可成功分析不同地域和不同環(huán)境的土壤。

本文中采自吉林的9份土壤樣本中，8份樣本可成功擴(kuò)增分析；采自重慶的32份土壤樣本中，有16份樣本可成功擴(kuò)增分析。即使在瓊脂糖電泳后清晰觀測(cè)到土壤微生物的DNA條帶，仍無法獲得PCR產(chǎn)物，我們?cè)枚喾N純化方法，均無法擴(kuò)增出來。分析可能與該地區(qū)土壤腐殖酸等抑制擴(kuò)增的物質(zhì)含量過多，抑制PCR擴(kuò)增。分析土壤時(shí)必須注意：土壤環(huán)境多樣，因土壤樣品中成分復(fù)雜，土壤中常含有抑制擴(kuò)增的物質(zhì)，如腐植酸等，如不能有效地去除，對(duì)后續(xù)PCR的擴(kuò)增影響較大［7］。

用T-RFLP的方法區(qū)別不同地區(qū)的土壤，本實(shí)驗(yàn)兩種酶對(duì)土壤鑒別能力是不同的。一方面是由于HaeⅢ和AluⅠ不同，HaeⅢ的識(shí)別序列：5’…GG∧CC…，Alu的識(shí)別序列：5’…AG∧CT。另一方面不同地區(qū)土壤中細(xì)菌的種類不同，擴(kuò)增出片段其序列并不相同，所以酶切后片段大小及峰度不同。用引物+HaeⅢ酶要優(yōu)于引物+AluⅠ酶的方法。

在對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析時(shí)，我們依據(jù)峰的有無和峰面積通過AMMI和PCA兩種方法分析。同一種酶切后，峰的有無和峰面積分析后顯示分布趨勢(shì)一致。但AMMI較PCA能較好的分離不同地區(qū)的土壤。AMMI模型將主成分分析和方差分析結(jié)合，將乘積形式的交互作用加入常規(guī)的基因型與環(huán)境的加性模型中，對(duì)細(xì)菌群落及環(huán)境因素相互作用進(jìn)行分析［8］。

土壤的性質(zhì)不僅受地域不同的影響，同時(shí)還受環(huán)境的影響如濕度、高度、氣溫等因素影響［9］。吉林地區(qū)的土壤樣本主要來自同一高度及相似環(huán)境的土壤，AMMI分析時(shí)發(fā)現(xiàn)分布非常集中；來自重慶的土壤樣本離散度較高，主要是取樣位置不同，如不同高度位置（13號(hào)樣本山頂，7號(hào)樣本山腳），不同濕度（2號(hào)樣本水塘，10號(hào)樣本路邊干燥處）顯示出了較大的差異性。

本文探討了用不同內(nèi)切酶結(jié)合不同的分析手段進(jìn)行土壤T-RFLP分析的可行性。結(jié)果顯示采用合適的方法可以有效分離來自不同地區(qū)的土壤，并且重復(fù)性好、結(jié)果可靠［10，11］。根據(jù)結(jié)果的一致性看，我們更傾向于AMMI分析。

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（責(zé)任編輯：孟凡騫）

D919.1

A

2095-7939（2016）03-0070-04

10.3969/j.issn.2095-7939.2016.03.016

2016-06-06

吉林省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：20110424）。

陳尚坤（1969-），女，吉林長春人，吉林警察學(xué)院學(xué)報(bào)編輯部編審，主要從事DNA分析技術(shù)研究。