劉云平，劉勇，何延政

西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川瀘州 646000

高糖環(huán)境對內(nèi)皮祖細胞成骨分化能力及其機制探討

劉云平，劉勇，何延政

西南醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，四川瀘州 646000

目的觀察高糖環(huán)境對內(nèi)皮祖細胞成骨分化能力的影響，并對其機制進行探討分析。方法采用密度梯度離心法分離及培養(yǎng)取得EPCs（內(nèi)皮祖細胞），通過觀察3組（對照組20 μg/mL、觀察組60 μg/mL、實驗組80 μg/mL）不同濃度高糖干預(yù)液對內(nèi)皮祖細胞遷移、增殖及凋亡等功能產(chǎn)生的影響，并對成骨鈣化基因進行相關(guān)檢測，進而觀察高糖環(huán)境對內(nèi)皮祖細胞成骨分化能力所產(chǎn)生的影響。結(jié)果與對照組比較，觀察組及實驗組可明顯抑制內(nèi)皮祖細胞的遷移及增殖功能，加速其凋亡，可明顯促進內(nèi)皮祖細胞成骨分化，且觀察實驗組變化最為顯著（P＜0.05）。結(jié)論高糖環(huán)境能明顯抑制內(nèi)皮祖細胞的遷移及增殖能力，加速其凋亡，可明顯促進內(nèi)皮祖細胞成骨分化；對深入研究糖尿病血管鈣化機制有積極作用，為臨床干預(yù)治療提供新相關(guān)依據(jù)。

高糖環(huán)境；內(nèi)皮祖細胞；成骨分化；糖尿病

近年來，隨著我國生活水平的不斷提高，糖尿病發(fā)病率呈明顯上升趨勢，而糖尿病致殘及致死主要因素為糖尿病大血管并發(fā)癥。內(nèi)皮組細胞在血管內(nèi)皮細胞的前端，它對于血管的重生再造和血管皮膚的復(fù)原都有著十分重要的意義，而高糖環(huán)境可導(dǎo)致內(nèi)皮祖細胞數(shù)量急劇減少及遷移功能出現(xiàn)障礙，糖尿病大血管病變及并發(fā)癥的出現(xiàn)與內(nèi)皮祖細胞數(shù)量及功能出現(xiàn)紊亂有著密切聯(lián)系；而血管鈣化是糖尿病病人最容易出現(xiàn)的癥狀，它是主血管被破壞的罪魁禍?zhǔn)?。學(xué)者講過研究指出，血管鈣化涉及到多種的細胞，病變過程極其復(fù)雜，但是它與人類骨骼的成長過程差不多，它是一種可以掌控的、自發(fā)的生物發(fā)展程序。血管鈣化主要有兩種病變情況：一個是動脈內(nèi)膜呈現(xiàn)粥狀的變硬，它的病理和脂質(zhì)代謝紊亂極其類似，同時伴有發(fā)炎的情況。與此同時，內(nèi)皮細胞遭到破壞，無法自動修復(fù)和免疫病毒，遭到破壞的損壞細胞會沉積于血管底部，最終導(dǎo)致組織貧血；另外一個是動脈中膜呈現(xiàn)線狀的變硬，它在脂質(zhì)沉積的部位和沒有炎癥的細胞軟浸區(qū)極易發(fā)生，這些沉積物最后會堵塞膠原蛋白的末端，它和平滑肌的分離有很大的關(guān)系。該文通過觀察高糖環(huán)境對內(nèi)皮祖細胞成骨分化能力的影響，并對其機制進行探討分析，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

CML-BSA購于美國Cell-Biolabs公司（貨號STA-314），該產(chǎn)品不能直接使用，需要用PBS將其降低稀釋。美國公司HyClones出出品的的DMEM/F12；美國公司GIBCO出品的胎牛的血清（FetalCalfSerum，F(xiàn)BS）；由美國賽摩科技公司（ThermoFisherScientific）出品的型號HERACELL150i的CO2類細胞的繁殖箱；流式細胞儀：美國BD公司，型號FACSCaliber；酶標(biāo)儀：美國BioTek公司，型號ELx800NB；倒置顯微鏡：日本OLYMPUS公司，型號IX71-A12FL/PH。

1.2 方法

首先需要對一個健康的成人核細胞進行分解，所用的方法為EPSs分解繁殖不同密度離心法。經(jīng)過此方法后，將有促進血管內(nèi)皮發(fā)育的因子以及堿性纖維發(fā)育因子和10%的幼牛血清放入M199培養(yǎng)基進行放置，3 d之后除去沒有貼壁的細胞，至于貼壁的細胞，將其繼續(xù)添加生長銀子，每3 d重新放置，等到第八天的時候貼壁細胞被消化吸收殆盡，這時使用激光式共聚焦顯微鏡額細胞儀進行分析。

1.3 分組

為對比、觀察、實驗（對比組20 μg/mL、觀察組60 μg/mL、實驗組80 μg/mL），每組進行實驗/d。

1.4 衡量檢測和所用方式

首先在EPCs96孔式的能力檢測板上添加100微毫升兩千個沒有血清的細胞培養(yǎng)基，在經(jīng)過1 d的同步之后，對他們進行不同的處理，每個小孔添加10 μL升LCCK-8液體繼續(xù)繁殖2 h，酶標(biāo)儀450 nm來檢測對光感應(yīng)程度，最后根據(jù)小孔和對比孔的對光感應(yīng)程度分析出EPCs的增加數(shù)量。每一個小組必須做五次反復(fù)嘗試。然后EPCs死亡能力相關(guān)測驗將處理后的細胞加入195 μLAnnexinV-FITC結(jié)合液（1X）重懸細胞。加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻。室溫避光孵育10 min，1000 g離心5 min，棄上清，加入190 μLAn-nexinVFITC組合水微微重新懸掛細胞。加入10 μmL碘化丙啶染色液體，慢慢地把他們搖勻，在低溫中清晰盡量躲開陽光。隨即進行流式細胞儀的檢查。每組反復(fù)重新做五次。接下來是EPCs發(fā)育成功的骨頭基因探測，該探測采用SYBRGreenI嵌合熒光法在illumna公司的E-coTM-Real.TimePCR儀上進行Real.TimePCR實驗，所使用的試劑盒為SYBRPremixExTa qII（TliRNaseHPlus，TaKaRacode：DRR820），反應(yīng)條件為預(yù)見變化95度30 s、PCR對應(yīng)40個循環(huán)95度5 s60度30 s、溶解曲線式的解析和總結(jié)。最后是用統(tǒng)計學(xué)軟件進行解析，計量單位用%表示，均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差相等，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度高糖干預(yù)液內(nèi)皮祖細胞遷移、增殖及凋亡情況比較

與對照組比較，觀察組及實驗組可明顯抑制內(nèi)皮祖細胞的增殖、遷移，促進其凋亡，其中實驗組最為顯著，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表1。

表1 各組內(nèi)皮祖細胞遷移、增殖及凋亡情況比較

2.2 各組內(nèi)皮祖細胞成骨分化基因表達情況比較

與對照組比較，觀察組及實驗組可明顯增加內(nèi)皮祖細胞成骨分化相關(guān)基因BMP2、ALP、RUNX2、OCN的表達，其中實驗組最為顯著，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），詳見表2。

表2 各組內(nèi)皮祖細胞成骨分化基因表達情況比較

表2 各組內(nèi)皮祖細胞成骨分化基因表達情況比較

組別例數(shù)BMP2ALP RUNX2OCN對照組觀察給實驗組8 8 8 6.51±0.29 3.89±0.25 7.05±0.39 1.69±0.24 2.45±0.14 12.98±0.011 1.11±0.09 3.01±0.21 10.13±0.39 3.43±0.08 4.49±0.11 10.01±0.29

3 討論

血糖升高是糖尿病病理的重要標(biāo)志，患者血糖控制良好與否直接關(guān)系到血管并發(fā)癥的發(fā)病率；糖尿病患者一般情況下有血管并發(fā)癥狀，血管中最重要的內(nèi)皮祖細胞大量減少，并且遭到毀滅性的損害，這意味著，糖尿病后期的血管病變癥狀與內(nèi)阻皮細胞的總量聯(lián)系密切，并且內(nèi)皮祖細胞最大的敵人就是高血糖。除此之外，高血糖對細胞的破壞已經(jīng)得到相關(guān)研究確定，很多種特殊情況都可以使得細胞被破壞。比如線粒體的激活，破壞相關(guān)基因的失衡，細胞的發(fā)育異變等等。從這次的實驗可以看出，糖分過多可以回使得

EPCs大量死亡。因而，研究高糖環(huán)境對內(nèi)皮祖細胞的遷移、增殖及凋亡等一些生物的特點的變化和相應(yīng)的改變有很重要的作用。

綜上所述，高糖環(huán)境能明顯抑制內(nèi)皮祖細胞的遷移及增殖能力，加速其凋亡，可明顯促進內(nèi)皮祖細胞成骨分化；對深入研究糖尿病血管鈣化機制有積極作用，為臨床干預(yù)治療提供新相關(guān)依據(jù)。

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R587.1

A

1672-4062（2016）10（b）-0065-02

10.16658/j.cnki.1672-4062.2016.20.065

2016-07-26）

劉云平（1988.2-），男，四川成都人，碩士研究生，實習(xí)生，研究方向：血管外科。

何延政（1965.9-），男，四川巴中人，博士，副主任醫(yī)師，研究方向：周圍血管外科基礎(chǔ)與臨床。