姚毅，許亮清，姜青龍，藍(lán)嵐

（南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌330006）

鄱陽(yáng)湖土鯰人工繁殖及其胚胎發(fā)育情況

姚毅，許亮清，姜青龍，藍(lán)嵐

（南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江西南昌330006）

鄱陽(yáng)湖土鯰（Silirus asotus Linnaeus）是江西省鄱陽(yáng)湖流域本地鯰魚(yú)（俗稱(chēng)土鯰）。采用人工授精方式進(jìn)行鄱陽(yáng)湖土鯰人工繁殖，在18℃～26℃的水溫條件下對(duì)鄱陽(yáng)湖土鯰胚胎靜止水體中發(fā)育過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)的觀察記錄，胎發(fā)育經(jīng)過(guò)7個(gè)時(shí)期，從受精卵到孵化出膜約為47.08小時(shí)。并將觀察結(jié)果與南方大口鯰、瓦氏黃顙魚(yú)靜止水體胚胎發(fā)育時(shí)間進(jìn)行了比較。對(duì)比發(fā)現(xiàn)南方大口鯰孵化時(shí)間最短，其次為鄱陽(yáng)湖土鯰，用時(shí)最長(zhǎng)的為瓦氏黃顙魚(yú)。

鄱陽(yáng)湖土鯰；人工受精；胚胎發(fā)育觀察

對(duì)特定水產(chǎn)品種進(jìn)行人工繁殖生產(chǎn)是水生資源保護(hù)的一種重要手段。通過(guò)對(duì)鄱陽(yáng)湖土鯰繁殖生物學(xué)開(kāi)展了相關(guān)研究，可以有效保護(hù)鄱陽(yáng)湖土鯰野生種質(zhì)資源，并向漁業(yè)生產(chǎn)部門(mén)提供優(yōu)質(zhì)苗種。并為今后鄱陽(yáng)湖土鯰的種質(zhì)資源保護(hù)，選育，與資源合理開(kāi)發(fā)利用等工作的開(kāi)展提供了必要的基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1　材料

1.1親本來(lái)源與培育

后備親本為2015年1月下旬捕撈自鄱陽(yáng)湖區(qū)近西南水域的野生個(gè)體，共計(jì)472余尾，雄魚(yú)103尾、體重為160克～420克，雌魚(yú)369尾、體重為370克～770克。親本暫養(yǎng)于1332平主米、水深1.8米土池后進(jìn)行3個(gè)多月強(qiáng)化培育。

5月11日，將后備親本雌雄分離后移至孵化方池。人工催產(chǎn)前先行分辨后備親本中的雌雄個(gè)體，區(qū)別后再挑選發(fā)育程度好的作為此次試驗(yàn)用親本。鄱陽(yáng)湖土鯰雌雄同年發(fā)育成熟個(gè)體中，雄性個(gè)體體型相對(duì)偏瘦長(zhǎng)，個(gè)體較小。鄱陽(yáng)湖土鯰成熟雄性親本與雌性親本在身體外形上易分辨的特征為尾鰭末端的開(kāi)叉深度以及開(kāi)叉的個(gè)數(shù)。雄性親本尾鰭叉深度較大，長(zhǎng)度達(dá)到整個(gè)尾鰭長(zhǎng)度的70%左右，且只有一條尾鰭開(kāi)叉；而雌性親本尾鰭開(kāi)叉深度一般只有30%～50%左右，且在尾鰭部開(kāi)有多條尾鰭叉。鄱陽(yáng)湖土鯰通體無(wú)鱗片，通過(guò)對(duì)500組雌雄親本檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)生殖錐星的情況，性成熟階段的雌雄個(gè)體體表為墨褐色，雄性個(gè)體在性成熟階段沒(méi)有出現(xiàn)明顯的生殖色。通過(guò)擠壓檢測(cè)雌性鯰魚(yú)腹部，挑選卵巢發(fā)育良好腹部膨大的雌性個(gè)體，并輕輕擠壓泄殖孔，有綠色卵粒被擠出。雄性個(gè)體生殖孔紅腫凸起，經(jīng)過(guò)擠壓可見(jiàn)有少量乳白色精液被擠出。

1.2藥物

此次試驗(yàn)使用的人工催產(chǎn)藥物為：促黃體素釋放激素A3（LRH-A3）、絨毛膜促性腺激素（HCG），0.3%胰蛋白酶脫膜用途，丁香油混合液（丁香油：酒精=1∶5）。

2　方法

2.1人工催產(chǎn)

漁用催產(chǎn)劑的使用要依據(jù)后備親本性腺實(shí)際發(fā)育情況進(jìn)行選擇，此次試驗(yàn)經(jīng)過(guò)觀察后備親本性腺發(fā)育情況，選配人工催產(chǎn)劑LRH-A3+HCG這兩種催產(chǎn)劑配合使用。催產(chǎn)劑使用前用0.7%生理鹽水稀釋溶解。采取一針注射法進(jìn)行肌注。雌魚(yú)注射劑量依據(jù)體重選取注射劑量為（LRH-A3 6ug+HCG 500IU）/公斤，雄魚(yú)劑量減半的多個(gè)劑量方案實(shí)施人工催產(chǎn)。注射部位為胸鰭基部。注射時(shí)用干毛巾包裹魚(yú)體以便于順利完成操作。并將親本放置與產(chǎn)卵池中網(wǎng)箱內(nèi)，產(chǎn)卵池內(nèi)每間隔1小時(shí)沖水10分鐘，多次升降水位，對(duì)親本施以環(huán)境刺激。

2.2人工授精和孵化

對(duì)親本進(jìn)行人工催產(chǎn)后，采用半濕法進(jìn)行人工授精獲得授精卵，并將授精卵平鋪在正方形孵化網(wǎng)布盤(pán)上。

3　胚胎發(fā)育觀察流程設(shè)計(jì)

人工授精5分鐘后，采集受精卵后使用0.3%胰蛋白酶液浸泡受精卵10分鐘后，除去受精卵外層膠膜，并用蒸餾水沖洗。每種孵化方式下每次隨機(jī)取30粒受精卵進(jìn)行胚胎發(fā)育觀察，使用鳳凰XTL-165-VT90體式顯微鏡進(jìn)行觀察，采用鳳凰光學(xué)顯微鏡高清攝像頭MC-D800U（C）選取胚胎發(fā)育期內(nèi)典型個(gè)體進(jìn)行拍照。胚胎發(fā)育分期劃分以超過(guò)半數(shù)被觀察樣本達(dá)到該時(shí)期的時(shí)間點(diǎn)作為確認(rèn)時(shí)間（殷名稱(chēng)1991）。鄱陽(yáng)湖土鯰受精卵早期發(fā)育快，采取每隔15分鐘觀察一次，待胚胎進(jìn)入原腸胚期后，再采用每隔25分鐘觀察一次。在幼體出膜后，為消除被觀察樣本胚體扭動(dòng)對(duì)觀察記錄的不利影響，將被觀察樣本置于0.01%丁香油混合水溶液中進(jìn)行麻醉處理。

4　試驗(yàn)條件

該次試驗(yàn)使用了南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)過(guò)改造后的向塘良種繁殖場(chǎng)。

4.1水源和過(guò)濾設(shè)備

水源使用的是南昌第二干渠內(nèi)水源和輔助配備良種繁殖場(chǎng)內(nèi)淺表層地下井水。用于試驗(yàn)用水都經(jīng)過(guò)過(guò)濾設(shè)備并經(jīng)100目篩絹網(wǎng)過(guò)濾后使用。

4.2苗種培育池

苗種培育池為長(zhǎng)度為9米、寬度為7.5米、池深為1.25米的水泥池質(zhì)育苗池，育苗池池頂部位置布設(shè)有進(jìn)水管路，并且開(kāi)設(shè)有排污口及其排水管路。

5　結(jié)果和討論

5.1受精卵

鄱陽(yáng)湖土鯰受精卵體為草綠色，受精卵為近似圓球型，受精卵卵徑平均為1.62±0.15毫米（n=30），吸水膨脹10分鐘后卵徑為4.81±0.76毫米（n=30），并產(chǎn)生較強(qiáng)粘性，受精卵體具有較強(qiáng)的彈性，受精分鐘后，原生質(zhì)向動(dòng)物極匯集，并在受精（45分鐘）后上端隆起為圓包狀胚盤(pán)。

5.2卵裂階段

受精卵經(jīng)（1小時(shí)30分鐘）后，隆起的圓包狀胚盤(pán)從中部開(kāi)始凹陷，經(jīng)過(guò)緩慢下陷加深后，形成二個(gè)邊界為圓弧狀近長(zhǎng)方形分裂球細(xì)胞；（1小時(shí)50分鐘）開(kāi)始第二次分裂，發(fā)生位置與第一次形成分裂下陷處形成垂直線(xiàn)，分裂凹陷后形成4個(gè)形狀相似的外緣為90度扇形的分裂球細(xì)胞；（2小時(shí)05分鐘）開(kāi)始第三次分裂，兩處凹陷同時(shí)發(fā)生并與第一條凹陷平行，將原有4分裂球細(xì)胞分成為8個(gè)，并呈現(xiàn)長(zhǎng)方形排列。但8個(gè)細(xì)胞外形已有明顯區(qū)別，內(nèi)部4個(gè)細(xì)胞近似與正方形隆起，而外緣4個(gè)細(xì)胞則仍是外緣近似90度扇形的分裂球細(xì)胞；（2小時(shí)30分鐘）開(kāi)始第四次分裂，同時(shí)出現(xiàn)兩條凹陷并與第一條凹陷都呈垂直的經(jīng)裂，分裂完成后外緣4個(gè)細(xì)胞較小，其余12個(gè)細(xì)胞大小相似，16個(gè)細(xì)胞呈有規(guī)則的長(zhǎng)方形排列；（3小時(shí)05分鐘）開(kāi)始第五次分裂，并形成了32個(gè)成二行排列的分裂球細(xì)胞，這時(shí)期分裂球細(xì)胞之間的界限已經(jīng)變得不明顯；（3小時(shí)05分鐘）開(kāi)始第六次分裂，這時(shí)的發(fā)育已進(jìn)入到64細(xì)胞期，分裂球細(xì)胞不僅細(xì)胞間的界限變得不明顯，甚至出現(xiàn)了細(xì)胞部分重疊的情況；（3小時(shí)05分鐘）發(fā)育進(jìn)入到了多細(xì)胞期，呈現(xiàn)多層排列狀態(tài)的分裂球細(xì)胞，已經(jīng)很難分辨其具體的分裂球細(xì)胞個(gè)數(shù)，詳見(jiàn)表1。

表1　鄱陽(yáng)湖土鯰胚胎發(fā)育分期

5.3囊胚階段

受精經(jīng)過(guò)（4小時(shí)15分鐘）后，分裂細(xì)胞團(tuán)緩慢隆起，整體呈現(xiàn)圓包形狀，隆起高度為整個(gè)受精卵長(zhǎng)軸長(zhǎng)的（3/7），早期囊胚的胚層隆起很高，可看見(jiàn)模糊的細(xì)胞界限。囊胚層細(xì)胞逐漸向植物極下方遷移，經(jīng)過(guò)（5小時(shí)05分鐘）后進(jìn)入囊胚中期，細(xì)胞界限逐漸不明顯，細(xì)胞團(tuán)中形成一個(gè)小腔，腔體中充滿(mǎn)液體。經(jīng)過(guò)（6小時(shí)10分鐘）后進(jìn)入囊胚晚期，囊壁的細(xì)胞下包生長(zhǎng)，逐漸將卵黃部分包圍。下包過(guò)程中伴隨著囊胚腔被壓縮。囊胚層下包約達(dá)整個(gè)胚胎的1/3。外層也變得扁薄，透視可見(jiàn)囊胚腔。

5.4原腸胚階段

受精（7小時(shí)05分鐘）后，胚層邊緣隆起并下包胚層1/2，胚層隆起形成圓帽狀“胚環(huán)”，經(jīng)過(guò)（8小時(shí)15分鐘）后，圓帽狀“胚環(huán)”不斷增厚并內(nèi)卷，并逐漸增厚成盾狀。這時(shí)胚層持續(xù)下包，下包達(dá)到整個(gè)細(xì)胞4/5，這時(shí)的胚盾前端開(kāi)始膨大，伴隨胚盾外緣伸長(zhǎng)變薄，可觀察到沿著胚盾中線(xiàn)部分形成脊索原基，并可觀察到胚盾前端略微膨大的腦泡原基。

5.5神經(jīng)胚階段

在受精（11小時(shí)50分鐘）后，胚盾中線(xiàn)部分脊索原基處下陷成溝狀神經(jīng)溝，神經(jīng)溝位于胚體背側(cè)的正中位置，脊索原基與外胚層緊密結(jié)合。卵黃栓裸露于胚胎的表面，胚體頭端（動(dòng)物極這一段）初顯腦部形態(tài)，可分辨出前、中、后三個(gè)腦泡，胚孔封閉與受精后11小時(shí)46分鐘，腦泡兩側(cè)可觀察到眼囊原基，并可見(jiàn)5～7對(duì)體節(jié)。

5.6器官分化階段

在受精（14小時(shí)45分鐘）后，眼囊原基內(nèi)陷成眼囊，然后在其中部可見(jiàn)圓形突起；橢圓形聽(tīng)囊出現(xiàn)在胚體前端2/5處，這時(shí)體節(jié)數(shù)為11～14對(duì)；腦部分化更為明顯；在受精（15小時(shí)55分鐘）時(shí)，眼基前方可觀察到嗅板，尾牙開(kāi)始游離出卵黃囊，并呈現(xiàn)球形尾泡，這時(shí)體節(jié)數(shù)為18～23對(duì)，受精（19小時(shí)25分鐘）時(shí)，整個(gè)胚體開(kāi)始有微弱運(yùn)動(dòng)，開(kāi)始出現(xiàn)肌肉收縮現(xiàn)象的發(fā)生，這種運(yùn)動(dòng)的發(fā)生的頻率為6～11次/分鐘。受精（22小時(shí)35分鐘）時(shí)，可見(jiàn)上頜須原基出現(xiàn)，位于頭部下方。尾牙游離成尾，長(zhǎng)度為胚體長(zhǎng)2/5，形成后的尾通過(guò)有規(guī)律的左右擺動(dòng)，使得胚體沿著卵膜內(nèi)緣緩慢移動(dòng)，并可觀察到鰓弓原基和鰓蓋原基先后出現(xiàn)在上頜須后下部和聽(tīng)囊下部。受精（24小時(shí)35分鐘）時(shí)，心跳頻率逐漸加快到65～77次/分鐘，胚體扭動(dòng)頻率也同步加快，扭動(dòng)頻率和心跳頻率近于一致，奇鰭?cǎi)蕹霈F(xiàn)在尾部腹面，并逐漸的加長(zhǎng)。受精（27小時(shí)35分鐘）時(shí)，這時(shí)的鰓蓋原基擴(kuò)大并可觀察到3對(duì)左右的鰓弓，胚體沿卵膜內(nèi)緣做逆時(shí)針運(yùn)動(dòng)，而這時(shí)的卵膜也變薄，并伴隨有不規(guī)則的內(nèi)陷，卵膜緊貼膜內(nèi)胚體。

5.7出膜

受精（33小時(shí)50分鐘）時(shí)，被觀察樣本胚體尾部劇烈運(yùn)動(dòng)使內(nèi)胚膜破裂，尾部先轉(zhuǎn)出，脫出內(nèi)胚膜后尾部擺動(dòng)頻率和幅度都加大，借著劇烈運(yùn)動(dòng)仔魚(yú)頭部也脫出胚膜，脫離的胚膜碎片逐漸溶解。剛剛脫膜的仔魚(yú)軀干部分淡綠色，近似于透明，卵黃囊呈現(xiàn)草綠色，受精后（39小時(shí)50分鐘），一半的被觀察樣本脫膜，受精后（47小時(shí)05分鐘），被觀察樣本全部完成脫膜。

鄱陽(yáng)湖土鯰受精卵為圓形，通體草綠色，受精卵的大小為1.56毫米～1.71毫米，受精卵吸水膨脹的增幅大，外膜直徑達(dá)到了5.58毫米，吸水后受精卵外壁具有很強(qiáng)的彈性，能承受較強(qiáng)的外力沖擊，鄱陽(yáng)湖土鯰受精卵吸水膨脹后通體具有中等粘性，容易附著細(xì)砂粒及其他類(lèi)型微粒。

鄱陽(yáng)湖土鯰受精卵在水溫22.0℃～26℃情況下，孵化出苗用時(shí)47小時(shí)05分鐘；與大多數(shù)鯰科發(fā)育時(shí)序相似，經(jīng)過(guò)胚盤(pán)期→卵裂期→囊胚期→原腸期→神經(jīng)胚期→器官分化期→出膜期這7個(gè)發(fā)育時(shí)期。相應(yīng)的發(fā)育期中又分為若干個(gè)階段。鄱陽(yáng)湖土鯰卵裂期的8細(xì)胞時(shí)期到64細(xì)胞時(shí)期，分裂球排列成外緣成弧形的長(zhǎng)方體，胚胎發(fā)育至64細(xì)胞期后分裂球重疊程度變大，分裂球細(xì)胞間的界限變得沒(méi)有明顯規(guī)律。同時(shí)卵黃運(yùn)動(dòng)較劇烈，運(yùn)動(dòng)周期較短，有利于細(xì)胞層的下擴(kuò)。在器官分化期之前的各發(fā)育時(shí)期階段胚胎發(fā)育緩慢，進(jìn)入到器官分化期后，胚胎發(fā)育加速。腦泡及眼囊分化、嗅板和聽(tīng)囊的分化、頜須原基的形成、肌節(jié)的加速形成，使得鄱陽(yáng)湖土鯰仔魚(yú)出膜后感覺(jué)器官已初步形成。

孵化的水溫和累計(jì)時(shí)間與其他鯰形目品種之間的比較，鄱陽(yáng)湖土鯰的孵化在水溫22.0℃～26℃情況下，孵化出苗用時(shí)47小時(shí)05分鐘；南方大口鯰孵化在水溫23.1℃～25.8℃情況下，孵化出苗用時(shí)30小時(shí)27分鐘；瓦氏黃顙魚(yú)（同為鯰形目）的孵化在水溫23.0℃～25.0℃情況下，孵化出苗用時(shí)50～60小時(shí)。

在18℃～26℃的溫度范圍內(nèi)，南方大口鯰孵化時(shí)間最短，其次為鄱陽(yáng)湖土鯰，然后是瓦氏黃顙魚(yú)。鄱陽(yáng)湖土鯰胚胎發(fā)育情況見(jiàn)表2。

表2　鄱陽(yáng)湖土鯰胚胎發(fā)育分期圖

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江西省科技支撐計(jì)劃（20121BBF60037）：鄱陽(yáng)湖土鯰繁養(yǎng)殖關(guān)鍵技術(shù)研究

S943

ADOI編號(hào)：10.14025/j.cnki.jlny.2016.20.024

姚毅，碩士，南昌市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，工程師，研究方向：遺傳育種和農(nóng)業(yè)物聯(lián)網(wǎng)。