沈錄峰 張遂輝 董謝平 杜曉梅 孫艷群

1.江西省人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，江西南昌330006；2.江西中醫(yī)藥大學，江西南昌330025；3.江西省人民醫(yī)院骨科，江西南昌330006；4.江西省人民醫(yī)院干部保健門診，江西南昌330006

頸部不良應力對大鼠脊髓組織誘導型一氧化氮合酶表達影響的實驗研究

沈錄峰1張遂輝2董謝平3杜曉梅1孫艷群4

1.江西省人民醫(yī)院康復醫(yī)學科，江西南昌330006；2.江西中醫(yī)藥大學，江西南昌330025；3.江西省人民醫(yī)院骨科，江西南昌330006；4.江西省人民醫(yī)院干部保健門診，江西南昌330006

目的探討頸部應力不良對大鼠脊髓組織誘導型一氧化氮合酶表達（iNOS mRNA）的影響。方法選擇SD大鼠60只，隨機分為4組，對照組（A組，6只）：不做任何處理；假手術組（B組，18只）：切開皮膚，不損傷肌群；后深肌群損傷組（C組，18只）：切斷部分頸部深肌群；后淺肌群損傷組（D組，18只）：切斷部分頸部淺肌群。分別于術后1、3、6個月動態(tài)觀察大鼠血清中IL-6、NO水平及頸部脊髓組織中iNOS mRNA表達及NOS活性的變化。結果①IL-6水平：與A組比較，C組術后3、6個月及D組術后6個月IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與B組比較，C組與D組術后6個月IL-6水平均明顯較高（P＜0.05）。②NO水平：與A、B組比較，D組和C組術后6個月血清NO水平顯著升高（P＜0.05）。③iNOS mRNA：A、B組中未測得iNOS mRNA表達，C組及D組術后3、6個月iNOS mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。④NOS活性：術后1個月，C組NOS活性較A、B組顯著升高（P＜0.01），D組NOS活性較A組顯著升高（P＜0.05）；術后3、6個月，C、D組NOS活性較A、B組差異明顯（P＜0.05）。結論頸部不良應力可引起頸脊髓慢性損傷。

頸部應力不良；誘導型一氧化氮合酶；一氧化氮；基因表達

對于頸椎病的病因?qū)W研究，國內(nèi)外學者認為主要以頸椎間盤退變?yōu)榛A［1-2］，但近年來，頸部肌肉的作用越來越受到學者的關注［3-7］。研究顯示，頸椎周圍肌群是維系頸椎關節(jié)穩(wěn)定和功能的動力系統(tǒng)，在頸推病發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了重要作用［8-9］。一氧化氮及誘導型一氧化氮合酶（iNOS）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性損傷中發(fā)揮著不容忽視的作用［10-11］。本研究基于以上研究基礎，通過建立頸部應力不良的SD大鼠實驗模型，動態(tài)觀察頸部應力不良后頸脊髓組織中iNOS的變化，探討肌肉力量不平衡在頸椎病發(fā)病中的機制，進一步為頸椎病的臨床治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物及造模

健康成年SD大鼠60只（湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物合格證號：43004700015），體重280～300 g，隨機分為4組，對照組（A組，6只）：不做任何處理，作為參照；假手術組（B組，18只）：切開皮膚，不損傷肌群；后深肌群損傷組（C組，18只）：切斷部分頸部夾肌、最長肌、頸髂肋肌、頭半棘??；后淺肌群損傷組（D組，18只）：切斷部分頸斜方肌、頭頸菱形肌。操作均在無菌條件下進行，術后給予青霉素40萬單位肌注，2次/d，連續(xù)3 d，給予普通飼料飲食，分籠飼養(yǎng)［12］。

1.2 主要試劑

白介素-6（IL-6）、一氧化氮（NO）ELISA試劑盒由上海西唐生物技術有限公司提供；E.Z.N.A.總RNA提取試劑盒（Omega）、SuperQuickRT cDNA第一鏈合成試劑盒以及2×Es Taq MasterMix（含染料）均為北京康為世紀生物科技有限公司生產(chǎn)；瓊脂糖為西班牙BIOWEST公司生產(chǎn)；三氯甲烷、異丙醇等有機溶劑均為分析純，由國藥化學試劑有限公司生產(chǎn)；一氧化氮合酶（NOS）活性檢測試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。

1.3 標本采集

分別于造模后1、3、6個月處死大鼠，處死前大鼠眼眶取血，分離血清，液氮速凍后做好標記，-70℃下保存。剪下頸椎，采集脊髓標本約100 mg放置凍存管中，做好標記，液氮速凍后轉存于-70℃冰箱。

1.4 IL-6、NO含量測定

采用ELISA法測定血清IL-6、NO含量，均根據(jù)試劑盒說明操作。

1.5 iNOS mRNA檢測

1.5.1 引物合成PCR擴增引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，合成的引物采用PAGE法進行純化。GAPDH引物擴增產(chǎn)物條帶大小為148 bp，iNOS引物擴增產(chǎn)物條帶大小為398 bp。引物如下：GAPDH：P15'-AGTTCAACGGCACAGTCAAG-3'，P25'-GACTCCACGACATACTCAGCA-3'；iNOS：P15'-CA CAGTCTTGGTGAAAGCG-3'，P25'-GGTGAGACAG TTTCTGGTCG-3'。

1.5.2 組織總RNA提取及純度鑒定［13］從超低溫冰箱中取出標本15 mg左右于碾砵中，剪刀剪碎，并加入液氮碾磨，充分碾磨后加入700 μL含有2%巰基乙醇的TRK溶液，震蕩裂解細胞；把裂解液加到RNA Homogenizer離心柱中，高速離心2 min，收集勻漿液，并加入同體積的70%乙醇；將以上混合液加入到HiBind RNA Mini柱中，離心1 min，去濾液；離心后棄上清，加入500 μL RNA Wash BufferⅠ至HiBind RNA Mini柱中，離心30 s；離心后棄上清，加入500 μL RNA Wash BufferⅡ至HiBind RNA Mini柱中，離心1 min；重復以上RNA Wash BufferⅡ清洗步驟；HiBind RNA Mini柱高速離心2 min，室溫下放置2 min使得柱子殘留酒精揮發(fā)完全；將HiBind RNA Mini放置于1.5 mL離心管中，并加入50 μL DEPC水，室溫放置2 min，高速離心2 min，收集到的RNA溶液保存于-70°C。應用微量核酸蛋白測定儀測定從各標本中提取RNA的OD260/OD280值，并計算RNA溶液濃度，將比值在1.8～2.0之間的標本進行逆轉錄反應。

1.5.3 逆轉錄淵RT冤反應按照康為世紀公司生產(chǎn)的SuperQuickRT cDNA第一鏈合成試劑盒說明書進行逆轉錄反應，采用20 μL反應體系：5×RT Buffer 4 μL，dNTP Mix 4 μL，Primer Mix 1 μL，SuperQuickRT Mix 1 μL，RNA 2μL，無RNase水8 μL。反應條件為：42°C孵育30 min，85°C孵育5 min。反應結束短暫離心后置于冰上冷卻，-20°C保存。

1.5.4 多聚合酶鏈淵PCR冤反應按照2×Es Taq Master-Mix產(chǎn)品說明書進行PCR反應，采用20 μL反應體系：2×Es Taq MasterMix 10 μL，上游引物1 μL，下游引物1 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水6 μL。反應步驟為：95°C孵育10 min，95°C孵育30 s，58°C孵育30 s，72℃延伸30 s，擴增35個循環(huán)，擴增完成后72°C孵育10 min；4°C保存。

1.5.5 瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像制備2%濃度的瓊脂糖凝膠（含溴化乙錠），將PCR產(chǎn)物和DNA Marker直接上樣至瓊脂糖凝膠中，120 V穩(wěn)壓電泳40 min后用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)拍照，并用Image J軟件進行灰度值測定。

1.6 NOS活性檢測

嚴格按照試劑盒所提供試劑及操作方法進行。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 頸部應力不良對大鼠血清IL-6水平影響

大鼠血清IL-6水平檢測結果表明：隨造模時間延長，C組及D組血清IL-6水平逐漸增高，其中，與A組比較，C組3術后3、6個月，D組術后6個月血清IL-6水平明顯升高（P＜0.05）；與B組比較，C、D組術后6個月血清IL-6水平明顯升高（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠不同時間血清IL-6水平比較（pg/mL，）

表1 各組大鼠不同時間血清IL-6水平比較（pg/mL，）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，△P＜0.05；“-”表示未檢測

組別只數(shù)術后1個月術后3個月術后6個月A組B組C組D組6 --18 18 18 77.2±11.2 93.9±17.1 128.3±9.8 101.3±10.4 88.3±13.2 150.4±16.7*126.9±13.5 79.7±9.4 194.5±25.4**Δ160.2±20.3*Δ

2.2 頸部應力不良對大鼠血清中NO水平的影響

大鼠血清NO水平檢測結果表明：隨造模時間延長，C組及D組血清NO水平增高，其中，與A組及B組比較，術后6個月C組、D組血清NO水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠不同時間血清NO水平比較（μmo1/L，）

表2 各組大鼠不同時間血清NO水平比較（μmo1/L，）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”表示未檢測

組別只數(shù)術后1個月術后3個月術后6個月A組B組C組D組6 --18 18 18 3.55±1.25 3.92±1.13 4.11±1.37 3.98±0.87 3.41±0.97 4.79±1.23 4.62±1.41 3.63±1.45 6.22±1.47**ΔΔ5.03±1.25*Δ

2.3 頸部應力不良對大鼠脊髓不同時段iNOS mRNA表達的影響

結果顯示，iNOS mRNA于A組和B組中未測得表達，C組及D組造模后1、3、6個月iNOS mRNA的表達逐漸增加，其中，與A組及B組比較，C組及D組術后3、6個月iNOS mRNA表達顯著升高（P＜0.05）。見表3、圖1～2。

表3 各組大鼠不同時間脊髓iNOS mRNA表達比較（）

表3 各組大鼠不同時間脊髓iNOS mRNA表達比較（）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”表示未檢測

組別只數(shù)術后1個月術后3個月術后6個月A組B組C組D組6 18 18 18 0 0 -0 -0 0.61±0.02 0.54±0.02 0.82±0.04*Δ0.76±0.05*Δ1.21±0.06**ΔΔ0.93±0.04*Δ

圖1 GAPDH的RT-PCR產(chǎn)物檢測情況

圖2 各組不同時間段iNOS mRNA的RT-PCR產(chǎn)物檢測情況

2.4 頸部應力不良對大鼠脊髓不同時段NOS活性的影響

實驗發(fā)現(xiàn)，造模1個月后，A組脊髓組織NOS的活性較B組基本無變化，C組NOS活性達到峰值，較A組及B組顯著升高（P＜0.01），D組NOS活性較A組顯著升高（P＜0.05）。造模3個月后，B組NOS活性有所降低，但與A組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），C組NOS活性略有下降，仍明顯高于A組及B組（P＜0.05），D組NOS活性升高至峰值，較A組及B組差異有高度統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。造模后6個月，B組NOS活性繼續(xù)下降，與A組之間差異仍無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），C組NOS活性開始反彈性升高，明顯高于A組及B組（P＜0.01），D組NOS活性在峰值后開始降低，較A組及B組差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 各組大鼠不同時間脊髓NOS活性比較（U/mgprot，）

表4 各組大鼠不同時間脊髓NOS活性比較（U/mgprot，）

注：與A組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與B組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；“-”表示未檢測

組別只數(shù)1個月3個月6個月A組B組C組D組6 --18 18 18 1.51±0.08 1.67±0.17 2.73±0.11**ΔΔ1.87±0.09*1.65±0.21 2.02±0.11*Δ2.35±0.13**ΔΔ1.55±0.22 2.27±0.13**ΔΔ1.98±0.28*Δ

圖3 各組大鼠不同時間脊髓NOS活性動態(tài)變化

3 討論

目前普遍認為頸椎病是多種因素共同作用的結果，包括勞損、創(chuàng)傷、退變、炎癥及先天畸形等諸多方面［14-15］?，F(xiàn)代生物力學研究顯示，人體脊柱的平衡包括動力平衡和靜力平衡。現(xiàn)代人們的生活方式改變，長時間低頭伏案、異常的姿勢、精神緊張等均可產(chǎn)生頸部不良應力，改變頸部肌肉力量，打破平衡，引起肌纖維損傷、肌力減弱，直接導致頸椎動靜力平衡破壞及力學性能降低而加劇頸椎的退變［16］。本研究通過人為切斷實驗大鼠部分頸部伸肌，以破壞頸椎動力穩(wěn)定系統(tǒng)，從而建立頸部不良應力動物模型，借鑒目前脊髓損傷方面研究成果，以RT-PCR法檢測不同時段大鼠脊髓組織iNOS mRNA的表達情況，探索頸部不良應力與脊髓神經(jīng)組織損害的相關性。

NO作為一種炎癥介質(zhì)，在體內(nèi)是以左旋精氨酸為底物并在NOS的催化作用下形成的，NOS是NO合成的關鍵酶。目前研究顯示NOS主要有三型：Ⅰ型神經(jīng)元型，Ⅱ型誘導型；Ⅲ型內(nèi)皮型。iNOS的生物活性不依賴于鈣及鈣調(diào)蛋白，一般情況下不表達，在免疫刺激、細胞因子、創(chuàng)傷缺血等條件下經(jīng)轉錄和翻譯才表達，在激活后其活性持續(xù)時間較長，持續(xù)產(chǎn)生的NO可能在中樞神經(jīng)系統(tǒng)缺血后遲發(fā)性神經(jīng)元損傷中起重要作用［17-21］。本研究結果顯示，由于頸后肌群的損傷引起頸部應力不良，從而誘導iNOS的表達及NOS活性升高，局部NO升高，而全身NO不一定升高，而對局部周圍組織產(chǎn)生繼發(fā)損害。還通過與A組和B組的對比發(fā)現(xiàn)，C組和D組的iNOS mRNA表達及NOS活性均有所增加，C組的iNOS mRNA表達量高于后淺肌群損傷組D組，且C組的NOS活性升高早于D組。

綜上所述，本研究證明頸部肌肉應力不平衡是慢性頸脊髓損傷的一個重要原因，但受限于實驗條件的影響，未能完全模擬人體頸部應力不良的情況，肌肉應力不平衡是否為頸椎病的始動因素有待更多的實驗研究進一步觀察。

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ExPerimental research of effect of cervical vertebra adverse stress on ex-Pression of inducible nitric oxide synthase in rat sPinal cord

SHEN Lufeng1ZHANG Suihui2DONG Xieping3DU Xiaomei1SUN Yanqun4
1.Department of Rehabi1itation Medicinia1，Jiangxi Provincia1 Peop1e's Hospita1，Jiangxi Province，Nanchang330006，China；2.Jiangxi University of Traditiona1 Chinese Medicine，Jiangxi Province，Nanchang330025，China；3.Department of Orthopaedics，Jiangxi Provincia1 Peop1e's Hospita1，Jiangxi Province，Nanchang330006，China；4.Hea1thcare C1inic for Cadres，Jiangxi Provincia1 Peop1e's Hospita1，Jiangxi Province，Nanchang330006，China

Objective To discuss the effect of cervica1 vertebra adverse stress on expression of inducib1e nitric oxide synthase（iNOS mRNA）in rat spina1 cord.Methods Sixty SD-rats were random1y divided into 4 groups：the contro1 group（group A，6 rats）：dea1 with nothing；the sham operation group（group B，18 rats）：on1y given skin incision，without damage to any musc1e；the back deep musc1e injury group（group C，18 rats）：excised the deep musc1e of back cervica1；the back sha11ow musc1e injury group（group D，18 rats）：excised the sha11ow musc1e of back cervica1.The serum IL-6，NO 1eve1s and iNOS mRNA expression and NOS activity changes in rat spina1 cord were dynamica11y observed at 1，3，6 months after surgery.Results①IL-6 1eve1s：compared with group A，IL-6 1eve1s significant1y increased at 3 and 6 months after surgery in group C，at 6 months in group D（P＜0.05）；compared with group B，IL-6 1eve1s significant1y increased at 6 months in group C and group D（P＜0.05）.②NO 1eve1s：compared with group A and group B，serum NO 1eve1s significant1y increased at 6 months after surgery in group C and group D（P＜0.05）.③iNOS mRNA：there was no iNOS mRNA expression in group A and B，iNOS mRNA expression significant1y increased at 3 and 6 months after surgery in group C and group D（P＜0.05）.④NOS activity：1 month after surgery，compared with group A and B，the NOS activity significant1y increased in group C（P＜0.01），which in group D was higher than group A（P＜0.05）；3 and 6 months after surgery，there were statistica11y significant difference in NOS activity between group C，D and group A，B（P＜0.05）.Conclusion The adverse stress of cervica1 vertebra may 1ead to chronic injuries of cervica1 spina1 cord.

Adverse stress of cervica1 vertebra；Induced nitric oxide synthase；Nitric oxide；Gene expression

R651.2

A

1673-7210（2016）07（c）-0025-04

2016-04-22本文編輯：程銘）

江西省青年科學基金項目（20122BAB215051）。