姚紅偉+高悅勉

摘要：以魁蚶為研究材料，建立了魁蚶的AFLP分子標(biāo)記反應(yīng)體系。對(duì)其分析過程中的酶切鏈接、預(yù)擴(kuò)增、選擇性擴(kuò)增等試驗(yàn)條件進(jìn)行了檢測(cè)與篩選，得到了清晰的AFLP指紋圖譜，為探討魁蚶種群之間的遺傳關(guān)系和遺傳圖譜的構(gòu)建等方面提供了新的技術(shù)手段。

關(guān)鍵詞：魁蚶；AFLP；反應(yīng)體系

魁蚶（Scapharca broughtonii）也叫血貝或赤貝，屬軟體動(dòng)物門（Mollusca），瓣鰓綱（Lamellibranchia），翼形亞綱（Pterimorphia），蚶科（Arcidae），是一種大型蚶類。在我國(guó)分布海域?yàn)辄S海、渤海及東海，以黃海北部和渤海較多。AFLP（擴(kuò)增長(zhǎng)度片段多態(tài)性）是一種檢測(cè)DNA多態(tài)性的分子標(biāo)記方法，具有多態(tài)性高，DNA用量少，檢測(cè)效率高，可靠性好，分辨率高和無需預(yù)先知道基因組信息等優(yōu)點(diǎn)。目前AFLP技術(shù)在泥蚶[1]、青蛤[2]、大竹蟶[3]、菲律賓蛤仔[4]以及扇貝[5]等貝類中有所應(yīng)用，但是還未見用于魁蚶研究的報(bào)道。本文以魁蚶為實(shí)驗(yàn)材料，選用常規(guī)PCR試劑和合成引物等化學(xué)藥品，探索出適合于魁蚶的AFLP分子標(biāo)記反應(yīng)體系。

1材料與方法

1.1材料

本實(shí)驗(yàn)采用魁蚶的斧足肌肉，活體解剖，-84 ℃保存。所用魁蚶樣本采自大連莊河海域的自然群體種貝。EcoRI和MseI引物及人工接頭均由上海生工合成，所用主要藥品中的剝離硅烷為北京鼎國(guó)生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品，親和硅烷、過硫酸銨、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺為BBI公司產(chǎn)品，蛋白酶K、RNaseA酶為AMRESCO公司產(chǎn)品，MseI內(nèi)切酶為NEB公司產(chǎn)品，Tap酶為上海生工銷售的Roche公司分裝產(chǎn)品，T4DNA連接酶和EcoRI內(nèi)切酶都是Fermentas公司產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)所用儀器為PCR擴(kuò)增儀（MG48+）、電泳儀（DYY-10C）、電泳槽（DYCZ-20B）等。

1.2方法

1.2.1魁蚶基因組DNA的提取魁蚶基因組DNA的提取采用苯酚-氯仿法。在1.5 mL離心管中加入600 μL的裂解液，取大約0.1 g魁蚶斧足肌肉置于其中剪成勻漿狀后加入10 μL蛋白酶K（20 mg/mL），將其混勻后置于55 ℃電熱恒溫箱中消化1.5 h，消化期間每隔15 min輕輕搖勻一次。將已消化完的澄清液冷卻至室溫加入600 μL苯酚，上下顛倒離心管混勻15 min，然后8 000 r/min離心10 min。取500 μL上清液置于另一離心管中，加入600 μL的苯酚∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1）上下顛倒離心管混勻15 min后，8 000 r/min離心10 min。取400 μL上清液置于另一離心管中，再加入600 μL的氯仿∶異戊醇（24∶1）上下顛倒離心管混勻15 min后，8 000 r/min離心10 min。取300 μL上清液置于另一離心管中，加入4 μL RNase A酶（10 mg/mL），37 ℃恒溫消化30 min后加入兩倍體積的預(yù)冷無水乙醇輕輕顛倒，待絮狀白色沉淀混勻后，室溫下靜置15 min左右。之后將裝有白色絮狀沉淀的離心管12 000 r/min離心20 min，用預(yù)冷的70%的乙醇進(jìn)行洗滌，共洗滌兩次。然后棄去乙醇，室溫干燥后加入50 μL的滅菌去離子水，待溶解后置于-20 ℃貯存。取3 μLDNA樣品與3 μL溴酚藍(lán)上樣緩沖液混勻后，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA樣品的質(zhì)量。在此基礎(chǔ)上將其稀釋至50 ng/ μL的濃度，作為雙酶切和連接的模板DNA濃度。

1.2.2酶切與連接本實(shí)驗(yàn)將酶切和連接同時(shí)進(jìn)行。在200 μL PCR管中分別加入：5 μL DNA模板（50 ng/μL），0.2 μL的100×BSA（10 mg/mL），1 μL的MseI接頭（50 μmol/L）和1 μL的EcoRI接頭（5 μmol/L），1.5 μL的10×T4DNA buffer和0.8 μL 的T4DNA連接酶（5 U/μL），0.3 μL 的EcoRI內(nèi)切酶（10 U/μL），0.6 μL 的MseI內(nèi)切酶（10 U/μL），加ddH2O補(bǔ)足25 μL的反應(yīng)體系。在PCR儀中37 ℃溫育8 h后取出，置于-20 ℃保存。

1.2.3預(yù)擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)包括：4 μL酶切連接液，2 μL的10×PCR buffer，1.8 μL的dNTP（2.5 mmol/L），預(yù)擴(kuò)增引物（10 μmol/L）各0.6 μL，1.2 μL的Mg2+（25 mmol/L），0.12 μL 的Tap酶（5 U/μL），加ddH2O補(bǔ)足20 μL的反應(yīng)體系?；靹蚝蟀慈缦翽CR反應(yīng)程序擴(kuò)增：第一步94 ℃預(yù)變性2 min；第二步94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，此步驟共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將其從PCR儀中取出，置于-20 ℃保存。

1.2.4選擇性擴(kuò)增預(yù)擴(kuò)增結(jié)束后，將其產(chǎn)物分別稀釋10倍、20倍、30倍、50倍、80倍和100倍的6個(gè)梯度進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，其反應(yīng)包括：4 μL預(yù)擴(kuò)增稀釋液，選擇性擴(kuò)增引物（10 μmol/L）各1.4 μL，3.6 μL的dNTP（2.5 mmol/L），2 μL的10×PCR buffer，1.4 μL的Mg2+（25 mmol/L），0.18 μL的 Tap酶（5μU/ μL），加ddH2O補(bǔ)足20 μL的反應(yīng)體系。混勻后按如下PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增：第一步94 ℃預(yù)變性2 min；第二步94 ℃ 40 s，65～56 ℃ 40 s（每循環(huán)退火溫度降低0.7 ℃），72 ℃ 1 min，此步驟共13個(gè)循環(huán)；之后變?yōu)?4 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，此步驟共30個(gè)循環(huán)；最后72 ℃ 5 min。選擇性擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將其從PCR儀中取出，置于-20 ℃保存。

1.2.5凝膠制備及銀染選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行凝膠制備，將6%的丙烯酰胺溶液50 mL與200 L的10%的過硫酸銨（APS）以及25 L的TEMED混合搖勻，待膠灌滿玻璃板后插入梳子，靜置凝集1.5 h左右，然后50 W恒功率預(yù)電泳膠板30 min。在此期間在選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物中加10 L甲酰胺上樣緩沖液，94 ℃變性5 min后立即放于冰上，預(yù)電泳結(jié)束后取7 L變性樣品迅速加入點(diǎn)樣孔，50 W恒功率電泳2 h左右。電泳結(jié)束后，小心分開兩塊玻璃板，將粘有膠的玻璃板置于1.5 L的10%冰乙酸溶液中輕輕搖晃30 min，用去離子水漂洗2次，每次5 min。然后在1.5 L新配置的染色液中（0.1%AgNO3，2.25 mL 37%甲醛）搖晃30 min，取出后立即用去離子水漂洗，時(shí)間不超過10 s。將沖洗后的玻璃板迅速放入1.5 L顯影液中（45 g無水NaCO3，300 L的10 mg/mL Na2S2O3，2.25 mL 37%甲醛）輕輕搖晃，直至出現(xiàn)帶紋。最后在10%冰乙酸溶液中定影5 min，再用去離子水漂洗，室溫下自然晾干。

2結(jié)果與檢測(cè)

2.1模板DNA的檢測(cè)

對(duì)提取的魁蚶基因組DNA用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果顯示主帶清晰完整，沒有拖尾現(xiàn)象。利用OPTIZEN 2120UV型紫外分光光度儀測(cè)定DNA質(zhì)量很高，符合實(shí)驗(yàn)要求?？阑蚪MDNA片段大小在23 kb以上，如圖1所示，圖中所用Marker為λDNA/HindⅢ。

圖1 魁蚶基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果

2.2雙酶切及連接檢測(cè)

本實(shí)驗(yàn)雙酶切采用較為常用的兩種酶EcoRI和MseI，雙酶切及連接反應(yīng)后的液體采用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果如圖2所示，酶切連接后的基因組DNA呈均勻的彌散狀（smear），片段大小主要集中在100～1 500 bp之間。

2.3預(yù)擴(kuò)增檢測(cè)

本試驗(yàn)用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)預(yù)擴(kuò)增結(jié)果，如圖3所示，預(yù)擴(kuò)增片段呈彌散狀（smear），各樣品擴(kuò)增強(qiáng)度基本一致。

2.4選擇性擴(kuò)增檢測(cè)

30個(gè)個(gè)體選擇性擴(kuò)增結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)將預(yù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋，發(fā)現(xiàn)其選擇性擴(kuò)增結(jié)果差別不大。因此，在實(shí)驗(yàn)過程中選擇稀釋20倍即可。本實(shí)驗(yàn)從64對(duì)引物組合中采用篩選出的引物組合（E-ACA，M-CAT） 即E35M59進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，指紋圖譜條帶清晰可見，信號(hào)強(qiáng)，多態(tài)性豐富，無背景干擾，說明AFLP指紋圖譜質(zhì)量很高。3討論

本實(shí)驗(yàn)旨在建立AFLP用于魁蚶分子標(biāo)記研究的反應(yīng)體系，由于AFLP標(biāo)記技術(shù)可采用不同類型的限制性內(nèi)切酶及不同數(shù)目的選擇性堿基，因此理論上AFLP標(biāo)記技術(shù)能產(chǎn)生無限多的標(biāo)記數(shù)而且可以覆蓋整個(gè)基因組，其多態(tài)性遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過其他分子標(biāo)記。然而該技術(shù)涉及諸多步驟，因此要保證各環(huán)節(jié)符合要求才能得到理想的結(jié)果：（一）高純度基因組DNA的制備是AFLP成功的關(guān)鍵，若DNA中蛋白質(zhì)含量多，則首先影響酶切效果或根本無法酶切。此外還要注意樣品是否新鮮以避免提取的DNA有降解或損傷。（二）酶切和連接可同時(shí)進(jìn)行，也可單獨(dú)進(jìn)行，本實(shí)驗(yàn)為優(yōu)化實(shí)驗(yàn)步驟，減少繁瑣操作，采用同時(shí)酶切和連接，在實(shí)際操作時(shí)要將PCR蓋口蓋緊，以免樣品蒸發(fā)。酶切和連接必須徹底，所以反應(yīng)時(shí)間要有保障，但是時(shí)間過長(zhǎng)又沒有必要，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所加試劑的量，筆者摸索出8 h左右即可。（三）在PCR擴(kuò)增反應(yīng)過程中各試劑成分間存在著動(dòng)態(tài)的平衡和制約。對(duì)于預(yù)擴(kuò)增和選擇性擴(kuò)增PCR反應(yīng)來說，Mg2+濃度至關(guān)重要。這是因?yàn)镸g2+不僅可以與Taq酶結(jié)合，激活其活性，而且可以和反應(yīng)體系中的dNTP和引物等結(jié)合，降低其實(shí)際濃度。所以當(dāng)Mg2+濃度過低時(shí)，Taq酶活力跟著降低，從而使PCR擴(kuò)增出的條帶數(shù)目少而模糊，而當(dāng)Mg2+濃度過高時(shí)，又會(huì)對(duì)Taq酶產(chǎn)生抑制作用，從而使PCR擴(kuò)增出的條帶產(chǎn)生拖尾并催生非特異性擴(kuò)增。此外，為使PCR效率達(dá)到最高，必須保證反應(yīng)混合物中有足夠量的dNTP，但是dNTP用量過高會(huì)增加堿基的錯(cuò)誤摻入率。本實(shí)驗(yàn)中dNTP和Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的質(zhì)和量影響較大，因此筆者設(shè)置其濃度正交試驗(yàn)最終得以確定Mg2+預(yù)擴(kuò)增的用量是1.2 μL（25 mmol/L），選擇性擴(kuò)增的量是1.4 μL（25 mmol/L）。dNTP預(yù)擴(kuò)增用量1.8 μL（2.5 mmol/L），選擇性擴(kuò)增用量3.6 μL（2.5 mmol/L）。模板DNA的質(zhì)量也是影響PCR擴(kuò)增的重要因素，但是由于AFLP對(duì)模板DNA反應(yīng)濃度并不敏感，因此不再對(duì)模板濃度進(jìn)行梯度調(diào)整，直接采用了250 ng。另外，很多實(shí)驗(yàn)例如像SSR分子標(biāo)記中會(huì)采用TE溶液稀釋DNA，但是TE中的EDTA會(huì)影響PCR反應(yīng)中Mg2+的實(shí)際濃度，所以為了消除此影響，本實(shí)驗(yàn)采用ddH2O來代替TE。對(duì)于引物量的調(diào)節(jié)也不是越大越好，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著引物量的增加，能看到更多擴(kuò)增的條帶，但是引物濃度過大，則會(huì)產(chǎn)生拖帶，并且主帶減少。Taq酶在堿性環(huán)境活性較高，過酸過堿都會(huì)影響PCR擴(kuò)增，在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)隨著Taq酶量的增加，擴(kuò)增條帶會(huì)變粗，本實(shí)驗(yàn)選擇性擴(kuò)增中，Taq酶的用量確定為0.18 μL（5 U/μL），過多會(huì)增加試驗(yàn)成本和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，過少則會(huì)減少擴(kuò)增產(chǎn)物的量。另外，不同廠家生產(chǎn)的Taq酶的濃度和擴(kuò)增效果并不一致，因此要使用固定廠家的Taq酶。最后需要注意的是AFLP選擇性擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)一般28～30次即可用于變性聚丙烯凝膠電泳檢測(cè)。（四）在凝膠制備過程中有時(shí)能看到膠體中出現(xiàn)小的氣泡，這樣會(huì)使最后跑出的譜帶形狀彎曲變形或無法識(shí)別，因此在制備過程中要注意玻璃板上沒有任何雜質(zhì)，在灌膠的時(shí)候保持膠體連續(xù)流入兩塊玻璃板之間，在膠體預(yù)電泳后要用吸管仔細(xì)吹吸加樣槽以防加樣時(shí)再次混入氣泡。實(shí)驗(yàn)中預(yù)電泳的時(shí)間太短也會(huì)導(dǎo)致正式電泳后條帶發(fā)虛模糊不清，時(shí)間過久膠體溫度過高則會(huì)出現(xiàn)拖帶。最后在染色液中一定要搖晃夠半小時(shí)，否則條帶會(huì)模糊。而在顯影液中時(shí)，漂洗時(shí)間不宜超過10 s，否則會(huì)導(dǎo)致條帶模糊甚至消失。

4展望

近年來海洋貝類養(yǎng)殖發(fā)展迅速，對(duì)海洋貝類遺傳變異研究也廣泛開展，而蚶類研究較少。目前，我國(guó)不同地理群體魁蚶的遺傳背景尚不完全清楚，這都有待于今后進(jìn)一步的研究。因此本試驗(yàn)建立AFLP反應(yīng)體系可以為將來魁蚶遺傳多樣性的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，了解其遺傳背景，并且為充分了解我國(guó)魁蚶自然群體的種質(zhì)狀況、資源的恢復(fù)和保護(hù)及遺傳改良以及選擇優(yōu)良的種貝和輔助育種方面提供技術(shù)支持。

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