王靜波+王小亮+杜瑜+王姝+曹歡+張文+徐立蒲

摘要：為了更加準(zhǔn)確地掌握病原菌耐藥性變化規(guī)律，合理指導(dǎo)養(yǎng)殖生產(chǎn)精準(zhǔn)用藥，減少抗菌藥物濫用，避免病原菌產(chǎn)生耐藥性，同時(shí)提高治療效果，減少生產(chǎn)成本，確保水產(chǎn)品質(zhì)量安全，北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站2015年通過非定點(diǎn)和定點(diǎn)兩種方式對北京市養(yǎng)殖魚類開展了精準(zhǔn)用藥監(jiān)測工作。全年非定點(diǎn)監(jiān)測40余個(gè)漁場，對55個(gè)樣品進(jìn)行了分析；分離病原菌以嗜水氣單胞菌和溫和氣單胞菌為主；采用K-B法檢測的病原菌藥物敏感性顯示：病原菌對氟喹諾酮類藥物（奧復(fù)星、左氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星）的敏感率較高，普遍在9074%以上；酰胺醇類（氟苯尼考）次之，為85.19%；四環(huán)素類（四環(huán)素、強(qiáng)力霉素）分別為75.93%和72.22%；兩種磺胺類藥物（磺胺異惡唑和甲氧芐啶）較低，分別為14.81%和24.07%。全年定點(diǎn)監(jiān)測冷水魚（虹鱒）和觀賞魚（金魚）各2個(gè)漁場，分離60株氣單胞菌；監(jiān)測結(jié)果顯示，北京市虹鱒魚源和金魚源的氣單胞菌對磺胺類藥物耐藥最為嚴(yán)重，耐藥率均在90%以上，耐藥濃度在512 μmg/mL以上，其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐藥率約為30%，而乳酸諾氟沙星、煙酸諾氟沙星和鹽酸多西環(huán)素，耐藥率分別為3.3%、1.7%和1.7%。

關(guān)鍵詞：北京市；養(yǎng)殖魚類；精準(zhǔn)用藥；監(jiān)測

2015年北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站通過組織開展的養(yǎng)殖魚類精準(zhǔn)用藥監(jiān)測工作，初步了解掌握了北京市養(yǎng)殖魚類病原菌組成及其耐藥性變化規(guī)律，為科學(xué)防治魚病提供參考。

1監(jiān)測方式

1.1非定點(diǎn)監(jiān)測

4-10月，根據(jù)養(yǎng)殖戶的需求，我站技術(shù)人員親自到漁場進(jìn)行現(xiàn)場魚病診斷，了解養(yǎng)殖場基本信息，詢問發(fā)病、死亡及用藥情況等信息。現(xiàn)場進(jìn)行水質(zhì)測定、寄生蟲檢測和無菌操作進(jìn)行病原菌分離，然后將待測樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，進(jìn)行培養(yǎng)、鑒定及敏感藥物篩選 。2～3 d篩選出敏感藥物及時(shí)告知養(yǎng)殖戶，防止藥物濫用，提高治療有效率。并定期回訪養(yǎng)殖戶，跟蹤調(diào)查用藥效果。

1.2定點(diǎn)監(jiān)測

為了更加準(zhǔn)確地掌握病原菌耐藥性變化規(guī)律，2015年北京市水產(chǎn)技術(shù)推廣站根據(jù)北京市水產(chǎn)養(yǎng)殖特色，分別在懷柔區(qū)和通州區(qū)設(shè)置冷水魚（虹鱒魚）和觀賞魚（金魚）采樣點(diǎn)。虹鱒魚采樣點(diǎn)為北京順通虹鱒魚養(yǎng)殖中心和北京臥佛山莊養(yǎng)殖有限公司；金魚采樣點(diǎn)為通州區(qū)臺湖鎮(zhèn)唐大莊村的2家金魚養(yǎng)殖場。4月至10月，每月采樣1次。取池塘中患病或不健康的魚，一般不少于6尾，和原池水裝入高壓聚乙烯袋，加冰塊，立即運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行病原菌分離。采樣現(xiàn)場記錄漁場的發(fā)病、死亡及用藥情況等信息。

2病原菌的分離、鑒定與保存

對溫水性魚類（鯉、草、鯽、金魚等）病魚樣品，無菌操作直接取肝、腎劃線于腦心浸液瓊脂（BHIA）上，28 ℃培養(yǎng)24～48 h，取優(yōu)勢菌落進(jìn)行純化。對冷水性魚類（虹鱒等）樣品，無菌操作取肝、腎組織塊，首先接種于腦心浸液肉湯（BHI），然后在BHIA上劃線分離。前者22 ℃增菌24～48 h，然后采用RS瓊脂劃線分離，選擇黃色、圓形、微凸且有芳香性氣味的菌落進(jìn)行純化。后者于22 ℃培養(yǎng)72 h，若出現(xiàn)產(chǎn)褐色素的菌落，則分離純化。

經(jīng)純化的菌落采用API鑒定系統(tǒng)或者結(jié)合PCR 擴(kuò)增16S rDNA基因進(jìn)行鑒定，最后于-80 ℃保存。

3病原菌的抗菌藥物感受性檢測

3.1針對非定點(diǎn)監(jiān)測分離病原菌對抗菌藥物只進(jìn)行定性分析

由于非定點(diǎn)監(jiān)測區(qū)均為臨時(shí)發(fā)病場，且急需用藥進(jìn)行治療。因此我們針對非定點(diǎn)監(jiān)測區(qū)分離病原菌對抗菌藥物只進(jìn)行定性分析，即采用紙片擴(kuò)散法（K-B法）（表1），將敏感藥物及時(shí)反饋養(yǎng)殖戶，進(jìn)行及時(shí)治療。

表1紙片擴(kuò)散法使用抗菌藥物及界定的敏感線

藥物類別藥物種類簡稱藥敏紙片濃度

（μg/片）判斷標(biāo)準(zhǔn)/mm耐藥中介敏感備注磺胺類四環(huán)素酰胺醇類氟喹諾酮類磺胺甲惡唑磺300≤1213～16≥17國標(biāo)漁藥甲氧芐啶T 5≤1011～15≥16國標(biāo)漁藥四環(huán)素四30≤1415～18≥19漁藥手冊強(qiáng)力霉素強(qiáng)30≤1213～15≥16國標(biāo)漁藥氟苯尼考尼75≤1213～17≥18國標(biāo)漁藥奧復(fù)星奧5≤1213～15≥16漁藥手冊左氟沙星左5≤1314～16≥17漁藥手冊氟哌酸氟10≤1213～16≥17國標(biāo)漁藥恩諾沙星嗯5≤1617～19≥20國標(biāo)漁藥

3.2針對定點(diǎn)監(jiān)測區(qū)分離病原菌對抗菌藥物集中進(jìn)行定量分析

采用最小抑菌濃度（MIC）法對分離病原菌對我國現(xiàn)在允許使用的水產(chǎn)用抗菌類藥物進(jìn)行耐受性分析，結(jié)合分離漁場用藥情況，分析出不同病原菌對不同抗菌藥物的感受性，以便更合理地選擇抗菌藥物種類，包括硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、氟苯尼考、甲砜霉素、煙酸諾氟沙星、乳酸諾氟沙星、磺胺嘧啶鈉、磺胺二甲氧嘧啶鈉、新諾明。

4監(jiān)測結(jié)果

4.1非定點(diǎn)監(jiān)測結(jié)果

4-10月，我站在通州、平谷、順義、懷柔、昌平、密云等區(qū)縣的40余個(gè)漁場進(jìn)行了魚病診療工作，對55個(gè)樣品進(jìn)行了病原菌分離及敏感藥物篩選。涉及品種有草魚、鯉魚、觀賞魚（金魚、錦鯉）、虹鱒和鱘魚等。

4.1.1病原菌分離情況2015年 4月至10月，根據(jù)疾病流行季節(jié)和水溫等情況每隔10～15 d監(jiān)測1次。累計(jì)采集16次、55個(gè)樣品。其中草魚22個(gè)、鯉8個(gè)、鯽2個(gè)、青魚1個(gè)、泥鰍1個(gè)，金魚樣品12個(gè)、錦鯉9個(gè)。共分離病原菌17種54株，其中2株未鑒定出。分離菌中嗜水氣單胞菌21株、溫和氣單胞菌15株，分別占總分離株的38.89%和27.78%，分離自草魚、鯉、鯽、錦鯉和草金魚；其次為類志賀鄰單胞菌、泛菌屬和產(chǎn)堿假單胞菌，分離自草魚和錦鯉。

4.1.2病原菌藥物敏感性總體分析采用K-B法檢測的病原菌藥物敏感性結(jié)果：總體上，氟喹諾酮類藥物（奧復(fù)星、左氧氟沙星、諾氟沙星和恩諾沙星）對病原菌的敏感率較高，普遍在90.74%以上；酰胺醇類（氟苯尼考）對病原菌的敏感率次之，為85.19%；四環(huán)素類（四環(huán)素、強(qiáng)力霉素）對病原菌的敏感率分別為75.93%和72.22%；兩種磺胺類藥物（磺胺異惡唑和甲氧芐啶）對病原菌的敏感率較低，分別為14.81%和24.07%。

4.2定點(diǎn)監(jiān)測結(jié)果

4.2.1病原菌的分離4-10月，在4個(gè)監(jiān)測點(diǎn)共采集樣品18次。分離氣單胞菌60株，其中嗜水氣單胞菌22株（虹鱒魚源8株、金魚源14株）、溫和氣單胞菌30株（虹鱒魚源9株、金魚源21株）、殺鮭氣單胞菌8株（來自虹鱒魚）。本次監(jiān)測主要對氣單胞菌屬的細(xì)菌進(jìn)行了耐藥性分析。

4.2.2分離60株氣單胞菌對9種抗菌藥物的耐藥性總體情況監(jiān)測結(jié)果顯示，北京市虹鱒魚源和金魚源的氣單胞菌對磺胺類藥物耐藥最為嚴(yán)重，耐藥率均在90%以上，耐藥濃度在512 μg/mL以上；其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐藥率約為30%。耐藥率低于5%的藥物種類為乳酸諾氟沙星、鹽酸諾氟沙星和鹽酸多西環(huán)素，耐藥率分別為3.3%、1.7%和1.7%。

4.2.3不同氣單胞菌種類對抗菌藥物的耐藥性分析監(jiān)測結(jié)果顯示，共分離嗜水氣單胞菌（A.H）22株、溫和氣單胞菌（A.S）30株和殺鮭氣單胞菌（A.S.S）8株。氣單胞菌對磺胺類藥物的耐藥率和加權(quán)平均MIC值，A.H>A.S>A.S.S；對氟苯尼考和甲砜霉素的耐藥率和加權(quán)平均MIC值，A.S.S>A.H>A.S；對鹽酸多西環(huán)素的耐藥率，A.S>A.H=A.S.S，對鹽酸多西環(huán)素的加權(quán)平均MIC，A.H>A.S.S>A.S。對硫酸新霉素的耐藥率和加權(quán)平均MIC值，A.S>A.H>A.S.S；對乳酸諾氟沙星和鹽酸諾氟沙星的耐藥率，A.H>A.S.S=A.S，對乳酸諾氟沙星和鹽酸諾氟沙星的加權(quán)平均MIC值，A.S.S>A.H>A.S，見表3。

5分析與建議

北京市養(yǎng)殖魚類分離病原菌均對磺胺類藥物呈現(xiàn)較高的耐受率，均在90%以上；建議養(yǎng)殖戶停止該藥的使用；對酰胺醇類（氟苯尼考）的敏感率次之；而對氟喹諾酮類藥物（諾氟沙星、恩諾沙星）和四環(huán)素類（鹽酸多西環(huán)素）敏感率較高。因此，在生產(chǎn)中可以首選敏感率高的抗菌藥物，但由于不同養(yǎng)殖場、不同魚類、不同病原菌種類、甚至同種病原菌的不同菌株對抗菌藥物的感受性不同。所以，建議還是要依據(jù)檢測結(jié)果指導(dǎo)養(yǎng)殖者合理使用抗菌藥物。

另外，本文采用的兩種氟喹諾酮類藥物中的乳酸諾氟沙星和煙酸諾氟沙星已經(jīng)于2016年1月1日起禁止用于養(yǎng)殖生產(chǎn)，屆時(shí)可采用該類藥物中的恩諾沙星。

氟苯尼考在使用過程中，容易使病原菌短時(shí)間產(chǎn)生較高的耐藥性，且其耐藥性消失速率較慢。因此，建議使用該藥時(shí)需要一次給足劑量，且再次使用時(shí)需增加用藥間隔。