雨生紅球藻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立

侯善茹, 馮興標(biāo), 李光偉, 陳丹陽, 袁瀏歡， 劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

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雨生紅球藻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系的建立

侯善茹, 馮興標(biāo), 李光偉, 陳丹陽, 袁瀏歡， 劉永勝

(合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009)

文章以植物表達載體pBI121、農(nóng)桿菌EHA105為體系,建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的雨生紅球藻轉(zhuǎn)化方法,通過篩選羧芐青霉素、G418等抗生素對雨生紅球藻生長的影響,確定了以200 μg/L G418和500 mg/L羧芐青霉素為篩選體系。轉(zhuǎn)化的雨生紅球藻以CaMV 35S和來源于番茄的八氫番茄紅素脫氫酶基因的啟動子(PDS啟動子)成功表達了報告基因GFP和YFP,拓寬了pBI121載體的應(yīng)用范圍,為雨生紅球藻的轉(zhuǎn)化提供了一個新的遺傳轉(zhuǎn)化途徑。番茄來源的PDS啟動子能夠啟動報告基因的表達,表明植物源的啟動子能夠在雨生紅球藻中表達,為植物源的啟動子驗證及基因瞬時表達提供了一個新的方法。

雨生紅球藻;農(nóng)桿菌;遺傳轉(zhuǎn)化;PDS啟動子

雨生紅球藻(Haematococcuspluvialis)屬于綠藻門、綠藻綱、團藻目、紅球藻科、紅球藻屬。雨生紅球藻能夠進行光合自養(yǎng)和化能異養(yǎng)方式生長,在弱光、氮磷豐富的條件下以綠色游動營養(yǎng)細胞狀態(tài)存在,這種狀態(tài)下生長旺盛;在脅迫條件下,以不動厚壁孢子形態(tài)存在,該階段能夠產(chǎn)生蝦青素,蝦青素的質(zhì)量可高達細胞干重的3%～4%。蝦青素具有較高的抗氧化性能,廣泛地應(yīng)用于食品、化妝品及醫(yī)藥等領(lǐng)域,雨生紅球藻已被批準作為新資源食品,因此對雨生紅球藻的資源開發(fā)和利用具有重要的意義。

利用基因工程技術(shù)改造藻類是藻類資源開發(fā)和應(yīng)用的一個重要方向。萊茵衣藻(Chlamydomonasreinhardtii)是模式生物,已經(jīng)進行了全基因組測序[1],遺傳背景清楚,是轉(zhuǎn)化體系研究較多的藻類。文獻[2]利用帶有酵母arg基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細胞壁和arg缺陷型萊茵衣藻,獲得了arg缺陷營養(yǎng)互補的轉(zhuǎn)基因萊茵球藻,轉(zhuǎn)化子的效率為3～4個/107個細胞。文獻[3]將根癌農(nóng)桿菌用于萊茵衣藻的轉(zhuǎn)化,T-DNA 插入了衣藻的基因組中,轉(zhuǎn)化效率為350 個/106個細胞,該方法是玻璃珠轉(zhuǎn)化效率的50倍,轉(zhuǎn)化子在沒有選擇壓力的情況下穩(wěn)定存在了 18 個月。文獻[4]采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法,以潮霉素為篩選標(biāo)記,實現(xiàn)了對雨生紅球藻的成功轉(zhuǎn)化,并用 β-胡蘿卜素酮化酶(BKT)基因轉(zhuǎn)化雨生紅球藻,所獲得的轉(zhuǎn)基因球藻蝦青素質(zhì)量分數(shù)是野生型的2～3倍[5]。

pBI121載體源于美國Clontech實驗室,文獻[6]對其進行了重新構(gòu)建(accession number AF485783),是常用的植物轉(zhuǎn)化載體。本研究利用pBI121載體上的NPTⅡ基因(新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因)為抗性基因,G418為篩選標(biāo)記,分別以CaMV 35S和番茄的八氫番茄紅素脫氫酶基因的啟動子(PDS promoter)表達GFP和YFP報告基因,利用雨生紅球藻進行遺傳轉(zhuǎn)化,成功地建立了用農(nóng)桿菌介導(dǎo)雨生紅球藻遺轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藻種、菌株與質(zhì)粒

生紅球藻購于中國科學(xué)院水生生物研究所,藻種編號FACHB-712。大腸桿菌DH5α 和農(nóng)桿菌EHA105由本實驗室保藏。帶有報告基因GFP和YFP的植物表達載體pBI121由本實驗室保存。

1.1.2 主要培養(yǎng)基和試劑

BBM(bold′s basal medium)培養(yǎng)基[7]、TAP(tris-acetate-phosphate)培養(yǎng)[8]和Z8培養(yǎng)基[9],用于雨生紅球藻的培養(yǎng)；LB(Luria-Bertanin)培養(yǎng)基,用于大腸桿菌和農(nóng)桿菌的培養(yǎng)。

所用的化學(xué)試劑均購于國藥集團;抗生素利福平、卡那霉素、羧芐青霉素、頭孢噻肟鈉、G418購于生物工程(上海)股份有限公司。

質(zhì)粒小量提取試劑盒(貨號:EM101-01)和DNA片段瓊脂糖凝膠回收試劑盒(貨號:EG101-01)購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。

Pfu聚合酶,XbaⅠ、HindⅢ,PstⅠ限制性內(nèi)切酶,T4連接酶均購于TaKaRa公司。

1.1.3 儀器和設(shè)備

Thermo Fisher Scientific 2720型聚合鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR) 擴增儀；Bio-Rad Molecular Imager Gel DOC XR全自動凝膠成像系統(tǒng);Thermo Scientific Sorvall ST臺式離心機;Thermo Sorvall高速冷凍離心機;OLYMPUS IX81熒光顯微鏡；BD公司FACSCalibur流式細胞儀。

1.2 方法

1.2.1 雨生紅球藻的培養(yǎng)

將藻種接入BBM培養(yǎng)基中,置于45～55 μmol/(m2·s)的光照強度、22 ℃、光周期16/8(光照/黑暗)的條件下培養(yǎng),除非特殊聲明,以下的培養(yǎng)條件與此相同。

1.2.2 抗生素的選擇

羧芐青霉素和G418對雨生紅球藻的影響。向10 mL BBM液體培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為10、500 mg/L的羧芐青霉素或加入終質(zhì)量濃度為50、200、500 μg/L的G418,以不加抗性的培養(yǎng)基作為對照,接種量均約1×105個細胞,于25 mL細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)7 d,進行血球細胞板計數(shù);配置BBM固體培養(yǎng)基,加入質(zhì)量濃度分別為0、5、120、500 mg/L的羧芐青霉素,培養(yǎng)30 d左右;配置Z8固體培養(yǎng)基,加入質(zhì)量濃度分別為0、50、200、500 μg/L的G418,培養(yǎng)30 d左右,所用固體平板直徑為100 mm,每個平板涂布的細胞數(shù)均為1×105個。

羧芐青霉素對農(nóng)桿菌的影響。取生長至OD600為0.5的農(nóng)桿菌,稀釋1×10-5,取200 μL,將其涂在分別含0、200、500 mg/L羧芐青霉素的Z8固體培養(yǎng)基上,28 ℃培養(yǎng)2～3 d,進行平板計數(shù)。

以上抗性實驗獨立重復(fù)3次。

1.2.3 載體的構(gòu)建

本研究所用的載體pBI121-35S-GFP和pBI121-35S-YFP是由本實驗室保存。根據(jù)番茄(Lycopersiconesculentum)序列X71023設(shè)計引物,擴增PDS啟動子,替代pBI121-35S-YFP中的CaMV 35S啟動子,載體上可用的酶切位點有1個Hind Ⅲ和Xba Ⅰ,而PDS promoter上有4個Hind Ⅲ,采用PCR產(chǎn)生HindⅢ黏性末端的方法[10]來構(gòu)建pBI121-PDS-YFP表達載體,所用的模板是從番茄中提取的基因組DNA。所用引物如下:

引物PDS-R序列為:CAATTTGAGGCATTCTAGAGAAAAATAACAGT，酶切位點為XbaⅠ;引物PDSF-had序列為:AGGTTCTTGTGCCAAGATTACCTTATGAT，酶切位點為HindⅢ黏性末端;

引物PDSF-HdB 序列為:TCTTGTGCCAAGATTACCTTATGAT 酶切位點為HindⅢ黏性末端;

引物GFP-F序列為:CCGTGTTATGGT GAGCAAG;

引物GFP-R序列為:TTACTTGTACAGCTCGTCCAT。

將載體pBI121-35S-YFP用HindⅢ與XbaⅠ進行雙酶切,回收載體片段;將PDS啟動子的PCR產(chǎn)物用XbaⅠ進行酶切,回收酶切基因片段,載體片段與基因片段連接轉(zhuǎn)化DH5a,挑單克隆,PCR鑒定,送南京金斯瑞生物科技有限公司測序,測序引物為PDSF-HdB。將表達質(zhì)粒pBI121-35S-GFP和測序正確的質(zhì)粒pBI121-PDS-YFP,采用電轉(zhuǎn)法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

1.2.4 遺傳轉(zhuǎn)化

將在BBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)7～8 d的雨生紅球藻涂布TAP固體培養(yǎng)基上,每個平板1×106個細胞,培養(yǎng)7 d左右。將含GFP或YFP農(nóng)桿菌接種到10 mL LB培養(yǎng)基中,培養(yǎng)基中含有25 mg/L利福平、50 mg/L卡那霉素以及200 μmol/L乙酰丁香酮,于搖床上28 ℃、220 r/min培養(yǎng),待吸光度為0.5時取1 mL菌液,于2 790g下離心10 min。用200 μL TAP液體培養(yǎng)基重懸,其中TAP培養(yǎng)液中含有200 μmol/L乙酰丁香酮,涂在長有雨生紅球藻的TAP固體培養(yǎng)基上,共培養(yǎng)48 h。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子的篩選

將共培養(yǎng)48 h后的轉(zhuǎn)化球藻從TAP平板上用無菌水洗下,置于50 mL離心管中,加無菌水至40 mL,100g離心6 min,將轉(zhuǎn)化球藻用無菌水清洗2次,設(shè)置離心機加速度為9,減速度為6。棄上清,向球藻中加入Z8液體培養(yǎng)基,其中Z8培養(yǎng)基含有250 mg/L頭孢噻肟鈉和500 mg/L羧芐青霉素,靜置30 min,然后離心去除上清,保留液體體積不超過300 μL,將球藻全部涂于Z8固體培養(yǎng)基上,培養(yǎng)基中含有200 μg/L G418、250 mg/L頭孢噻肟鈉和500 mg/L羧芐青霉素。培養(yǎng)7 d后,將Z8培養(yǎng)基上篩選的球藻,用無菌水洗下,離心棄上清,再用40 mL BBM清洗1次,其中BBM培養(yǎng)基含有250 mg/L頭孢噻肟鈉和500 mg/L羧芐青霉素,離心去上清,將球藻懸浮于10 mL BBM液體培養(yǎng)基中,于25 mL細胞培養(yǎng)瓶中進行培養(yǎng),培養(yǎng)基中含有200 μg/L G418、250 mg/L頭孢噻肟鈉和500 mg/L羧芐青霉素。7 d后進行分析和鑒定。

1.2.6 轉(zhuǎn)化的鑒定

取轉(zhuǎn)化球藻和野生型球藻各1 mL,1 000g下5 min進行離心,各棄去900 μL上清,用剩余的培養(yǎng)基懸浮球藻,進行激光共聚焦顯微分析。

1.2.7 陽性比例分析

將轉(zhuǎn)化球藻進行傳代1次,以獲得足夠的細胞,進行流式細胞分析,并以野生型雨生紅球藻為對照。

1.2.8 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性

每隔14 d進行傳代1次,定期進行激光共聚焦顯微分析和流式細胞分析。

1.2.9 陽性球藻對G418的耐受

將轉(zhuǎn)化球藻分別接入含有0、100、200、500 μg/L G418的BBM液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),檢查球藻的生長情況。

2 實驗結(jié)果

2.1 抗生素的影響

抗生素對雨生紅球藻和農(nóng)桿菌的影響如圖1所示。

圖1 抗生素對雨生紅球藻和農(nóng)桿菌的影響

由圖1可知,羧芐青霉素的質(zhì)量濃度為10、500 mg/L時,雨生紅球藻在BBM液體培養(yǎng)基上生長與無抗生素的BBM中生長基本一致,在BBM固體培養(yǎng)基上的生長兩者也無區(qū)別,不會抑制雨生紅球藻的生長,羧芐青霉素對雨生紅球藻生長的影響見表1所列,G418在BBM培養(yǎng)基中會抑制雨生紅球藻的生長,導(dǎo)致球藻數(shù)目下降。質(zhì)量濃度為200 μg/L G418的Z8培養(yǎng)基上也不能長出克隆。在Z8培養(yǎng)基上200 mg/L羧芐青霉素就可以抑制農(nóng)桿菌的生長。

表1 G418對野生型雨生紅球藻影響

2.2 表達載體的構(gòu)建

采用十六烷基三甲基溴化銨(cetyltrimethylammonium ammonium bromide,CTAB)法從番茄綠果中提取基因組DNA,以基因組DNA為模板,分別用引物對PDSF-HdA與PDS-R以及PDSF-HdB與PDS-R擴增PDS啟動子,擴增片段大小約2 140 bp。取擴增產(chǎn)物各3 μL混合,95 ℃變性10 min,放置室溫自然復(fù)性20 min,取3 μL混合物,進行XbaⅠ酶切2 h,反應(yīng)體系為50 μL,切膠回收酶切片段。pBI121-35S-YFP進行HindⅢ與XbaⅠ雙酶切,回收載體片段。用T4連接酶連接回收產(chǎn)物,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a,挑取陽性克隆,PCR鑒定。PCR擴增片段大小及酶切驗證如圖2所示。

圖2 構(gòu)建質(zhì)粒的PCR擴增以及酶切驗證

PCR擴增PDS啟動子,PstⅠ與XbaⅠ雙酶切陽性克隆質(zhì)粒,酶切片段包含PDS啟動子和部分載體片段。

由圖2可看出,PCR擴增片段大小與酶切圖譜與預(yù)期相符,通過測序表明獲得了正確的PDS啟動子序列。將構(gòu)建好的pBI121-PDS-YFP載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105。

2.3 轉(zhuǎn)化雨生紅球藻的鑒定

蛋白的表達是基因表達的最直接證據(jù),GFP或YFP可在488 nm激發(fā)光下發(fā)出綠色或黃色熒光。CaMV 35S調(diào)控的GFP在雨生紅球藻中能夠正確表達,如圖3所示。來源于番茄PDS啟動子能夠調(diào)控YFP基因在雨生紅球藻中表達,如圖4所示。

圖3 轉(zhuǎn)基因H.pluvialis中CaMV 35S啟動GFP基因表達

圖4 轉(zhuǎn)基因H.pluvialis中PDS啟動YFP基因表達

2.4 陽性克隆的比例

為鑒定發(fā)熒光雨生紅球藻的比例,應(yīng)用流式細胞技術(shù),以同期培養(yǎng)的野生紅球藻為對照，采用設(shè)門技術(shù)分析GFP或YFP比例，結(jié)果如圖5所示,由圖5可知,pBI121-35S-GFP轉(zhuǎn)化的球藻表達陽性克隆比例為5.93%,而pBI121-PDS-YFP轉(zhuǎn)化的球藻表達陽性克隆比例為7.16%。

圖5 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的雨生紅球藻陽性克隆比例

2.5 轉(zhuǎn)化子的穩(wěn)定性

通過連續(xù)繼代,定期進行激光共聚焦顯微觀察,連續(xù)觀察240 d,結(jié)果如圖6所示,雨生紅球藻依然能夠發(fā)出熒光,而且隨著篩選的進行,發(fā)熒光球藻的比例逐漸增加,如圖7所示。

圖6 不同轉(zhuǎn)化時期轉(zhuǎn)基因H.pluvialis表達YFP

圖7 H.pluvialis在轉(zhuǎn)化后240 d表達YFP熒光的細胞比例

2.6 陽性H.pluvialis對G418的耐受

將轉(zhuǎn)化pBI121-PDS-YFP雨生紅球藻分別接入含有0、100、200、500 μg/L,G418的BBM液體培養(yǎng)基中進行培養(yǎng),起始接種量為(0.3～1)×105個/mL,結(jié)果見表2所列,轉(zhuǎn)化的球藻能夠在G418質(zhì)量濃度為200 μg/L以下的BBM培養(yǎng)基中生長,隨著G418質(zhì)量濃度的增加,球藻生長受到抑制直至死亡。

表2 陽性H.pluvialis在含G418培養(yǎng)基中的生長速度

3 討 論

文獻[4]應(yīng)用農(nóng)桿菌侵染法成功地轉(zhuǎn)化了雨生紅球藻,經(jīng)過至少30個月的培養(yǎng),雨生紅球藻依然保持表達外源基因,所用的農(nóng)桿菌株為EHA101,質(zhì)粒為pCAMBIA1301,LB和RB序列之間含有3個表達框,2個報告基因GFP和GUS,另外一個是篩選基因Hpt Ⅱ,3個表達框的啟動子均為CaMV 35S。采用潮霉素為篩選標(biāo)記,結(jié)果表明轉(zhuǎn)化的陽性克隆可以耐受10 mg/L的潮霉素。

本研究采用農(nóng)桿菌株EHA105,質(zhì)粒pBI121為載體,所用表達質(zhì)粒LB和RB序列之間含有報告基因和NPTⅡ篩選基因2個表達框,分別用CaMV 35S和NOS啟動子或PDS啟動子啟動基因的表達。CaMV 35S源于花椰菜花葉病毒,是組成型啟動子,在植物各組織和各發(fā)育階段均能表達,該啟動子具有很強的啟動能力,主要應(yīng)用于雙子葉植物,單子葉植物也有一定的啟動能力。文獻[4]的研究結(jié)果證明了CaMV 35S能夠在雨生紅球藻種工作。

NOS啟動子是根癌農(nóng)桿菌Ti 質(zhì)粒T-DNA區(qū)域的胭脂堿合成酶基因啟動子,它具有與植物相似的共有序列,含有與TATA-盒同源的序列,位于5′端上游也有類似的CAT-盒的序列。將轉(zhuǎn)化的雨生紅球藻涂布含500 μg/L G418 Z8培養(yǎng)基上,以野生型雨生紅球藻為對照。結(jié)果表明轉(zhuǎn)化雨生紅球藻可以長出克隆,而野生型雨生紅球藻沒有克隆出現(xiàn),證明了NOS能夠啟動NPTⅡ基因的表達，表達了的NPTⅡ基因能夠降解G418。

番茄PDS啟動子是類胡蘿卜素合成過程中調(diào)控八氫番茄紅素轉(zhuǎn)化為番茄紅素和β-胡蘿卜素關(guān)鍵基因的表達。Vittorio Corona等構(gòu)建了PDS/GUS表達載體并轉(zhuǎn)化番茄和煙草瞬時表達,結(jié)果表明GUS主要在成色素細胞中表達,煙草花瓣和果實因缺少成色素細胞,GUS表達量較低。在番茄果實轉(zhuǎn)色期GUS基因的表達量增加了7～8倍。

在綠色組織中類胡蘿卜素和葉綠素是共調(diào)控的,抑制色素的合成會導(dǎo)致PDS啟動子啟動基因的表達,這表明PDS啟動子具有組織特異性和誘導(dǎo)性的特點。YFP的表達表明所克隆的番茄PDS啟動子能夠在雨生紅球藻中啟動基因表達,但是還需進一步確認番茄PDS啟動子在雨生紅球藻中是組成型表達還是誘導(dǎo)型表達。

合適的選擇標(biāo)記是篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)化子的關(guān)鍵。文獻[11]研究了包括G418和潮霉素在內(nèi)的10余種抗生素對雨生紅球藻的影響,結(jié)果表明雨生紅球藻對青霉素類的抗生素(氨芐青霉素、青霉素G)不敏感,與本實驗結(jié)果相類似(對羧卞青霉素不敏感),高達500 mg/L羧卞青霉素也不會影響雨生紅球藻的生長,200 mg/L的羧卞青霉素能夠抑制農(nóng)桿菌的生長,為提高抑制農(nóng)桿菌效果,羧卞青霉素和頭孢噻肟鈉可以聯(lián)合使用。但是G418對雨生紅球藻的影響2個研究結(jié)論完全相反,本實驗200 μg/L G418在BBM培養(yǎng)基、Z8培養(yǎng)基、TAP培養(yǎng)基均能抑制雨生紅球藻的生長,而文獻[11]的結(jié)果表明高達1 000 μg/mL G418或潮霉素等6種抗生素皆不敏感。文獻[4]以潮霉素為篩選標(biāo)記,建立了雨生紅球藻轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。這種差異可能是因為培養(yǎng)條件或其他因素所導(dǎo)致的,有待于進一步確認。

利用植物表達載體pBI121攜帶的新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 Ⅱ (NPTⅡ)篩選基因?qū)χ仓赀M行陽性鑒定[12]。NPTⅡ基因編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶,通過將ATP上的磷酸基團轉(zhuǎn)移到抗生素分子上而使抗生素失活,可以降解卡那霉素,卡那霉素和G418都是氨基糖苷類抗生素,分子結(jié)構(gòu)相似,抗菌譜有所差異?？剐詸C理相同,都是通過結(jié)合到核糖體亞基上影響蛋白質(zhì)合成而產(chǎn)生抗菌作用的。在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)(0～120 mg/L),雨生紅球藻對卡那霉素不敏感，但對G418比較敏感,200 μg/L就能夠完全抑制其生長。

激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果與流式細胞儀的結(jié)果可以相互印證,相互補充,前者可以給出直觀的觀察結(jié)果,后者能夠?qū)Y(jié)果進行定量。流式細胞儀結(jié)果表明,陽性克隆在平板上培養(yǎng)2周陽性克隆比例就能達到5%～7%。隨著篩選壓的提高，陽性克隆比例不斷增加至57%,這與哺乳動物基因工程篩選方式一致,但是雨生紅球藻可以通過鋪平板的方式挑取單克隆,獲得純培養(yǎng)。

4 結(jié) 論

本實驗通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)雨生紅球藻轉(zhuǎn)化外源基因,成功并穩(wěn)定地表達了報告基因GFP和YFP,拓寬了pBI121載體的應(yīng)用范圍,為雨生紅球藻的轉(zhuǎn)化開辟了一個新的遺傳轉(zhuǎn)化途徑。PDS啟動子來源于番茄果實,能夠啟動報告基因的表達,這表明植物源的啟動子也能夠在雨生紅球藻中表達,為植物源的啟動子驗證、基因瞬時表達提供了一個新的方法。

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(責(zé)任編輯 閆杏麗)

Establishment of transformation system ofAgrobacteriuminHaematococcuspluvialis

HOU Shanru, FENG Xingbiao, LI Guangwei, CHEN Danyang, YUAN Liuhuan, LIU Yongsheng

(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

TheAgrobacterium-mediated transformation method ofHaematococcuspluvialis(H.pluvialis) was established by using plant expression vector pBI121 andAgrobacteriumtumefaciensEHA105. The optimum concentration of G418 and carbenicillin was 200 μg/L and 500 mg/L, respectively, by screening for the effect of carbenicillin and G418 on algeH.pluvialisgrowth. Reporter geneGFPorYFPdriven by CaMV 35S or tomato PDS promoter, respectively, was successfully expressed inH.pluvialis, suggesting that the application of pBI121 vector was broadened, and thereby providing a new way for the genetic transformation ofH.pluvialis. Tomato-derived PDS promoter is able to activate reporter gene expression, indicating that botanical promoter can be expressed inH.pluvialis, which provides a new method for the verification of promoters from plants and transient gene expression.

Haematococcuspluvialis(H.pluvialis);Agrobacterium; genetic transformation; PDS promoter

2015-05-07；

2016-02-25

安徽省皖江禽產(chǎn)業(yè)研究院公共服務(wù)平臺資助項目(1401032006);國家大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃資助項目(201410359056)

侯善茹(1990-),男,安徽渦縣人,合肥工業(yè)大學(xué)碩士生;

劉永勝(1964-),男,重慶市人,博士,合肥工業(yè)大學(xué)教授,博士生導(dǎo)師.

10.3969/j.issn.1003-5060.2016.09.023

Q78

A

1003-5060(2016)09-1271-07