乳腺癌組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達(dá)及其臨床意義

張碩穩(wěn) 楊 微 王新樂 宋 姮 宋振川

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乳腺癌組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達(dá)及其臨床意義

張碩穩(wěn) 楊 微 王新樂 宋 姮 宋振川

目的 觀察乳腺癌組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達(dá)及與其臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。方法 分別采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法，對(duì)70例乳腺癌組織和癌旁組織行MTDH、IκB、NF-κB P65的mRNA及蛋白檢測(cè)，同時(shí)分析三者與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果 乳腺癌組織中MTDH、NF-κB P65 mRNA及蛋白表達(dá)水平均高于癌旁組織(P<0.05)，乳腺癌組織中IκB mRNA及蛋白表達(dá)水平低于癌旁組織(P<0.05)；MTDH、IκB、NF-κB P65的表達(dá)與乳腺癌的臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。結(jié)論 乳腺癌中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達(dá)可能參與了乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。

乳腺癌；MTDH；IκB；NF-κB；P65；實(shí)時(shí)熒光定量PCR；免疫組化

(ThePracticalJournalofCancer,2016,31:1578～1581)

乳腺癌(breast cancer)為當(dāng)今女性最常見的惡性腫瘤，約占惡性腫瘤總數(shù)的23%，占女性癌癥死亡人數(shù)的14%[1]。全世界每年約130萬新增乳腺癌患者，其中約46.5萬人死于乳腺癌。我國作為發(fā)展中國家，隨著人們生活水平的提高，飲食結(jié)構(gòu)改變以及生育模式的變更，乳腺癌的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升趨勢(shì)[2]。2014年Fan Lei[3]發(fā)表在Lancet Oncol 的調(diào)查顯示，中國每年乳腺癌的新增數(shù)量和死亡人數(shù)分別占世界的12.2%和9.6%。乳腺癌的發(fā)生是多種因素共同作用的結(jié)果，包括遺傳因素、生活方式以及多種原因?qū)е碌幕蜃儺?。近年來，隨著分子生物學(xué)研究的不斷發(fā)展和廣泛的應(yīng)用，對(duì)乳腺癌的發(fā)病機(jī)制有了更深層次的研究，諸多研究證實(shí)，MTDH，IκB，NF-κB P65均參與了乳腺癌的演變過程，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、治療及預(yù)后等多方面發(fā)揮著重要作用。

本實(shí)驗(yàn)通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)MTDH、IκB、NF-κB P65三者在乳腺癌組織及癌旁正常組織(距離癌灶>5 cm)中mRNA及蛋白質(zhì)含量，并結(jié)合患者臨床資料及病理學(xué)結(jié)果，進(jìn)一步探討三者與臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 臨床資料 選取2014年01月至2014年07月河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院乳腺中心原發(fā)性乳腺癌患者70例，均為女性，年齡31～80歲，中位年齡52歲。于手術(shù)切下標(biāo)本20 min內(nèi)用無菌手術(shù)刀片迅速切取乳腺癌組織及正常乳腺組織(距癌灶>5 cm)標(biāo)本，一式兩份，一份立即置于RNAfixer無液氮RNA樣品儲(chǔ)存液(4 ℃過夜后轉(zhuǎn)至-20 ℃冰箱儲(chǔ)存)，另一份置于10%福爾馬林液(-20 ℃冰箱儲(chǔ)存)中備用。切取標(biāo)本器械及無酶離心管均經(jīng)滅菌處理。統(tǒng)計(jì)分析時(shí)各個(gè)臨床病理生物學(xué)指標(biāo)分組情況如下：分為年齡≤50歲組和>50歲組；腫瘤直徑≤2 cm組和>2 cm組；乳腺癌臨床分期參照2010年出版的美國腫瘤聯(lián)合會(huì)(AJCC)乳腺癌分期法(第7版)，Ⅰ期25例，Ⅱ期35例，Ⅲ期10例；病理類型分為浸潤性癌和非浸潤性癌；ER判定標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2010年美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)和美國病理醫(yī)師學(xué)院(CAP)聯(lián)合制定并發(fā)布的乳腺癌激素受體免疫組化檢測(cè)指南，其規(guī)定≥1%的細(xì)胞核染色陽性即激素受體陽性；Her-2結(jié)果依據(jù)美國臨床腫瘤學(xué)會(huì)(ASCO)和美國病理醫(yī)師學(xué)院(CAP)制定的HER2檢測(cè)指南：Her-2陽性為IHC HER2 3+或FISH HER2基因擴(kuò)增；Ki-67表達(dá)分為<14%和≥14%[4]。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RNAiso Plus購于TaKaRa公司，ReverAid First Strand cDNA Synthesis購于Fermentas Inc，Real-Time PCR引物購于上海生工合成；YBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒購于TaKaRa公司，MTDH兔多抗購于北京中杉金橋生物公司，IkB 兔多抗及P65兔多抗購于Cell signaling Inc。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法 標(biāo)本總RNA的提取參照Trizol使用說明書進(jìn)行，反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA擴(kuò)增目的基因。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列如下：MTDH上游引物為5'-AAATAGCCAGCCTATCAAGACTC-3'，下游引物為5'-TTCAGACTTGGTCTGTGAAGGAG-3'；IκB上游引物為5'-TGAGGACCAGCAGTGTCTTG-3'，IκB 下游引物為5'-CATCGTTGATCACAAGTCGG-3'；NF-κB P65 上游引物為5'-ACAACCCCTTCCAAGTTCCT-3'，NF-κB P65下游引物為5'-TGGTCCCGTGAAATACACCT-3'。 以β-actin作為內(nèi)參基因，β-actin上游引物為5'-GCTACAGCTTCACCACCACAG-3'，下游引物為5'-GGTCTTTACGGATGTCAACGTC-3'。擴(kuò)增條件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 2 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)分析：用 2-△△Ct法分析所得 real-time PCR 數(shù)據(jù)，兩樣本之間的數(shù)據(jù)比較使用 Student's t test 進(jìn)行。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 標(biāo)本經(jīng)10%福爾馬林液固定，石蠟包埋，以 4 μm 為標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)切片，在切片漂烘溫控儀內(nèi)38 ℃將連續(xù)切片展開，用處理后的載玻片撈取切片，脫蠟，采用高溫高壓修復(fù)抗原，免疫組化染色按SP試劑盒說明書進(jìn)行。MTDH蛋白陽性表達(dá)為在胞質(zhì)中見棕黃色或棕褐色染色。按染色強(qiáng)度：無著色為0分，輕度著色1分，中度著色2分，重度著色3分。按陽性細(xì)胞率：無陽性細(xì)胞為0分，0～20%為1分，20%～50%為2分，50%～70%為3分，>70%為4分。在400倍視野下隨機(jī)選5個(gè)區(qū)域，免疫組化結(jié)果根據(jù)兩者乘積計(jì)分(每張切片可能出現(xiàn)的計(jì)分包括：0、1、2、3、4、6、8、9、12分)：<4分為低表達(dá)，≥ 4分為高表達(dá)[5]。IκB、NF-κB P65陽性染色為細(xì)胞核或(和)細(xì)胞質(zhì)中呈棕褐色。按染色強(qiáng)度：陰性為0分，淺黃色著色為1分，棕黃色著色為2分，棕褐色著色為3分。按陽性細(xì)胞數(shù)：無陽性細(xì)胞為0分，<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。免疫組化結(jié)果根據(jù)兩者乘積計(jì)分：0～3分為正常表達(dá)，>3分為過表達(dá)[6]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織和癌旁正常組織中MTDH、IκB、NF-κB P65 mRNA的表達(dá)情況

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，檢測(cè)MTDH、IκB、NF-κB P65在癌組織中的表達(dá)水平分別為30.78±1.66、31.37±1.55、31.35±1.90；MTDH、IκB、NF-κB P65在癌旁正常組織中的表達(dá)水平分別為29.62±1.95、32.82±1.66、30.55±1.92。癌組織中MTDH、NF-κB P65表達(dá)水平均高于癌旁正常組織，癌組織中IκB表達(dá)水平低于癌旁正常組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 乳腺癌組織和癌旁正常組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的蛋白表達(dá)水平

MTDH蛋白陽性表達(dá)為胞質(zhì)中見棕黃色或棕褐色染色。IκB、NF-κB P65陽性染色為細(xì)胞核和(或)細(xì)胞質(zhì)中呈棕褐色。采用免疫組織化學(xué)法，檢測(cè)MTDH、IκB、NF-κB P65在癌組織中高表達(dá)率分別為80.00%(56/70)、17.14%(12/70)、58.57%(41/70)；在癌旁正常組織中高表達(dá)率分別為24.28%(17/70)、35.71%(25/70)、22.85%(16/70)。癌組織中MTDH、NF-κB P65蛋白表達(dá)水平高于癌旁正常組織，癌組織中IκB蛋白表達(dá)水平低于癌旁正常組織，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 MTDH、IκB、NF-κB P65蛋白表達(dá)與其臨床病理因素的關(guān)系

MTDH、IκB、NF-κB P65表達(dá)與乳腺癌臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；與患者年齡、腫瘤大小、病理類型以及ER、Her-2、Ki-67無顯著相關(guān)性(P>0.05)(表1)。

表1 MTDH、IκB、NF-κB P65蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理指標(biāo)的關(guān)系/例

3 討論

MTDH基因定位于人類8號(hào)染色體上(8q22)[7]。異黏蛋白是MTDH編碼的產(chǎn)物，它是由582個(gè)氨基酸組成的單跨膜蛋白，分子量約為64kD，等電點(diǎn)9.33[8]，肽鏈中富含賴氨酸和絲氨酸，對(duì)核定位功能發(fā)揮了關(guān)鍵作用[9]。文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)， MTDH可通過介導(dǎo)活化血管內(nèi)皮生長因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞中微血管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及遷移，并可以抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，提高惡性腫瘤的侵襲力[10]。MTDH的表達(dá)在體內(nèi)通過多種信號(hào)傳導(dǎo)通路來促進(jìn)腫瘤形成，目前比較明確的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑包括：PI3K/AKT信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路以及MAPK and Wnt信號(hào)通路[11]。在以往研究中，Hu等[12]的研究結(jié)果顯示大約44%～47%的原發(fā)乳腺癌中MTDH基因大量表達(dá)，并與臨床分期，腫瘤大小，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，預(yù)后較差等顯著相關(guān)。Su等[13]通過免疫組化的方法分析了MTDH在乳腺增生組織與乳腺癌組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示癌組織的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于增生組織。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)MTDH在乳腺癌組織及癌旁正常組織中mRNA及蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)癌組織中MTDH的表達(dá)高于癌旁正常組織，且表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。從而提示MTDH表達(dá)的增高可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。

核轉(zhuǎn)錄因子是1類特殊的蛋白質(zhì)，可以與一些基因啟動(dòng)區(qū)中固定序列的核苷酸結(jié)合而啟動(dòng)基因轉(zhuǎn)錄功能。NF-κB作為重要的轉(zhuǎn)錄激活因子，存在于各種生物的真核細(xì)胞中,它參與炎癥反應(yīng)，同時(shí)也與腫瘤的形成有關(guān)[14]。IκB為NF-κB的抑制蛋白。NF-κB P65是NF-κB的1個(gè)亞單位，可直接作用于轉(zhuǎn)錄設(shè)備而激活基因轉(zhuǎn)錄，通常與P50形成二聚體而發(fā)揮廣泛的調(diào)節(jié)作用，它與細(xì)胞增殖及抗細(xì)胞凋亡有關(guān)，此外，在某些腫瘤生物行為比如組織侵襲與轉(zhuǎn)移方面也發(fā)揮著重要作用[15]。很多研究發(fā)現(xiàn)，IκB/NF-κB信號(hào)通路與多種癌癥的發(fā)生演變相關(guān)。Deepti等[16]對(duì)NF-κB P65與乳腺癌關(guān)系的研究證明NF-κB的異?；罨龠M(jìn)腫瘤惡性生長。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR及免疫組織化學(xué)法檢測(cè)IκB、NF-κB P65在乳腺癌組織及癌旁正常組織中mRNA及蛋白質(zhì)含量，發(fā)現(xiàn)癌組織中NF-κB P65表達(dá)水平高于癌旁正常組織，IκB表達(dá)水平低于癌旁正常組織，并且其表達(dá)與臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。從而提示NF-κB P65的表達(dá)增高和IκB的表達(dá)減低可能與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。IκB、NF-κB P65兩者在NF-κB/IκB信號(hào)通路中發(fā)揮了極其重要的作用。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過測(cè)定乳腺癌組織和癌旁正常組織中MTDH、IκB、NF-κB P65的表達(dá)量，分析三者的表達(dá)與臨床病理學(xué)指標(biāo)的相關(guān)性。證實(shí)了MTDH、IκB、NF-κB P65在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，為乳腺癌診治提供了重要的理論依據(jù)。

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(編輯：吳小紅)

Expression and Significance of MTDH，IκB，NF-κB P65 in Breast Cancer Tissues

ZHANGShuowen,YANGWei,WANGXinle,etal.

TheFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang,050000

Objective To observe the expression of MTDH,IκB,NF-κB P65 in the tissue of breast cancer and its correlation with clinical pathological indicators.Methods The expression of MTDH,IκB,NF-κB P65 of invasive breast cancer and peritumoral tissues were detected through real-time RT-PCR and immunohistochemical staining.Clinical and pathological significance of MTDH,IκB,NF-κB P65 were evaluated.Results The expression levels of MTDH,NF-κB P65 were higher in the breast cancer tissues than in peritumoral tissues (P<0.05).IκB expression level was lower in the breast cancer tissues than in peritumoral tissues (P<0.05).MTDH,IκB,NF-κB P65 expression were related to clinical TNM staging,and lymph node metastasis (P<0.05).Conclusion MTDH,IκB,NF-κB P65 expression may be related to breast cancer development.

Breast cancer;MTDH;IκB;NF-κB P65;Real-time RT-PCR;Immunohistochemistry

河北省自然科學(xué)基金(編號(hào)：H2012206169)

050000 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(張碩穩(wěn))；050000 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院(楊 微，王新樂，宋 姮，宋振川)

宋振川

10.3969/j.issn.1001-5930.2016.10.004

R737.9

A

1001-5930(2016)10-1578-04

2015-11-23

2016-05-19)