陸大壯， 劉娟娟， 戚孟春△， 溫黎明， 李 任， 孫 紅

(華北理工大學(xué) 1口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室, 2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室， 河北 唐山 063000)

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CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化不同階段表達(dá)規(guī)律的研究*

陸大壯1， 劉娟娟1， 戚孟春1△， 溫黎明1， 李 任1， 孫 紅2

(華北理工大學(xué)1口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科教研室,2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室， 河北 唐山 063000)

目的： 研究鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)δ在破骨細(xì)胞分化不同階段的表達(dá)規(guī)律，以揭示其在破骨細(xì)胞分化中的作用。方法: 應(yīng)用50 μg/L核因子κB受體激活因子配體(RANKL)誘導(dǎo)小鼠RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化；通過(guò)抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色及骨磨片吸收陷窩檢測(cè)評(píng)價(jià)破骨細(xì)胞生成情況；同時(shí)于誘導(dǎo)第0、1、3、5 天末通過(guò)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)、RT-qPCR和Western blot法檢測(cè)CaMKIIδ的mRNA及蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: TRAP染色及骨吸收陷窩檢測(cè)顯示于誘導(dǎo)第5 天有多核破骨細(xì)胞生成。第0、1、3、5天 CaMKIIδ的mRNA表達(dá)水平分別為 1.028±0.041、2.478±0.087、10.524±1.284和42.914±2.667，蛋白相對(duì)水平分別為0.762、0.963、1.802和3.136，免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)顯示CaMKIIδ的熒光6強(qiáng)度呈時(shí)間依賴性遞增。結(jié)論: CaMKIIδ的表達(dá)隨破骨細(xì)胞分化逐步增高，提示CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中可能起著關(guān)鍵調(diào)控作用。

鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶IIδ； 破骨細(xì)胞； 核因子κB受體激活因子配體； 抗酒石酸酸性磷酸酶

破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)是體內(nèi)唯一具有骨吸收功能的細(xì)胞，在骨質(zhì)疏松、Paget’s 病、多發(fā)性骨髓瘤、原發(fā)性/轉(zhuǎn)移性骨腫瘤、牙周炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等許多骨過(guò)度吸收性疾病中發(fā)揮重要作用[1-3]。對(duì)上述疾病治療的一個(gè)重要策略是抑制破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收；因而破骨細(xì)胞分化調(diào)控的研究顯得尤為重要。已知鈣離子/鈣調(diào)蛋白(Ca2+/calmodulin)信號(hào)通路對(duì)破骨細(xì)胞分化至關(guān)重要；而鈣離子/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II (Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II，CaMKII)是其中的關(guān)鍵信號(hào)分子[ 4-6]。CaMKII有α、β、γ和δ 四個(gè)異構(gòu)體[7]。國(guó)外學(xué)者及我們前期對(duì)研究均顯示，異構(gòu)體δ對(duì)破骨細(xì)胞分化的調(diào)控作用可能最為關(guān)鍵[8-9 ]，但其在破骨細(xì)胞分化中的表達(dá)規(guī)律及可能的信號(hào)調(diào)節(jié)機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化不同階段mRNA及蛋白的表達(dá)水平，以揭示其表達(dá)規(guī)律，為后期破骨細(xì)胞分化信號(hào)調(diào)控的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

核因子κB受體激活因子配體(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand, RANKL)購(gòu)自Biovision；小鼠RAW264.7細(xì)胞株(北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院)；α-MEM培養(yǎng)基、甲苯胺藍(lán)和胎牛血清(中國(guó)四季青公司)；兔抗鼠CaMKIIδ多克隆抗體(Santa Cruz)；抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphatase, TRAP)染色試劑盒和碘化丙啶(propi-dium iodide，PI)購(gòu)自Sigma；PCR引物(Invitrogen)。激光聚焦顯微鏡(Olympus)；PCR擴(kuò)增儀(PERKIN ELMER)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 破骨細(xì)胞的培養(yǎng) RAW264.7細(xì)胞傳代后在含有1×105U/L 青霉素、100 mg/L 鏈霉素和10%胎牛血清的完全培養(yǎng)基中37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)，每2 d換液。用終濃度為50 μg/L的RANKL進(jìn)行誘導(dǎo)，促使細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化；并于誘導(dǎo)前(第0 天)及誘導(dǎo)第1、3、5 天末收獲細(xì)胞，進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

2.2 TRAP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞的生成 將RAW264.7細(xì)胞按5×103/cm2接種于蓋玻片上，制備細(xì)胞爬片。待細(xì)胞貼壁24 h后用RANKL誘導(dǎo)，于第5 天末收獲細(xì)胞，2.5%多聚甲醛固定，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行染色。

2.3 骨吸收陷窩檢測(cè)破骨細(xì)胞的功能 用新鮮離體制備牙本質(zhì)磨片，直徑約5 mm,厚度0.4 mm，共10片，高溫高壓滅菌；細(xì)胞接種密度為1×107/L。細(xì)胞收獲后進(jìn)行掃描電鏡觀察，500倍下每個(gè)磨片上選取6個(gè)視野，測(cè)量吸收陷窩總數(shù)目及總面積，取平均值，作為該磨片的吸收陷窩數(shù)目及面積；每組檢測(cè)5個(gè)牙本質(zhì)磨片。

2.4 免疫熒光化學(xué)檢測(cè)CaMKIIδ的表達(dá) 同方法2.2在蓋玻片上接種細(xì)胞爬片。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后用2.5%多聚甲醛固定，兔抗鼠CaMKIIδ多克隆抗體4 ℃孵育過(guò)夜；II 抗為異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG，37 ℃雜交2 h， PI復(fù)染細(xì)胞核，封片；激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.5 RT-qPCR 檢測(cè)CaMKIIδ的mRNA表達(dá) TRI-zol提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA；在Rotor-Gene 3000熒光定量PCR儀上進(jìn)行變性、退火、延伸,引物見(jiàn)表1。反應(yīng)條件為95 ℃ 30 s;95 ℃ 15 s，55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。分析軟件Rotor-Gene處理后得到數(shù)據(jù)，計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

表1 RT-qPCR引物序列

F: forward; R: reverse.

2.6 Western blot法檢測(cè)CaMKIIδ蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，測(cè)定蛋白濃度。加入5×上樣緩沖液，煮沸變性，凝膠電泳并轉(zhuǎn)膜，5% BSA室溫封閉5 h，兔抗鼠 I 抗4 ℃孵育過(guò)夜； II 抗37 ℃孵育2 h，TBST洗3次，ECL顯色儀上顯色1 min。用ImageJ分析軟件檢測(cè)膜上每個(gè)條帶的灰度值；每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。多組間比較用單因素方差分析，各組均數(shù)間的兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TRAP染色及骨磨片吸收陷窩檢測(cè)

細(xì)胞經(jīng)TRAP染色，可見(jiàn)有許多體積較大的多核(≥3個(gè))破骨細(xì)胞形成。掃描電鏡觀察顯示，可見(jiàn)在牙本質(zhì)磨片上形成不同程度的吸收陷窩，邊界清晰，呈圓形、橢圓形及不規(guī)則形，見(jiàn)圖1。上述結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞在RANKL誘導(dǎo)下形成了有骨吸收功能的多核破骨細(xì)胞。

Figure 1. Detection of osteoclast formation by TRAP staining under light microscope (A), and dentin resorption lacunae by scanning electronic microscopy (B).

圖1 TRAP染色檢測(cè)破骨細(xì)胞生成及掃描電鏡檢測(cè)骨吸收陷窩

2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)

在誘導(dǎo)第0、1 天，細(xì)胞為單個(gè)核細(xì)胞，尚無(wú)多核破骨細(xì)胞形成，CaMKIIδ呈弱陽(yáng)性表達(dá)，熒光較弱；誘導(dǎo)第3、5 天，可觀察到多核破骨細(xì)胞形成，且細(xì)胞數(shù)目及體積逐漸增加；CaMKIIδ在第5 天的熒光強(qiáng)度明顯強(qiáng)于第3 天，見(jiàn)圖2。定量分析表明，CaMKIIδ熒光強(qiáng)度在第0、1、3、5 天分別為4.475±0.274、7.031±0.217、36.750±0.246和51.000±0.255，見(jiàn)圖3。該結(jié)果提示，CaMKIIδ蛋白的表達(dá)量隨破骨細(xì)胞分化持續(xù)增高。

Figure 2. Detection of CaMKIIδ expression during osteoclast differentiation by immunofluorescence cytochemistry (×200).

圖2 免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中的表達(dá)

3 RT-qPCR 檢測(cè)CaMKIIδ的mRNA水平

以第0 天 CaMKIIδ的mRNA相對(duì)表達(dá)量為參照，第1、3、5 天的mRNA相對(duì)表達(dá)量呈時(shí)間依賴性增高,見(jiàn)圖4。

4 Western blot法檢測(cè)CaMKIIδ的蛋白水平

CaMKIIδ蛋白水平在破骨細(xì)胞分化中隨時(shí)間亦呈遞增趨勢(shì)；其蛋白表達(dá)相對(duì)水平(與β-actin的比值)在第0、1、3、5 天分別為0.762、0.963、1.802和3.136，見(jiàn)圖5。

討 論

破骨細(xì)胞是多核巨細(xì)胞，來(lái)源于單核/巨噬細(xì)胞系前體細(xì)胞并通過(guò)單核前體細(xì)胞融合成多核巨細(xì)胞而成熟。骨組織正常的代謝基于破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡[4]，一旦這種平衡被打破，將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松、轉(zhuǎn)移性骨腫瘤、Paget’s病、類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎以及其它骨代謝疾病的發(fā)生。研究表明，在RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化中，NFATc1信號(hào)通路對(duì)破骨細(xì)胞分化及骨吸收功能發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用[3-5, 10]。

Figure 3. Quantitative analysis of CaMKIIδ expression during osteoclastogenesis by immunofluorescence cytochemistry. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 d;##P<0.01vs1 d;△△P<0.01vs3 d.

圖3 CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中蛋白表達(dá)的免疫熒光細(xì)胞化學(xué)定量分析

Figure 4. Quantitative analysis of the mRNA level of CaMKIIδ at different time points by RT-qPCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 d;##P<0.01vs1 d;△△P<0.01vs3 d.

圖4 RT-qPCR定量分析各時(shí)點(diǎn)CaMKIIδ的mRNA表達(dá)水平

研究發(fā)現(xiàn)，在Ca2+信號(hào)傳遞中，CaMKII與Ca2+/calmodulin 結(jié)合后，獲得2個(gè)特性[5]：(1)對(duì)calmodulin 的親和力提高1 000 倍，發(fā)生calmodulin 分子捕獲；(2) 在calmodulin 解離后，仍保持部分酶活性，在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)調(diào)節(jié)細(xì)胞功能，擁有分子記憶功能。因而，CaMKII對(duì)Ca2+信號(hào)傳遞及破骨細(xì)胞分化的調(diào)控可能極為關(guān)鍵。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)，Ca2+/calmodulin/NFATc1 是雙膦酸鹽抑制破骨細(xì)胞分化的重要信號(hào)通路；唑來(lái)膦酸可以時(shí)間依賴性抑制破骨細(xì)胞內(nèi)Ca2+振蕩，并下調(diào)CaMKII mRNA表達(dá)及蛋白活性[11]。

Figure 5. Detection of CaMKIIδ protein levels at different time points by Western blot. Mean±SD.n=3.*P<0.05vs0 d;#P<0.05vs1 d;△P<0.05vs3 d.

圖5 Western blot法檢測(cè)CaMKIIδ蛋白的表達(dá)

CaMKII有α、β、γ和δ 四個(gè)異構(gòu)體[7]， 其在大腦組織中大量表達(dá)并發(fā)揮重要功能[12-14]；而CaMKIIγ和δ也廣泛存在于非神經(jīng)的外圍組織中[15]。4個(gè)異構(gòu)體在破骨細(xì)胞分化中的表達(dá)水平及作用目前還知之甚少。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在破骨細(xì)胞分化第0～3 天，CaMKIIβ的mRNA表達(dá)較弱，但蛋白無(wú)表達(dá)；CaMKIIα則幾乎不表達(dá)，CaMKIIδ、γ均有表達(dá)；在多核化階段(分化第2～3 天)，CaMKIIα、β基本不表達(dá)；γ雖然表達(dá)，但mRNA及蛋白水平均較低且隨破骨細(xì)胞分化成熟而下降；CaMKIIδ的mRNA 及蛋白表達(dá)水平最高，并隨破骨細(xì)胞分化呈遞增趨勢(shì)[6]。Chang等[8]研究則表明，在破骨細(xì)胞分化初期，CaMKIIδ表達(dá)上升，其特異性siRNA可顯著抑制破骨細(xì)胞生成，提示CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用。Yao等[9]研究也表明，在CaMKII的4個(gè)異構(gòu)體中，只有CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中呈高水平表達(dá)，且mRNA的變化和蛋白相一致，因而認(rèn)為CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中可能起著關(guān)鍵調(diào)控作用。而Ang等[16]研究結(jié)果顯示在RAW264.7細(xì)胞和小鼠骨髓單核細(xì)胞均沒(méi)有檢測(cè)到CaMKIIδ的mRNA。

雖然國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì) CaMKIIδ 在破骨細(xì)胞分化中的作用開(kāi)展了研究，但大多數(shù)只局限到破骨細(xì)胞分化的某些階段，因而研究結(jié)論或是比較局限，或是相互矛盾[6, 8-9]。而這些問(wèn)題的解決將更好地弄清楚CaMKIIδ在破骨細(xì)胞分化中的調(diào)控機(jī)制以及有助于發(fā)現(xiàn)對(duì)骨過(guò)度吸收性疾病治療的有效方法。

由于骨髓單核細(xì)胞(bone marrow monocyte，BMM)向破骨細(xì)胞分化，大致經(jīng)歷前破骨細(xì)胞、單核破骨細(xì)胞、多核破骨細(xì)胞、成熟破骨細(xì)胞4個(gè)階段，分別對(duì)應(yīng)RANKL誘導(dǎo)的第0、1、2～3和5天，因此本實(shí)驗(yàn)的觀察時(shí)點(diǎn)設(shè)為0 d、1 d、3 d和5 d。RT-qPCR的檢測(cè)結(jié)果表明，CaMKIIδ的mRNA在破骨細(xì)胞形成不同階段均有表達(dá)，且呈持續(xù)性高表達(dá)；Western blot的檢測(cè)結(jié)果也表明，CaMKIIδ蛋白水平隨時(shí)間呈遞增趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)也表明，CaMKIIδ熒光強(qiáng)度隨破骨細(xì)胞分化逐漸增強(qiáng)，到第5天達(dá)到最高水平。因此推斷CaMKIIδ可能在破骨細(xì)胞分化及相關(guān)信號(hào)調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。開(kāi)展進(jìn)一步研究，以揭示CaMKIIδ對(duì)破骨細(xì)胞分化調(diào)控的分子機(jī)制，將有助于對(duì)破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨過(guò)度吸收性疾病發(fā)病機(jī)制的了解。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Expression profiles of CaMKIIδ at different stages of osteoclast differentiationLU Da-zhuang1, LIU Juan-juan1, QI Meng-chun1, WEN Li-ming1, LI Ren1, SUN Hong2

AIM: To study the expression profiles and the role of Ca2+/calmodulin-dependent kinase II delta (CaMKIIδ) during osteoclast differentiation. METHODS: Mouse RAW264.7 cells were induced by receptor activator of nuclear factor κB ligand (RANKL) at 50 μg/L for osteoclastogenesis. Tartrate-resistant acid phosphatase (TRAP) staining and bone resorption lacunae examination were performed to verify osteoclast formation. The expression of CaMKIIδ at mRNA and protein levels was also determined by immunofluorescent cytochemistry, RT-qPCR and Western blot at days 0, 1, 3 and 5. RESULTS: TRAP positive multinuclear cells with bone resorption function were formed after 5 d of induction. The mRNA levels of CaMKIIδ detected by RT-qPCR were 1.028±0.041, 2.478±0.087, 10.524±1.284 and 42.914±2.667 at days 0, 1, 3 and 5, respectively, while the protein levels of CaMKIIδ detected by Western blot were 0.762, 0.963, 1.802 and 3.136, respectively. The changes of protein level were also verified by immunofluorescence cytochemistry, in which the fluorescence intensity increased in a time-dependent manner (P<0.05). CONCLUSION: The expression of CaMKIIδ increases with the differentiation of osteoclasts. CaMKIIδ may play a key role in the osteoclastogenesis.

Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II delta; Osteoclasts; Receptor activator of nuclear factor κB ligand; Tartrate-resistant acid phosphatase

1000- 4718(2016)10- 1870- 05

2016- 04- 06

2016- 09- 09

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81270965)

△通訊作者 Tel: 0315-3721508； E-mail： qimengchun@163.com

R363

A

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(1DepartmentofOralandMaxillofacialSurgery,SchoolofStomatology，2DepartmentofPathology,CollegeofBasicMedicine,NorthChinaUniversityofScienceandTechnology,Tangshan063000,China.E-mail:qimengchun@163.com)