FRAS1蛋白與非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

秦 嶺， 葛蒙晰， 周鑫莉， 黃若凡， 詹 瓊， 季笑宇, 2， 趙月華, 2， 梁曉華△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院腫瘤科，上海 200040； 2復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032； 3蕪湖市第二人民醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000)

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·短篇論著·

FRAS1蛋白與非小細(xì)胞肺癌腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系*

秦 嶺1, 3， 葛蒙晰1， 周鑫莉1， 黃若凡1， 詹 瓊1， 季笑宇1, 2， 趙月華1, 2， 梁曉華1△

(1復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院腫瘤科，上海 200040；2復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院腫瘤學(xué)系，上海 200032；3蕪湖市第二人民醫(yī)院，安徽 蕪湖 241000)

目的： 探討FRAS1蛋白與非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系。方法: 采用qPCR檢測FRAS1的mRNA在NSCLC腦轉(zhuǎn)移組織和同期原發(fā)灶組織中的表達(dá)水平，采用SP免疫組化法檢測FRAS1蛋白在肺癌組織和癌旁非腫瘤組織的表達(dá)水平，以及有腦轉(zhuǎn)移和無腦轉(zhuǎn)移NSCLC原發(fā)灶組織中FRAS1蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果: FRAS1 mRNA 在肺癌腦轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)量是肺癌原發(fā)灶中的近10倍，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)；FRAS1蛋白在肺癌組織內(nèi)表達(dá)，但在癌旁非腫瘤組織內(nèi)未見表達(dá)；FRAS1 蛋白在有腦轉(zhuǎn)移NSCLC患者的肺癌組織中表達(dá)明顯高于無腦轉(zhuǎn)移NSCLC患者的肺癌組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)。結(jié)論: NSCLC組織中FRAS1蛋白表達(dá)可能與肺癌發(fā)生有關(guān)，同時(shí)肺癌組織中FRAS1蛋白高表達(dá)可能與肺癌腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

非小細(xì)胞肺癌； 腦轉(zhuǎn)移； 細(xì)胞外基質(zhì)； FRAS1

肺癌的發(fā)病率在男性和女性中均居于第1位，死亡率位居第2位[1]。肺癌死亡率高的主要原因是患者確診時(shí)多已處于腫瘤晚期，其中相當(dāng)一部分出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移[2]，并且常常缺乏有效的治療方法。許多腫瘤都可能出現(xiàn)腦轉(zhuǎn)移，然而將近2/3的成人腦轉(zhuǎn)移瘤患者系由肺癌、乳腺癌、惡性黑色素瘤轉(zhuǎn)移所致[3]。目前普遍認(rèn)為腫瘤轉(zhuǎn)移可能涉及多個(gè)步驟，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫落, 黏附于細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix， ECM)，逐步降解而后穿透ECM進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，逃避宿主免疫系統(tǒng)，進(jìn)入靶器官定植，形成新生血管并不斷增殖形成轉(zhuǎn)移灶。 Fraser syndrome 1 (FRAS1)蛋白是一種ECM蛋白，在表皮基底膜的黏附和器官發(fā)育過程中起著重要的調(diào)控作用，與 FREM1和FREM2同屬一個(gè)家族[4]。FRAS1蛋白由FRAS1基因編碼，基因定位于染色體4q21，它的突變可引起Fraser綜合征，主要表現(xiàn)在呼吸、循環(huán)、生殖、神經(jīng)系統(tǒng)等發(fā)育缺陷[5]。Xu等[6]研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌患者血清中存在FRAS1蛋白，而健康人的血清中不存在。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RAS1蛋白調(diào)控黏著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)信號，影響A459細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移。因此，F(xiàn)RAS1蛋白與肺癌腦轉(zhuǎn)移可能有一定關(guān)系[7]。本研究我們檢測肺癌和癌旁組織中FRAS1蛋白的表達(dá)水平，觀察非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell lung cancer，NSCLC)腦轉(zhuǎn)移灶組織和同期肺癌原發(fā)灶組織中FRAS1 mRNA表達(dá)，以及有腦轉(zhuǎn)移和無腦轉(zhuǎn)移NSCLC肺癌組織中FRAS1蛋白表達(dá)水平的差異，探討FRAS1蛋白與NSCLC腦轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對象

收集自2008年1月1日～2013年10月31日在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院因NSCLC手術(shù)切除的肺癌原發(fā)灶和/或腦轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本。用于分析FRAS1的mRNA的肺癌新鮮腫瘤組織標(biāo)本3例(男2例，女1例，年齡42～69歲，中位年齡59歲)，肺癌腦轉(zhuǎn)移灶新鮮腫瘤組織標(biāo)本11例(男7例，女4例，年齡40～69歲，中位年齡58歲)。用于分析NSCLC原發(fā)灶及其癌旁組織(取自所切除肺葉距離病灶>5 cm的組織)FRAS1蛋白表達(dá)的新鮮組織標(biāo)本12例(男5例，女7例，年齡40～68歲，中位年齡58歲)。用于分析有無腦轉(zhuǎn)移的肺癌組織FRAS1蛋白表達(dá)的組織標(biāo)本按1∶2分配，初診時(shí)頭顱增強(qiáng)磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)未見顱內(nèi)占位但原發(fā)灶確診NSCLC后3年內(nèi)頭顱增強(qiáng)MRI發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)占位者歸入腦轉(zhuǎn)移組(男19例，女11例，48～71歲，中位年齡58.5歲)；原發(fā)灶確診NSCLC 3年后頭顱增強(qiáng)MRI仍未發(fā)現(xiàn)顱內(nèi)占位者歸入無腦轉(zhuǎn)移組(男38例，女22例，41～70歲，中位年齡58歲)。以上標(biāo)本均經(jīng)病理確診為NSCLC或者NSCLC腦轉(zhuǎn)移，同時(shí)排除其它惡性腫瘤病史，術(shù)前均未接受任何放化療及靶向治療。腫瘤組織病理類型均為非小細(xì)胞肺癌，其中肺腺癌65例，肺鱗癌28例，肺腺鱗癌6例，肺其它類型(大細(xì)胞癌、未分化癌等)6例，腦轉(zhuǎn)移性腺癌8例，腦轉(zhuǎn)移性鱗癌3例，平均隨訪時(shí)間 4.2 年。上述的新鮮組織標(biāo)本為術(shù)后1 h內(nèi)獲得，獲得后立即放液氮中保存；同時(shí)石蠟標(biāo)本均在經(jīng)過4%的甲醛溶液固定后，常規(guī)石蠟包埋，所有標(biāo)本都經(jīng)過兩位高年資病理醫(yī)師分別單獨(dú)讀片及復(fù)核。

2 主要試劑及儀器

組織RNA提取試劑盒(上海華舜生物工程有限公司)；FRAS1和GAPDH引物(上海生工生物工程有限公司；序列詳見表1)；兔抗人 FRAS1 多克隆抗體(Abcam)；II 抗(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司)；SYBR Green 熒光定量PCR試劑盒(Life Technologies)。PCR儀(Bio-Rad)；7500 Real-Time PCR儀(ABI)。

表1 qPCR擴(kuò)增的引物序列

3 方法

3.1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)檢測 分別取肺癌組織和腦轉(zhuǎn)移瘤組織，按RNA提取試劑盒說明書進(jìn)行提取總RNA，使用紫外分光光度計(jì)檢測RNA樣品的A260/A280以確定RNA純度，并計(jì)算出RNA濃度，并于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?；參照RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。qPCR反應(yīng)用GAPDH作為內(nèi)參照，按照說明書加入SYBR 熒光染料、引物序列和模板cDNA在熒光定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)。qPCR反應(yīng)體系為ddH2O 6 μL、樣本模板cDNA 3 μL、熒光染料10 μL、上下引物各0.5 μL，配成20 μL 的體系。反應(yīng)參數(shù)為 94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s、54℃ 30 s、72 ℃ 1 min，共32個(gè)循環(huán)；72 ℃ 8 min。每個(gè)樣品3管重復(fù)。

3.2 免疫組織化學(xué)觀察與結(jié)果判斷 切片脫蠟置于濕盒中；用3%的過氧化氫去除過氧化物酶，靜置10 min，后用蒸餾水沖洗，置于pH 7.2堿性緩沖液中；微波高溫抗原修復(fù)10 min；隨后加入目的基因 I 抗4 ℃孵育過夜，再加入 II抗，再進(jìn)行DAB顯色；后用蘇木素復(fù)染；再脫水、透明，最后用中性樹脂封片后顯微鏡下觀察拍照。每張切片選擇具有代表性的5個(gè)高倍視野(×400)進(jìn)行觀察，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，并采用雙盲法對染色結(jié)果進(jìn)行評估。腫瘤細(xì)胞染色陽性比例≤5%為0分，陽性率5%～30%為1分，陽性率 30%～70%為 2 分，陽性率>70%為 3 分。染色強(qiáng)度：無染色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。腫瘤細(xì)胞染色陽性比例計(jì)分和染色強(qiáng)度計(jì)分之和作為評判免疫組化染色陽性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)；0～1 分為陰性(-)，2～3 分為弱陽性(+)，4～5 分為中度陽性(++)，6 分為強(qiáng)陽性(+++)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。FRAS1 mRNA表達(dá)的比較采用t檢驗(yàn)，F(xiàn)RAS1蛋白表達(dá)量的比較采用秩和檢驗(yàn)。以P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 FRAS1蛋白在NSCLC腫瘤組織和癌旁組織中的不同表達(dá)

免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RAS1蛋白在NSCLC腫瘤組織內(nèi)表達(dá)呈陽性，癌旁非腫瘤組織內(nèi)表達(dá)呈陰性，見圖1。

Figure 1.FRAS1 protein expression in the lung cancer tissue and tissue adjacent to carcinoma (×200). A: cytoplasmic protein expression in the tumor cells was positive, the arrow for lung cancer cells; B: FRAS1 protein expression was negative in the normal tissue adjacent to carcinoma.

圖1 FRAS1 蛋白在肺癌組織及癌旁組織中的表達(dá)

2 FRAS1 mRNA在NSCLC腦轉(zhuǎn)移瘤和原發(fā)灶組織中的表達(dá)

qPCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn), FRAS1 mRNA在NSCLC腦轉(zhuǎn)移樣本中的表達(dá)量約是肺癌樣本的10倍，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.05)，見圖2。

Figure 2.The mRNA expression of FRAS1 in the brain metastatic tumor tissues and the primary tumor zone of NSCLC. LA: the primary focal lung cancer samples (n=3); LTB: the lung cancer samples collected in brain metastatic zone (n=11). Mean±SD.*P<0.05vsLA group.

圖2 FRAS1 mRNA在肺癌腦轉(zhuǎn)移灶和原發(fā)灶組織中的表達(dá)情況

3 FRAS1蛋白在有腦轉(zhuǎn)移和無腦轉(zhuǎn)移的NSCLC腫瘤組織中的表達(dá)

免疫組織化學(xué)方法檢測結(jié)果表明，F(xiàn)RAS1蛋白在有腦轉(zhuǎn)移的NSCLC腫瘤組織組中表達(dá)明顯高于無腦轉(zhuǎn)移組，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P<0.01)，見圖3、表2。

Figure 3.The protein expression of FRAS1 in the NSCLC tissues (×200). A:-; B:+; C:++; D:+++. FRAS1 protein was mainly expressed in the cytoplasm of the tumor cells.

圖3 FRAS1蛋白在NSCLC患者肺癌組織中的表達(dá)

表2 FRAS1蛋白在有腦轉(zhuǎn)移和無腦轉(zhuǎn)移的NSCLC組織中的表達(dá)

Table 2.The protein expression of FRAS1 in the NSCLC tumor tissues with or without brain metastases

FRAS1proteinexpressionWithbrainmetastasesWithoutbrainmetastasesnConstituentratio(%)nConstituentratio(%)-13．6916．1+27．11017．9++828．62544．6+++1760．71221．4

討 論

顱內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤是成人最常見的顱內(nèi)腫瘤，其發(fā)生率是顱內(nèi)原發(fā)腫瘤的4～5倍[8]。腦轉(zhuǎn)移瘤的3大原發(fā)惡性腫瘤依次為肺癌(40%～50%)[9]、乳腺癌(20%～30%)[10]、惡性黑色素瘤(10%～40%)[11]。非小細(xì)胞肺癌約占肺癌的80%，首次就診時(shí)腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率約10%，在整個(gè)病程過程中腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生率為40%～50%[12]。腦轉(zhuǎn)移也是肺癌治療失敗的常見原因，且腦轉(zhuǎn)移患者的生活質(zhì)量和預(yù)后極差，即使經(jīng)過手術(shù)、放化療、分子靶向等治療，腦轉(zhuǎn)移患者生存時(shí)間仍不理想；因此尋找與肺癌腦轉(zhuǎn)移特異性相關(guān)的生物標(biāo)記物，在預(yù)測和治療肺癌腦轉(zhuǎn)移中顯得尤為重要。ECM作為腫瘤細(xì)胞生長的微環(huán)境，在腫瘤的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著“雙刃劍”作用。一方面，ECM可作為天然屏障，控制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；另一方面，重塑的ECM為腫瘤細(xì)胞創(chuàng)造適合生長的環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移[13]。各種腫瘤的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)[14]表明，腫瘤細(xì)胞在黏附分子或基質(zhì)成分誘導(dǎo)下激活或增強(qiáng)蛋白酶的活性，如金屬蛋白酶、尿纖溶酶原激活物、組織蛋白酶、類肝素酶等。這些蛋白酶能夠降解并重構(gòu)ECM，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞與ECM的黏附，促進(jìn)腫瘤新生血管形成，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。FRAS1蛋白作為一種調(diào)控基底膜形成的ECM蛋白，目前其功能研究主要見于Fraser綜合征和胚胎發(fā)育，在腫瘤中的作用僅限于其存在于子宮內(nèi)膜癌患者血清中。

本研究發(fā)現(xiàn)肺癌組織中FRAS1蛋白表達(dá)陽性，而癌旁非腫瘤組織未表達(dá)，因此我們推測FRAS1蛋白表達(dá)可能與肺癌的發(fā)生具有相關(guān)性；目前FRAS1蛋白在惡性腫瘤組織中表達(dá)的相關(guān)研究甚少；因此FRAS1蛋白與肺癌有何關(guān)聯(lián)有待進(jìn)一步研究。同時(shí)我們檢測FRAS1 的mRNA在腦轉(zhuǎn)移組織中的表達(dá)明顯高于肺癌原發(fā)灶組織；通過比較原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶中FRAS1的mRNA表達(dá)差異，我們推測FRAS1蛋白可能在肺癌發(fā)生腦轉(zhuǎn)移過程中起著積極作用；并且經(jīng)擴(kuò)大樣本在肺癌組織中驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)：有腦轉(zhuǎn)移的肺癌組織中FRAS1蛋白表達(dá)明顯高于無腦轉(zhuǎn)移組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，我們認(rèn)為肺癌組織中FRAS1蛋白高表達(dá)很可能與肺癌腦轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。我們課題組之前研究發(fā)現(xiàn)FRAS1蛋白通過調(diào)控FAK信號來調(diào)控A549細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移[7]；同時(shí)可能參與NF-κB和STAT3信號調(diào)控。并且體外實(shí)驗(yàn)[15]顯示NF-κB和 STAT3可引起FREM1表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲能力。這些可能只是FRAS1蛋白促進(jìn)肺癌腦轉(zhuǎn)移的部分機(jī)制。

其它很多因素可能也參與了肺癌腦轉(zhuǎn)移的發(fā)生，例如神經(jīng)-免疫調(diào)節(jié)因子在腦轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用；炎癥趨化因子可能定向引導(dǎo)腦轉(zhuǎn)移發(fā)生以及MMPs通過細(xì)胞外基質(zhì)與血管生成相互作用在腦轉(zhuǎn)移過程中起到一定作用等。肺癌腦轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制可能非常復(fù)雜，還需要我們開展更多深入的研究。

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(責(zé)任編輯： 陳妙玲， 羅 森)

Relationship between FRAS1 protein and brain metastases of NSCLC

QIN Ling1, 3, GE Meng-xi1, ZHOU Xin-li1, HUNAG Ruo-fan1, ZHAN Qiong1, JI Xiao-yu1, 2, ZHAO Yue-hua1, 2, LIANG Xiao-hua1

(1DepartmentofOncology,HuashanHospital,FudanUniversity,Shanghai200040,China;2DepartmentofOncology,ShanghaiMedicalCollege,FudanUniversity,Shanghai200032,China;3TheSecondPeople’sHospitalofWuhu,Wuhu241000,China.E-mail:xhliang66@sina.com)

AIM: To explore the relationship between FRAS1 protein and brain metastases of non-small cell lung cancer (NSCLC). METHODS: The mRNA expression of FRAS1 in the brain metastatic tumor tissues and primary tumor tissues of NSCLC was detected by qPCR. The protein expression of FRAS1 in the tumor tissues and normal tissues adjacent to tumor tissues of NSCLC was measured by SP method of immunohistochemistry. The protein expression of FRAS1 in NSCLC primary tumor tissues with or without brain metastases was also determined.RESULTS: The mRNA expression of FRAS1 in the brain metastatic zone was nearly 10 times higher than that in the primary tumor tissues, and there was significant difference between the 2 groups (P<0.05). FRAS1 protein was expressed in the NSCLC primary tumor tissues, but was not found in the normal tissues adjacent to primary tumor tissues. The protein expression of FRAS1 in the NSCLC with brain metastases was significantly higher than that without brain metastases (P<0.01). CONCLUSION: FRAS1 protein may be associated with the occurrence of NSCLC. The over-expression of FRAS1 protein may be related to brain metastases with NSCLC.

Non-small-cell lung cancer; Brain metastasis; Extracellular matrix; FRAS1

1000- 4718(2016)10- 1892- 04

2015- 12- 28

2016- 08- 22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81302010)；上海市科委自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 13ZR1405000)

△通訊作者 Tel： 021-52888142； E-mail： xhliang66@sina.com

R734.2； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.025

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