鄭 紅， 張文玲， 林 波， 張賽男， 劉瑞敏， 薛 鵬△

(河南大學(xué) 1醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室， 2淮河臨床學(xué)院口腔科， 3醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河南 開封 475004)

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miR-203在舌癌組織中的表達(dá)及其對Tca8113細(xì)胞活力和侵襲的影響*

鄭 紅1△， 張文玲2， 林 波1， 張賽男3， 劉瑞敏3， 薛 鵬3△

(河南大學(xué)1醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，2淮河臨床學(xué)院口腔科，3醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，河南 開封 475004)

目的： 研究舌癌組織中miR-203的表達(dá)，分析它與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性，并探討其與人舌癌Tca8113細(xì)胞活力及侵襲能力的關(guān)系。方法: 收集28例舌癌手術(shù)標(biāo)本，每例標(biāo)本分別取癌灶及遠(yuǎn)端5 cm處正常黏膜組織(即遠(yuǎn)癌正常組織)2個部分。實時定量 PCR檢測舌癌患者腫瘤組織中 miR-203的相對表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征之間的關(guān)系；脂質(zhì)體2000介導(dǎo) miR-203 mimic和無關(guān)序列對照轉(zhuǎn)染Tca8113細(xì)胞株，并通過CCK-8實驗和Transwell小室侵襲實驗檢測上調(diào)miR-203 對Tca8113細(xì)胞活力及侵襲能力的影響。結(jié)果: 28例舌癌組織中 miR-203 表達(dá)水平與癌旁正常組織相比顯著降低(P<0.05)，miR-203的表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.05)，而與患者的年齡和性別無關(guān)。Tca8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-203 mimics 上調(diào)miR-203表達(dá)可顯著抑制Tca8113細(xì)胞株的活力及侵襲能力，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。 結(jié)論: 上調(diào)miR-203表達(dá)能有效抑制舌癌細(xì)胞的生長和侵襲，miR-203可能成為舌癌基因治療的靶點。

miR-203； 舌癌； 細(xì)胞活力； 細(xì)胞侵襲

舌鱗狀細(xì)胞癌是頭頸部常見的惡性腫瘤，發(fā)病率居口腔癌的首位，因早期易發(fā)生局部浸潤和淋巴轉(zhuǎn)移的特點，預(yù)后較差，確診后五年生存率小于50%[1]。因此，研究舌癌的發(fā)病機制對于發(fā)現(xiàn)新的治療藥物和策略具有重要的意義。

微小RNA(microRNA，miRNA)是一種由19到24個核苷酸組成的非編碼單鏈基因表達(dá)調(diào)節(jié)物， miRNAs通過結(jié)合靶基因mRNA的3’末端在轉(zhuǎn)錄后翻譯水平發(fā)揮作用，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老等各種生理病理過程。自從上世紀(jì)九十年代調(diào)控線蟲發(fā)育的miRNA——lin-4和let-7的發(fā)現(xiàn)[2-3]， miRNAs在腫瘤生物學(xué)領(lǐng)域獲得了廣泛關(guān)注，這是因為miRNAs在惡性腫瘤中普遍失調(diào)，參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展。近年來研究表明，miRNAs在腫瘤的發(fā)生中既可作為致癌基因又可作為抑癌基因發(fā)揮作用，參與腫瘤細(xì)胞的發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡或者腫瘤微血管的形成[4-6]。

作為miRNAs家族中的一個成員，miR-203被發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中表達(dá)失調(diào)[7-8]，但在舌癌組織中的表達(dá)及其作用機制的研究少見報道。本文擬通過對28例舌鱗狀細(xì)胞癌中miR-203的檢測，分析它們與臨床病理學(xué)參數(shù)之間的相關(guān)性，探討其與舌癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。

材 料 和 方 法

1 研究對象及一般資料

28例舌癌組織標(biāo)本為2014年10月至2015年6月收集河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院和河南省腫瘤醫(yī)院舌癌手術(shù)標(biāo)本，其中男15例，女13例；年齡在39～72(56.4±3.7)歲之間。所有患者術(shù)前均無化療、放療及免疫治療史。標(biāo)本均在離體30 min內(nèi)迅速取材，分別取部分癌灶及癌旁正常黏膜組織, 液氮中保存，待后續(xù)real-time PCR檢測用。病理組織學(xué)證實28例舌癌均為鱗癌。該研究經(jīng)過河南大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

2 材料

2.1 細(xì)胞株 人舌癌細(xì)胞株Tca8113購自中科院上海細(xì)胞所。

2.2 引物 根據(jù)GenBank中miR-203序列，采用Oligo 6.0軟件設(shè)計引物(詳見表1)，由上海生物工程公司合成，PAGE純化。

表1 Real-time PCR引物

2.3 主要試劑 LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒 購于 Invitrogen； RNA 提取試劑盒購于 QIAGEN；dNTP、RNasin和AMV購于 Promega；real-time PCR 試劑盒購于TaKaRa；miR-203 模擬物(miR-203 mimics)和 miR-203 模擬物無關(guān)序列對照(scramble)購自Gene Pharma；CCK-8試劑盒為碧云天生物技術(shù)公司產(chǎn)品；Transwell培養(yǎng)板為Coining Costar產(chǎn)品；Matrigel購自BD。

3 方法

3.1 miR-203表達(dá)水平的檢測 RNA的提取參照Qiagen小量RNA提取試劑盒操作說明進(jìn)行。逆轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR 采用嵌合熒光檢測法，根據(jù)real-time PCR 試劑盒(TaKaRa)與擴(kuò)增儀(ABI5700)說明，用質(zhì)粒同時擴(kuò)增，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄各管擴(kuò)增Ct值。miR-203以U6作為內(nèi)參照, 記錄Ct值，每個樣本的Ct值取平均數(shù)，相對表達(dá)量以2-ΔΔCt表示，ΔΔCt=[Ct(癌組織miR-203)-Ct(癌組織U6)]-[Ct(癌旁正常組織miR-203)-Ct(癌旁正常組織U6)]。

3.2 細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 Tca8113細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)至對數(shù)生長期，轉(zhuǎn)種1×106(每孔)到6孔培養(yǎng)板，置37 ℃、5% CO2培箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度約為50%～70% 時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。實驗分為 miR-203 模擬物轉(zhuǎn)染組 (Tca8113-miR-203 mimics組)、模擬物陰性對照組(Tca8113-scramble組)和空白對照組(Tca8113-control組)。使用 Lipofectamine 2000在6孔培養(yǎng)板內(nèi)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，按照說明書的步驟進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。

3.3 CCK-8實驗檢測細(xì)胞活力 將處于對數(shù)生長期的Tca8113-miR-203 mimics、Tca8113-scramble和Tca8113-control細(xì)胞用0.25%的胰酶消化、清洗、吹打后，調(diào)整細(xì)胞濃度，按每孔1.0×103的密度將細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板上，每孔加含10% 胎牛血清的RPMI-1640 培養(yǎng)液0.1 mL, 每日換液1次，每6孔為1組，分別于接種后24 h、48 h、72 h依次將各組每孔加入CCK-8試劑10 μL，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定各孔的吸光度(A)值。取6孔平均值描繪細(xì)胞生長曲線。

3.4 細(xì)胞侵襲能力的檢測 實驗按照Boyden chamber assay 說明書進(jìn)行。孔徑8 μm的聚碳酯膜置于Boyden chamber小室的上下室之間Transwell板上；稀釋后的Matrigel加入Boyden chamber上室中，覆蓋整個聚碳酯膜，聚合成膠；Transwell培養(yǎng)板下室加入用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的3組Tca8113細(xì)胞上清200 μL作為趨化因子；400 μL 1×109/L細(xì)胞懸浮液加入到上室，5% CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)24 h；取出上室，用冰預(yù)冷的甲醇固定30 min，蘇木素染色 1 min；梯度乙醇脫水，二甲苯透明；切取聚碳酯膜，置于載玻片用樹脂封片；在高倍鏡下隨機計數(shù)6個視野的細(xì)胞數(shù)，取平均值。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

利用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用t檢驗和單因素方差分析比較組間的差異，相關(guān)性檢驗用Spearman相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Real-time PCR結(jié)果

與對應(yīng)癌旁正常組織相比，舌癌組織中miR-203表達(dá)明顯降低, 差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05)。結(jié)合臨床病理學(xué)參數(shù)分析，舌癌 miR-203的表達(dá)與TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者的年齡和性別無關(guān),見圖1、表2。

Figure 1.The relative fold change of miR-203 in tongue squamous carcinoma tissues compared with adjacent normal tissues.*P<0.05vsnormal.

圖1 舌癌組織中miR-203表達(dá)量較癌旁正常組織的相對倍數(shù)變化

表2 按臨床病理學(xué)參數(shù)分組觀察舌癌組織中miR-203相對表達(dá)量的差異

Table 2.The relative expression of miR-203 in tongue carcinoma tissues and the relationship with clinicopathological parameters in 28 tongue cancer cases (Mean±SD)

ParameternmiR?203PGenderMale170．260±0．0140．615Female110．269±0．123Age(year)<60130．363±0．0380．517≥60150．354±0．202TNMstageⅠandⅡ160．402±0．1350．001Ⅲ120．245±0．032LymphnodeNegative110．328±0．4210．007metastasisPositive170．205±0．057

Tca8113-miR-203 mimics組、Tca8113-scramble組和Tca8113-control組細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板(每組均設(shè)6個復(fù)孔)，培養(yǎng)24 h后，提取RNA，熒光定量PCR檢測出3組細(xì)胞miR-203相對表達(dá)量。Tca8113-miR-203 mimics組細(xì)胞miR-203表達(dá)明顯增強，而Tca8113-scramble組細(xì)胞與空白對照組細(xì)胞相比，miR-203表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，見表3。

2 上調(diào)miR-203的表達(dá)對舌癌細(xì)胞活力的影響

測定處于對數(shù)生長期的Tca8113-miR-203 mimics、Tca8113-scramble和Tca8113-control細(xì)胞0、24、48和72 h的A值，描繪細(xì)胞生長曲線。結(jié)果顯示Tca8113-miR-203-mimics細(xì)胞組在24 h、48 h和72 h測定的A值均明顯小于空白組及模擬物陰性對照組細(xì)胞(P<0.05)，說明上調(diào)miR-203的表達(dá)可顯著抑制舌癌細(xì)胞的活力,見圖2。

Figure 2.The effect of miR-203 mimics on the proliferation of tongue cancer cell line Tca8113.

圖2 上調(diào)miR-203表達(dá)對舌癌細(xì)胞株Tca8113細(xì)胞活力的影響

3 上調(diào)miR-203的表達(dá)對舌癌細(xì)胞侵襲能力的影響

Transwell小室細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果提示，與模擬物陰性對照組和空白組細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染miR-203 mimics的Tca8113細(xì)胞侵襲和穿透 Matrigel的能力明顯減弱, 差異有統(tǒng)計學(xué)顯著性(P<0.05),說明上調(diào)miR-203能導(dǎo)致舌癌細(xì)胞的侵襲能力降低，見圖3、表3。

Figure 3.The effect of miR-203 overexpression on the invasion ability of tongue cancer cell line Tca8113. A: Tca8113-miR-203 mimics; B: Tca8113-scramble; C: Tca8113-control.

圖3 miR-203過表達(dá)對舌癌細(xì)胞株Tca8113侵襲能力的影響

討 論

miR-203是miRNAs大家族的重要一員，定位于14q32.33，14號染色體上有一個約7 Mb大小的易丟失區(qū)，該區(qū)域是染色體上的不穩(wěn)定區(qū)域，目前發(fā)現(xiàn)包含miR-203在內(nèi)約12%的miRNA存在于該區(qū)域[9]。miR-203特異表達(dá)于上皮組織中，并且在不同組織來源的惡性腫瘤中表達(dá)水平存在明顯差異，可作為癌基因亦可作為抑癌基因，與其靶基因共同作用參與腫瘤細(xì)胞的增殖分化、侵襲轉(zhuǎn)移和凋亡等[7-8, 10-12]。

表3 各組細(xì)胞中miR-203的相對含量和Matrigel侵襲實驗結(jié)果

Table 3.The expression of miR-203 detected by real-time PCR and the result of Matrigel invasion assay in each group (Mean±SD.n=6)

TreatmentRelativeexpressionofmiR?203CellnumberTca8113?miR?203mimics1．164±0．007??24．6±8．1?Tca8113?scramble0．265±0．01649．7±7．9Tca8113?control0．258±0．04253．2±4．5

*P<0.05,**P<0.01vsTca8113-control.

研究發(fā)現(xiàn)miR-203在食管癌[10]、非小細(xì)胞肺癌[11]、肝癌[12]、骨肉瘤[13-14]等腫瘤中的表達(dá)明顯下調(diào)。食管鱗狀細(xì)胞癌 (esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)[10]中，miR-203表達(dá)與細(xì)胞增殖能力呈負(fù)相關(guān)。在對骨肉瘤的研究中，Liu等[13]發(fā)現(xiàn)miR-203表達(dá)下調(diào)，上調(diào)miR-203表達(dá)可通過負(fù)調(diào)控TBK1基因，降低細(xì)胞的體外生長，抑制體內(nèi)致瘤性。Yang等[14]有類似的發(fā)現(xiàn)，miR-203通過下調(diào)靶基因RAB22A抑制骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。還有研究報道m(xù)iR-203在肺小細(xì)胞癌中表達(dá)降低，通過靶向負(fù)調(diào)控Bmi1基因，影響腫瘤細(xì)胞的增殖[15]。

惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲與胚胎時期上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)過程相似，EMT可激活因子ZEB1，通過抑制miR-203的表達(dá)抑制腫瘤細(xì)胞分化[16]。Zhao等[17]利用慢病毒載體轉(zhuǎn)染卵巢癌SKOV3和OVCAR3細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)上調(diào)miR-203表達(dá)，抑制了癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移侵襲和EMT過程。Obayashi等[18]近期發(fā)現(xiàn)miR-203通過反向調(diào)控NUAK1基因表達(dá)，從而抑制頭頸部高侵襲性鱗癌細(xì)胞系的浸潤轉(zhuǎn)移和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

我們通過real-time PCR檢測28例舌癌組織標(biāo)本中miR-203的表達(dá)，舌癌組織中 miR-203 表達(dá)水平與癌旁正常組織相比顯著降低，miR-203的表達(dá)與腫瘤TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-203在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者腫瘤組織中的表達(dá)明顯低于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，TNMⅢ期的腫瘤中miR-203表達(dá)水平顯著低于TNMⅠ和Ⅱ期，提示miR-203表達(dá)降低預(yù)示預(yù)后不良， miR-203可能與舌癌的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。我們對體外生長的舌癌Tca8113細(xì)胞株進(jìn)行miR-203模擬物的轉(zhuǎn)染，促進(jìn)舌癌細(xì)胞miR-203的高表達(dá)，用無關(guān)序列轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染的Tca8113細(xì)胞作為對照，進(jìn)行細(xì)胞生長曲線的描記和Transwell小室細(xì)胞侵襲實驗，過表達(dá)miR-203后Tca8113細(xì)胞株的生長和侵襲能力受到明顯抑制。

綜上所述，miR-203在舌癌的發(fā)生發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用， miR-203有望成為舌癌診斷和進(jìn)展的分子標(biāo)志物。但miRNA對靶基因的調(diào)控是個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，一種miRNA可以調(diào)控多基因的表達(dá)，成熟的miRNAs可能源于各種基因組結(jié)構(gòu)域中的前體序列，表明miRNAs可以單獨作用于高度復(fù)雜的基因調(diào)節(jié)，而一個基因的表達(dá)也可以同時被多個miRNA影響[4]。因此，我們還需進(jìn)一步深入探討miR-203的作用機制，為舌癌的生物學(xué)防治提供新的思路和靶點。

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(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Expression of miR-203 in human tongue carcinoma tissues and its in-fluence on viability and invasion ability of Tca8113 cells

ZHENG Hong1, ZHANG Wen-ling2, LIN Bo1, ZHANG Sai-nan3, LIU Rui-min3, XUE Peng3

(1DepartmentofPathophysiology,MedicalCollege,2DepartmentofStomatology,HuaiheClinicalCollege,3DepartmentofImmunology,MedicalCollege,HenanUniversity,Kaifeng475004,China.E-mail:zhenghong8916@163.com;xuepeng1978@googlemail.com)

AIM: To study the expression of miR-203 in tongue carcinoma tissues and the effect of miR-203 over-expression on the viability and invasion ability of Tca8113 cells.METHODS: Twenty-eight pairs of tongue carcinoma tissues and adjacent nontumor tissues were collected, and the clinicopathological characters were analyzed. miR-203 was detected in the tongue tissues of 28 patients with tongue carcinoma by real-time PCR. miR-203 mimics and scramble were transfected into Tca8113 cells by Lipofectamine 2000. The expression of miR-203 was detected in Tca8113, Tca8113-miR-203 mimics and Tca8113-scramble cells by RT-qPCR. The cell viability was measured by CCK-8 assay. The cell invasion ability was determined by Transwell chamber invasion experiment.RESULTS: miR-203 expression was significantly down-regulated in the tongue carcinoma tissues compared with those in the adjacent nontumor tissues. The expression of miR-203 was associated with TNM stage and lymph node metastasis. Up-regulation of miR-203 inhibited the viability and invasion ability of Tca8113 cells.CONCLUSION: miR-203 suppresses the growth and invasion of tongue carcinoma cells. miR-203 may be a potential therapeutic target for treating human tongue cancer.

miR-203; Tongue carcinoma; Cell viability; Cell invasion

1000- 4718(2016)10- 1896- 05

2016- 05- 30

2016- 08- 17

開封市科技發(fā)展計劃項目(No. 1503112)；河南大學(xué)科研基金重點項目(No. 2010ZRZD02)

△通訊作者 鄭 紅 Tel: 0371-23880585; E-mail: zhenghong8916@163.com; 薛 鵬 Tel: 0371-23880398; E-mail: xuepeng1978@googlemail.com

R739.86； R730.23

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2016.10.026

雜志網(wǎng)址： http://www.cjpp.net