李　昂，闞紅玉，張　囡（.天津市兒童醫(yī)院，天津　30034；.天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，天津30093）

HPLC法同時(shí)測(cè)定疏表靈顆粒中綠原酸、橙皮苷、黃芩苷的含量

李昂1＊，闞紅玉2，張囡1（1.天津市兒童醫(yī)院，天津300134；2.天士力制藥集團(tuán)股份有限公司，天津300193）

目的：建立同時(shí)測(cè)定疏表靈顆粒中綠原酸、橙皮苷、黃芩苷含量的方法。方法：采用高效液相色譜法。色譜柱為SAGA Tri-Sal C18，流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸（梯度洗脫），流速為1.0 ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為10 μl。結(jié)果：綠原酸、橙皮苷、黃芩苷的檢測(cè)質(zhì)量濃度線性范圍分別為2.463～240.5 μg/ml（r=0.999 9）、6.577～642.3 μg/ml（r=0.999 8）、1.708～166.8 μg/ml（r=0.999 8）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤1.8%；加樣回收率分別為97.02%～102.40%（RSD=1.9%，n=6）、96.55%～100.20%（RSD=1.6%，n=6）、97.51%～100.70%（RSD=1.2%，n=6）。結(jié)論：該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于疏表靈顆粒中綠原酸、橙皮苷、黃芩苷含量的同時(shí)測(cè)定。

疏表靈顆粒；綠原酸；橙皮苷；黃芩苷；高效液相色譜法

疏表靈顆粒由淡豆豉、天花粉、陳皮、金銀花、玄參、白茅根、黃芩等20種藥味組成，具有散風(fēng)解表、解肌透疹、清熱解毒的作用，適用于小兒呼吸道感染、流感、麻疹、風(fēng)疹、幼兒急疹等，臨床應(yīng)用廣泛，療效顯著［1］。疏表靈顆粒為天津市兒童醫(yī)院的院內(nèi)制劑，其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)采用天津市衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)批準(zhǔn)的院內(nèi)制劑標(biāo)準(zhǔn)，標(biāo)準(zhǔn)中不包括含量測(cè)定項(xiàng)。為更有效地控制疏表靈顆粒的內(nèi)在質(zhì)量，本試驗(yàn)通過(guò)參考相關(guān)文獻(xiàn)［2-5］，選取綠原酸、橙皮苷、黃芩苷3種成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)，建立了同時(shí)測(cè)定3種成分含量的高效液相色譜法（HPLC），并進(jìn)行了方法學(xué)驗(yàn)證。

1　材料

1.1儀器

LC20A系統(tǒng)，包含紫外雙波長(zhǎng)檢測(cè)器、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、LC solution色譜工作站（日本島津公司）；AX205十萬(wàn)分之一天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；BP121S萬(wàn)分之一天平（德國(guó)塞多利斯公司）。

1.2藥品與試劑

疏表靈顆粒（天津市兒童醫(yī)院制劑室提供，批號(hào)：20150402、20150601）；綠原酸對(duì)照品（批號(hào)：110753-201314，純度：96.3%）、橙皮苷對(duì)照品（批號(hào)：110721-201115，純度：96.3%）、黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)：110715-201318，純度：93.3%）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、磷酸為色譜純，其余試劑為分析純，水為超純水。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件

色譜柱：SAGA Tri-Sal C18（150 mm×4.6 mm，3μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.5%磷酸，梯度洗脫（洗脫程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：320 nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1　梯度洗脫程序Tab 1　Gradient elution program

2.2溶液的制備

2.2.1混合對(duì)照品溶液分別稱(chēng)取綠原酸、橙皮苷、黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱(chēng)定，加50%甲醇稀釋溶解，制成每1 ml含綠原酸15.54 μg、橙皮苷41.44 μg、黃芩苷10.77 μg的混合對(duì)照品溶液。

2.2.2供試品溶液取疏表靈顆粒約1.0 g，精密稱(chēng)定，置于100 ml錐形瓶中，加50%甲醇50 ml，密塞，稱(chēng)定質(zhì)量，超聲處理（功率：120 W，頻率：40 kHz，下同）30 min，取出后放冷，加50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3陰性對(duì)照溶液以缺金銀花、陳皮、黃芩的原方，按樣品制備工藝進(jìn)行制備，得缺金銀花、陳皮、黃芩的陰性制劑。取陰性制劑1 g，按“2.2.2”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.3系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密量取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10 μl，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線分離，分離度＞1.5；理論板數(shù)以綠原酸、橙皮苷、黃芩苷峰計(jì)均＞4 000；保留時(shí)間分別為14.208 min、30.003 min、33.315 min。陰性對(duì)照色譜圖中綠原酸、橙皮苷、黃芩苷對(duì)應(yīng)的保留時(shí)間處無(wú)其他色譜峰出現(xiàn)，表明其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

圖1　高效液相色譜圖A.混合對(duì)照品；B.陰性對(duì)照；C.供試品；1.綠原酸；2.橙皮苷；3.黃芩苷Fig 1　HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.negative control；C.test sample；1.chlorogenic acid；2.hesperidin；3.baicalin

2.4線性關(guān)系考察

在這一點(diǎn)的探討上，筆者并不認(rèn)為應(yīng)放棄傳統(tǒng)技法學(xué)習(xí)，只是在教學(xué)時(shí)，應(yīng)更注重創(chuàng)作思維的培養(yǎng)，讓學(xué)生為了完成想法而去主動(dòng)學(xué)習(xí)技術(shù)，這樣遠(yuǎn)比被動(dòng)的技法訓(xùn)練，要有效而有意義得多。并且應(yīng)鼓勵(lì)學(xué)生大膽探索技法，不讓他們框定在傳統(tǒng)技術(shù)的語(yǔ)言、方式和材料的運(yùn)用上。西方當(dāng)代陶藝之所以發(fā)展迅速，也是因?yàn)樗麄冊(cè)趥鹘y(tǒng)技法的基礎(chǔ)上，尊重個(gè)體聲音，大膽探索實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

精密稱(chēng)取綠原酸、橙皮苷、黃芩苷對(duì)照品適量，置于100 ml量瓶中，加50%甲醇稀釋溶解，制成每1 ml含綠原酸242.8 μg/ml、橙皮苷647.5 μg/ml、黃芩苷168.3 μg/ml的混合對(duì)照品貯備液，再逐步稀釋制成綠原酸質(zhì)量濃度為240.5、96.20、38.48、15.39、6.157、2.463 μg/ml；橙皮苷質(zhì)量濃度為642.3、256.9、102.8、41.11、16.44、6.577 μg/ml；黃芩苷質(zhì)量濃度為166.8、66.72、26.69、10.68、4.270、1.708 μg/ml的系列對(duì)照品混合溶液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，回歸方程與線性范圍見(jiàn)表2。

表2　回歸方程與線性范圍Tab 2　Regression equations and linear ranges

2.5精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μl，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、橙皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.6%、1.5%、1.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱(chēng)取樣品（批號(hào)：20150601）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、9、12、16、20、24 h時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、橙皮苷、黃芩苷峰面積的RSD分別為1.5%、1.8%、1.5%（n= 9），表明供試品溶液在室溫放置24 h穩(wěn)定性良好。

2.7重復(fù)性試驗(yàn)

稱(chēng)取同一批樣品（批號(hào)：20150601）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，共6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，綠原酸、橙皮苷、黃芩苷的平均含量分別為0.748 8、1.957 9、0.433 9 mg/g，RSD分別為1.4%、1.2%、1.2%（n=6），表明本方法重復(fù)性較好。

2.8加樣回收率試驗(yàn)

取同批樣品6份（批號(hào)：20150601），每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，置于100 ml錐形瓶中，分別加入綠原酸質(zhì)量濃度為96.20 μg/ml、橙皮苷質(zhì)量濃度為256.9 μg/ml、黃芩苷質(zhì)量濃度為66.72 μg/ml的混合對(duì)照品溶液3.5 ml，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab 3　Results of recovery tests（n=6）

表4　樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=2，mg/g）Tab 4　Results of contents determination of sample（n=2，mg/g）

2.9樣品含量測(cè)定

取樣品（批號(hào)：20150402、20150601）約1.0 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積并計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

3　討論

3.1色譜條件的選擇

3.1.1流動(dòng)相考察參考2015版《中國(guó)藥典》收載的金銀花、陳皮、黃芩藥材的流動(dòng)相條件［6］，本試驗(yàn)考察了流動(dòng)相為甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-水及乙腈-磷酸溶液4種系統(tǒng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在乙腈-磷酸溶液系統(tǒng)下，出峰最快。在此基礎(chǔ)上，筆者又進(jìn)一步考察了乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸及乙腈-1%磷酸的色譜效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在乙腈-0.5%磷酸條件下，色譜峰峰形最好。由此，確定本試驗(yàn)流動(dòng)相為乙腈-0.5%磷酸。同時(shí)，筆者還對(duì)流動(dòng)相的梯度洗脫比例進(jìn)行了系統(tǒng)的考察優(yōu)化，保證了綠原酸、橙皮苷、黃芩苷的分離度。

3.1.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇參考2015年版《中國(guó)藥典》收載的金銀花、陳皮、黃芩藥材的檢測(cè)波長(zhǎng)［6］，并參照相關(guān)文獻(xiàn)［7-9］，本試驗(yàn)最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為320 nm。

3.1.3色譜柱選擇筆者比較了Agilent-ZORBAX C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）與SAGA Tri-Sal C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）色譜柱的分離行為，在保證綠原酸、橙皮苷、黃芩苷分離度的基礎(chǔ)上，后者出峰更快、時(shí)間更短。因此，最終選擇SAGA Tri-Sal C18（4.6 mm×150 mm，3μm）為色譜柱。

3.2樣品處理方法的選擇

筆者比較了加熱回流和超聲處理兩種方法。結(jié)果顯示，超聲法的提取效果與加熱回流法相當(dāng)，由于超聲處理的操作更簡(jiǎn)單，因此本試驗(yàn)最終采用超聲法處理樣品。此外，筆者還對(duì)超聲溶劑甲醇的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（100%、70%、50%、30%）、溶劑用量（30 ml、50 ml、100 ml）以及超聲時(shí)間（20 min、30 min、40 min）的提取效果進(jìn)行了考察，最終確定采用50 ml 50%甲醇、超聲提取30 min的樣品處理?xiàng)l件。

綜上所述，本方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏度高、重復(fù)性好，可用于疏表靈顆粒中綠原酸、橙皮苷、黃芩苷的含量測(cè)定。

［1］劉麗，蔣志宏，褚婕.清降丸和疏表靈的體外抗菌活性試驗(yàn)［J］.職業(yè)與健康，2004，20（11）：135.

［2］姚帥，楊躍華，劉巖，等.RP-HPLC同時(shí)測(cè)定大衛(wèi)顆粒中綠原酸、黃芩苷、連翹苷、黃芩素和漢黃芩素的含量［J］.藥物分析雜志，2012，32（7）：1 253.

［3］張囡，錢(qián)宇坤，李維超.病毒合劑（Ⅱ）中黃芩苷、綠原酸和橙皮苷的含量測(cè)定［J］.天津藥學(xué)，2015，3：13.

［4］史宏妍，潘成學(xué).HPLC法同時(shí)測(cè)定小兒熱速清顆粒中綠原酸和黃芩苷的含量［J］.中國(guó)藥房，2012，23（16）：1 531.

［5］陳國(guó)寶，宋桂萍，楊棄塵.HPLC法同時(shí)測(cè)定雙黃連片中黃芩苷、綠原酸、連翹苷、連翹酯苷的含量［J］.中國(guó)藥房，2011，22（48）：4 594.

［6］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部［S］.2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：233.

［7］錢(qián)星文，何雁，羅曉健，等.高效液相色譜法測(cè)定藿香正氣制劑中橙皮苷的含量［J］.江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，17（3）：38.

［8］楊宏靜，方應(yīng)權(quán).高效液相色譜法測(cè)定五味消毒飲中綠原酸含量［J］.現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生，2014，30（1）：21.

［9］李運(yùn)景，陳鈞茂，張錦興，等.HPLC測(cè)定清肺合劑中黃芩苷的含量［J］.藥品評(píng)價(jià)，2007，4（4）：313.

（編輯：申琳琳）

Simultaneous Determination of ChlorogenicAcid，Hesperidin and Baicalin in Shubiaoling Granule by HPLC

LI Ang1，KAN Hongyu2，ZHANG Nan1（1.Tianjin Children's Hospital，Tianjin 300134，China；2.Tasly Parmaceutical Group Co.，Ltd.，Tianjin 300193，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the simultaneous determination of chlorogenic acid，hesperidin and baicalin in Shubiaoling granule.METHODS：HPLC was performed on the column of SAGA Tri-Sal C18with mobile phase of acetonitrile-0.5% phosphoric acid（gradient elution）at a flow rate of 1.0 ml/min，detection wavelength was 320 nm，column temperature was 30℃，injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 2.463-240.5 μg/ml for chlorogenic acid（r=0.999 9），6.577-642.3 μg/ml for hesperidin（r=0.999 8）and 1.708-166.8 μg/ml for baicalin（r=0.999 8）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were no more than 1.8%；recoveries were 97.02%-102.40%（RSD=1.9%，n=6），96.55%-100.20%（RSD=1.6%，n=6）and 97.51%-100.70%（RSD=1.2%，n=6），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple，accurate with high sensitivity and good reprosucibility，and can be used for the simultaneous determination of chlorogenic acid，hesperidin and baicalin in Shubiaoling granule.

Shubiaoling granule；Chlorogenic acid；Hesperidin；Baicalin；HPLC

R917

A

1001-0408（2016）27-3872-03

10.6039/j.issn.1001-0408.2016.27.43

＊主管藥師，碩士。研究方向：藥物制劑。電話：022-87199759。E-mail：andyli100@sina.com

（2015-09-12

2016-08-04）