王鵬 張劍寧 陳金輝 于新 趙虎林 孫艷杰

(海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100037)

·論著·

Survivin對體外培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細胞U251替莫唑胺敏感性的影響

王鵬 張劍寧*陳金輝 于新 趙虎林 孫艷杰

(海軍總醫(yī)院神經(jīng)外科，北京 100037)

目的探討Survivin對體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤細胞(U251)替莫唑胺化療敏感性的影響。方法將人腦膠質(zhì)瘤細胞U251中Survivin的表達上調(diào)或者抑制后，經(jīng)替莫唑胺處理。采用四甲基偶氮唑藍(MTT)比色法，平板克隆形成試驗評價各組細胞增殖能力，流式細胞儀檢測細胞凋亡，蛋白免疫印跡法檢測各組細胞激活caspase-3的表達情況。結(jié)果替莫唑胺處理后，與親代細胞相比，下調(diào)Survivin的表達，細胞的生長抑制效果增強，凋亡率增加，激活的caspase-3蛋白表達增多；上調(diào)Survivin的表達，細胞生長抑制作用減弱，凋亡率減少，激活的caspase-3蛋白表達下降。結(jié)論Survivin可通過抑制凋亡，影響膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。

膠質(zhì)瘤; 細胞凋亡; 替莫唑胺; 存活素

膠質(zhì)母細胞瘤占膠質(zhì)瘤的50%以上，并且是致死性最高的惡性腫瘤之一[1]。在美國每年大約有10 000人診斷為膠質(zhì)母細胞瘤；經(jīng)過手術(shù)、放療、化療等綜合治療后，患者的中位生存時間為14.6月[2]。與其他腫瘤相比，膠質(zhì)瘤的治療進展相對滯后，除了將替莫唑胺(temozolomide,TMZ)引入到膠質(zhì)瘤的治療之外，臨床上目前暫無其他可以提高膠質(zhì)瘤治療效果的方法。替莫唑胺是一種口服的烷化劑，通過干擾腫瘤細胞DNA的復制并導致腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞增殖，進而提高患者的存活時間[3,4]。替莫唑胺作為膠質(zhì)母細胞瘤治療的一線用藥應用廣泛，但是替莫唑胺耐藥性的產(chǎn)生降低了其在臨床上的治療效果[5]，因此亟需研究替莫唑胺耐藥的相關(guān)機制并加以干預，提高膠質(zhì)母細胞瘤的治療效果。

雖然化療藥物導致腫瘤細胞死亡有多種方式，諸如壞死、有絲分裂破壞、自噬等，但是誘導凋亡仍是化療藥物導致腫瘤細胞死亡的主要方式[6,7]。Survivin在腫瘤細胞的凋亡中發(fā)揮重要作用，因此本實驗擬觀察Survivin對替莫唑胺誘導膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響，分析Survivin對膠質(zhì)瘤細胞替莫唑胺敏感性的影響。

材料與方法

一、材料

U251膠質(zhì)母細胞瘤細胞，Survivin的表達質(zhì)粒和干擾質(zhì)粒均由第四軍醫(yī)大學西京腦科醫(yī)院章翔教授惠贈。改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's modified Eagle's medium,DMEM)購自Hyclone公司，胎牛血清購自Gibco公司，兔抗人Caspase-3單克隆抗體、山羊抗兔IgG辣根過氧化物酶標記購自Cell Signaling公司，兔抗人甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)抗體購自北京博奧森公司，TMZ購自天士力公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)：替莫唑胺10 mg用250 μl二甲亞砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)溶解，經(jīng)DMEM培養(yǎng)基稀釋(DMSO濃度不超過0.5%)，配制成替莫唑胺濃度為1 000 μmol/L的母液；人膠質(zhì)母細胞瘤系U251細胞用含10 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、含5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。

2.穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系的建立：將U251細胞分別轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(空載體)，pcDNA3.1-Survivin(Survivin的表達載體)，采用G418篩選，構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞命名為：U251/PCtrl-1，U251/Sur。將U251細胞分別轉(zhuǎn)染pRNAT(空載體)、pRNAT-SurvivinshRNA[針對Survivin基因的短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA，shRNA)真核表達載體]、pRNAT- NS si[無關(guān)序列(nonsense sequence，NS)載體]，采用G418篩選，構(gòu)建的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系命名為：U251/PCtrl-2，U251/Sur si和U251/NS si。

3.四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolylterrazaium,MTT)法測定細胞生長曲線：將處于對數(shù)生長期的U251、U251/PCtrl-1、U251/PCtrl-2、U251/Sur、U251/Sur si、U251/NS si細胞，以每孔接種1×104個細胞的濃度，接種至24孔板，每孔加 1 ml DMEM，每組細胞接種9孔，1 d后(細胞貼壁)分別加替莫唑胺，使TMZ的濃度為100 μmol/L。在接種的第2天、第4天、第6天，每組細胞各取3孔計數(shù)，以MTT法，測定各組的光密度值，繪制細胞生長曲線。

4.平板克隆形成實驗：分別取處于對數(shù)生長期的U251、U251/PCtrl-1、U251/PCtrl-2、U251/Sur、U251/Sur si、U251/NS si細胞，以每個培養(yǎng)皿接種200個細胞的濃度，將上述細胞接種至60 mm的培養(yǎng)皿中，加入10 ml的 DMEM。1 d后(細胞貼壁)分別加替莫唑胺，使TMZ的濃度為100 μmol/L。10 d后，棄去上清，以磷酸鹽緩沖溶液(phosphate buffer saline,PBS)輕柔洗滌后，以5 ml純甲醇固定細胞，之后棄去固定液，以姬姆薩應用液染色，用自來水洗去染色液，將培養(yǎng)皿放置在空氣中干燥后，用肉眼計數(shù)細胞的克隆數(shù)?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/200×100%。

5.流式細胞術(shù)(flow cytometry,FCM)檢測細胞凋亡：將處于對數(shù)生長期的U251、U251/PCtrl-1、U251/PCtrl-2、U251/Sur、U251/Sur si、U251/NS si細胞接種于100 ml培養(yǎng)瓶中，1 d后(細胞貼壁)分別加替莫唑胺，使TMZ的濃度為100 μmol/L，細胞接種5 d后(加入TMZ 4 d后)，收集細胞，用流式細胞儀檢測細胞的凋亡水平。

6.蛋白質(zhì)免疫印跡檢測Caspase-3表達：各組細胞經(jīng)替莫唑胺處理后，裂解細胞提取蛋白，并行蛋白定量。將蛋白電泳后轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜上，洗膜后加入膜封閉液室溫封閉1 h，加入稀釋的兔抗人Caspase-3單克隆抗體，4℃冰箱過夜，漂洗后加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，漂洗后電化學發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)曝光定影。

7.統(tǒng)計學分析：采用SPSS 14.0進行統(tǒng)計學分析，用均數(shù)±標準差的形式表示細胞計數(shù)、細胞克隆計數(shù)、凋亡率；采用方差分析比較各組細胞的細胞均數(shù)、細胞克隆形成率、凋亡率，組間均數(shù)的比較用q檢驗。Plt;0.05定為有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系中Survivin的表達情況

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染干擾載體的U251/ Sursi細胞中Survivin表達明顯抑制，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Survivin的U251/Sur細胞中Survivin呈高表達。

二、不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的生長曲線

經(jīng)替莫唑胺處理后，與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/ Sur si細胞生長降低(Plt;0.01,圖1)；經(jīng)替莫唑胺處理后，與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/ Sur細胞生長抑制減弱(Plt;0.01,圖1)。

三、細胞克隆計數(shù)

經(jīng)替莫唑胺處理后，與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/ Sur si細胞克隆數(shù)減少 (Plt;0.01,圖2)；經(jīng)替莫唑胺處理后，與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/ Sur細胞克隆數(shù)增多(Plt;0.01,圖2)。

四、不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的凋亡情況

經(jīng)替莫唑胺處理后，與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/Sur si細胞凋亡增多(Plt;0.01,圖3)；與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/ Sur細胞凋亡減少(Plt;0.01,圖3)。

圖1 不同穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞的生長曲線
Fig 1 Growth curve of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,TMZ+SursivsTMZ;bPlt;0.01,TMZ+SurvsTMZ.

圖2 各組細胞克隆形成率
Fig 2 Cell surviving fraction of U251 cells in different groups

aPlt;0.01,TMZ+SursivsTMZ;bPlt;0.01,TMZ+SurvsTMZ.

圖3 各組細胞凋亡水平
Fig 3 Apoptosis of U251 cells by flowcytometry

aPlt;0.01,TMZ+SursivsTMZ;bPlt;0.01,TMZ+SurvsTMZ.

五、Western blot檢測Caspase-3表達結(jié)果

Western blot分析結(jié)果：經(jīng)替莫唑胺處理后，與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/Sur si中Caspase-3蛋白表達增加(圖4)；與親代U251(U251/Ctrl)細胞相比，U251/Sur中Caspase-3表達降低(圖4)。

圖4 各組細胞Caspase-3表達水平
Fig 4 Expression of Caspase-3 protein in each group by Western blot

討 論

膠質(zhì)母細胞瘤是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤，經(jīng)過正規(guī)的手術(shù)、放療及化療，超過90%的患者在2年內(nèi)死亡。TMZ是第二代烷化劑，作為膠質(zhì)母細胞瘤化療的一線用藥，目前廣泛使用。對于新診斷的膠質(zhì)母細胞瘤患者而言，與手術(shù)聯(lián)合應用，或者與手術(shù)及放療聯(lián)合應用，可以極大提高患者的存活時間。但是在替莫唑胺的治療過程中腫瘤細胞可逐步產(chǎn)生耐藥性，即使初始治療時對替莫唑胺反應良好的患者，腫瘤細胞仍可逐步獲得耐藥性[8～10]。因此研究膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺耐藥的機制并加以干預，有望提高膠質(zhì)母細胞瘤患者的治療效果。

研究表明誘導凋亡是化療藥物殺滅腫瘤細胞的重要機制，化療藥物通過損傷DNA，進而誘發(fā)凋亡導致細胞死亡[11]，因此研究凋亡通路上的相關(guān)分子及作用，有望提高膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性[12]。以往的研究表明，促進細胞凋亡可以增加膠質(zhì)母細胞瘤對替莫唑胺的敏感性[13]。抑制抗凋亡的Bcl-2功能，可促進細胞死亡，在一項Ⅰ期臨床試驗中，將Bcl-2的抑制劑AT-101與替莫唑胺聯(lián)合應用治療膠質(zhì)瘤，患者的中位生存時間達到18.2個月[14]。

Survivin在細胞凋亡中發(fā)揮重要作用，且與腫瘤發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，并且其在正常腦組織中不表達或低表達，而在膠質(zhì)瘤組織中高表達，隨著膠質(zhì)瘤級別的增高，Survivin的表達也隨之增高，上述特點均提示Survivin非常適合做為膠質(zhì)瘤靶向治療的靶點[15]。本研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中Survivin的表達，可使替莫唑胺誘導的膠質(zhì)瘤細胞的凋亡增加，上調(diào)膠質(zhì)瘤細胞中Survivin的表達，可使替莫唑胺誘導的膠質(zhì)瘤細胞凋亡減少，提示Survivin可通過影響細胞凋亡，進而影響膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺的敏感性。目前Survivin的抑制劑已經(jīng)進入Ⅰ期臨床試驗，隨著Survivin抑制方案的逐步成熟，有望最終提高膠質(zhì)瘤患者的治療效果，延長患者的生存時間。

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EffectsofSurvivinontemozolomidechemosensitivityofU251gliomacellsinvitro

WANGPeng,ZHANGJianning,CHENJinhui,YUXin,ZHAOHulin,SUNYanjie

DepartmentofNeurosurgery,NavyGeneralHospital,Beijing100037,China

ObjectiveThe effect of Survivin on temozolomide (TMZ) resistance of U251 glioma cells is discussed.MethodsThe Survivin RNA plasmids or the specific shRNA vector targeting Survivin was transfected into U251 cells,respectively. The cellular growth activity was assayed by methyl thiazolyltetrazolium(MTT). Cell surviving fraction was calculated by colony forming assay. The apoptosis was assayed by the Annexin V assay by flow cytometer (FCM). The expression of activated caspase-3 was detected by western blot.ResultsAfter treated with TMZ,compared with parent cells,cell proliferation was inhibited significantly,apoptosis rate was increased,and the expression of activated caspase-3 protein was promoted in down-regulation Survivin group; while in up-regulation Survivin group,cell proliferation was promoted,apoptosis rate was decreased,and the expression of activated caspase-3 protein was declined.ConclusionSurvivin can suppress TMZ sensitivity of glioma cells by inhibiting the apoptosis in vitro.

Glioma; Apoptosis; Temozolomide; Survivin

1671-2897(2016)15-317-04

R 739.41

A

王鵬，博士，E-mail:986257010@qq.com

*通訊作者：張劍寧，教授，博士生導師，E-mail：jnzhang2005@yahoo.com.cn

2015-10-10；

2016-01-06)