先天性巨結(jié)腸患兒平面細(xì)胞極性通路核心基因的突變篩查

蘇 琳，姜 茜，蔚開(kāi)慧，李 頎，張 震，肖 萍，姜 宏

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先天性巨結(jié)腸患兒平面細(xì)胞極性通路核心基因的突變篩查

蘇 琳1，姜 茜2，蔚開(kāi)慧3，李 頎4，張 震4，肖 萍5，姜 宏1

目的 探討平面細(xì)胞極性(PCP)信號(hào)通路核心基因突變?cè)谌祟愊忍煨跃藿Y(jié)腸(HSCR)疾病發(fā)生中的作用。方法 收集83例HSCR患兒外周血，提取基因組DNA，對(duì)PCP通路的核心基因(CELSR3、FZD3、VANGL1、VANGL2、PRICKLE1、PRICKLE2、DVL1、DVL2)進(jìn)行目標(biāo)區(qū)域捕獲及二代測(cè)序，針對(duì)檢出的可疑致病性突變進(jìn)行PCR擴(kuò)增及Sanger測(cè)序驗(yàn)證，通過(guò)GeneTool 軟件及生物信息學(xué)網(wǎng)站進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果 83例患兒中，9例患兒存在PCP通路核心基因突變，陽(yáng)性率為10.8%，突變的核心基因分別為：CELSR3基因c.7724A>G(H2575R)、c.6613G>A(A2205T)、c.1961C>T (T654M)、c.2230G>A(V744M) 和 c.8615C>G(A2872G)；PRICKLE1基因c.113C>T(P38L)和c.797C>T(T266I) ；DVL2 基因 c.319C>T(R107W )和c.1276G>T(V426L)，數(shù)據(jù)分析提示上述突變?yōu)橛泻ν蛔?。結(jié)論 PCP通路核心基因突變導(dǎo)致的編碼蛋白功能異?？赡軈⑴c了HSCR疾病的發(fā)生。

先天性巨結(jié)腸；平面細(xì)胞極性通路；基因突變；CELSR3

先天性巨結(jié)腸(Hirschsprung disease，HSCR)是一種多基因、多因素參與的神經(jīng)嵴細(xì)胞源性疾病[1]，屬于典型的腸神經(jīng)系統(tǒng)(rnteric nervous system，ENS)先天發(fā)育異常性疾病，是導(dǎo)致功能性腸梗阻最常見(jiàn)的小兒消化道畸形。其發(fā)病率存在種族差異，歐洲人群約為15/100 000，亞洲人群最高，我國(guó)屬于高發(fā)病率國(guó)家[2]。目前研究[3-4]顯示并確定的14個(gè)基因的累積突變僅能解釋不足20%患者的發(fā)病原因，提示其他致病基因或危險(xiǎn)因子可能參與了HSCR的發(fā)病。PCP通路在進(jìn)化上非常保守，從果蠅到哺乳動(dòng)物都包括一組共同的核心基因，在脊椎動(dòng)物中主要包括Fzd3(Frizzled3)、Celsr3(fmi)、Vangl、Dvl和Prickle等。其在原腸胚形成、軸突導(dǎo)向以及樹(shù)突形成等過(guò)程中均發(fā)揮重要作用[5]。有文獻(xiàn)[6]報(bào)道，Celsr3和Fzd3基因中任何一個(gè)缺失均可導(dǎo)致ENS軸突導(dǎo)向紊亂和胃腸道蠕動(dòng)異常，癥狀與人類HSCR高度相似。但目前尚無(wú)直接證據(jù)證明PCP通路核心基因異常與人類HSCR的發(fā)生具有相關(guān)性。該研究旨在探討HSCR 患者PCP通路核心基因的突變頻率、類型以及相應(yīng)臨床表型，為進(jìn)一步闡明PCP信號(hào)通路在人類ENS發(fā)育及HSCR發(fā)病中的作用，并提供相應(yīng)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例資料 選擇2013年4月～2015年5月在首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院普通外科診治的83例HSCR患兒作為研究對(duì)象，其中男51例，女32例；年齡10 d～10.8歲(1.17±1.77)歲，除1例有HSCR家族史外，其余均為散發(fā)病例，其中全結(jié)腸型HSCR 32例，長(zhǎng)段型HSCR 19例，短段型HSCR 32例。

1.2 方法

1.2.1 PCP通路核心基因捕獲及二代測(cè)序 利用目標(biāo)區(qū)域捕獲、測(cè)序法對(duì)8個(gè)PCP通路核心基因(CELSR3、FZD3、VANGL1、VANGL2、PRICKLE1、PRICKLE2、DVL1和DVL2)的外顯子及外顯子-內(nèi)含子交接區(qū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.2 DNA提取及全基因組文庫(kù)制備 應(yīng)用德國(guó)Qiagen公司試劑盒(the QIAamp DNA Blood Midi Kit)提取患兒靜脈血基因組DNA，隨機(jī)打斷(Biorupter)，純化長(zhǎng)度150～250 bp之間的片段，T4 DNA Polymerase、T4 phosphorylated polynucleotide kinase和EseheriehiacoliDNA聚合酶Klenow片段對(duì)純化后的DNA片段進(jìn)行末端修復(fù)，按照美國(guó)Illumina公司二代測(cè)序儀的操作說(shuō)明在片段兩端加上A堿基及接頭(adaptor)，磁珠純化。

1.2.3 雜交 對(duì)純化后的模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物與自主設(shè)計(jì)的特異性探針(GenCap Custom Enrichment Kit，北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司)雜交22 h，目標(biāo)片段因與特異性探針結(jié)合而被捕獲，洗脫未雜交的片段，保留在探針上的目標(biāo)片段再進(jìn)行次行捕獲PCR以顯著增加目標(biāo)片段的數(shù)量。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)中使用的芯片捕獲區(qū)包含8個(gè)PCP通路相關(guān)基因的外顯子及其側(cè)翼序列100 bp。Illumina Pipeline(version 1.8.2)獲取高通量測(cè)序原始數(shù)據(jù)，去除低質(zhì)量的數(shù)據(jù)后利用BWA(Burrows wheeler aligner)將“干凈的”讀序與人類基因組參考序列比對(duì)(UCSC, hg19)，再分別通過(guò)SOAPsnp和GATK軟件收集SNP和InDel。本實(shí)驗(yàn)中樣品基因的平均測(cè)序深度約為266.8×，捕獲區(qū)覆蓋度達(dá)95%以上。參考dbSNP數(shù)據(jù)庫(kù)、Hapmap、千人基因組數(shù)據(jù)庫(kù)及ESP(NHLBI Exome Sequencing Project)正常對(duì)照人群數(shù)據(jù)庫(kù)，找出致病性點(diǎn)突變，將頻率小于0.05的變異視為可疑。

1.2.5 PCP通路核心基因罕見(jiàn)突變的驗(yàn)證 應(yīng)用在線PRIMER 3軟件對(duì)序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)逐一設(shè)計(jì)引物(表1)。PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系(50 μl)為：10 ng/μl DNA模板15 μl、20 μmol/L上、下游引物各2 μl、10×PCR buffer 5 μl、2.5 mmol/L dNTPmix 5 μl、Takara Taq酶0.5 μl、去離子水20.5 μl。反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性1 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸30 s)，72 ℃延伸1 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化，雙向測(cè)序(北京諾賽基因組研究中心有限公司)，突變位點(diǎn)分析。

2 結(jié)果

2.1 PCP通路核心基因突變分析 83例HSCR患兒中，9個(gè)患兒中共檢出3個(gè)基因的9個(gè)錯(cuò)義突變，全部為雜合突變(圖1)，陽(yáng)性率為10.8%。6例患兒發(fā)現(xiàn)CELSR3基因5個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)，分別為：c.7724A> (H2575R)、c.6613G>A(A2205T)、c.1961C>T(T654M)、c.2230G>A(V744M)、c.8615C>G(A2872G)，其中2例患兒(HSCR0031和HSCR0048)同時(shí)出現(xiàn)c.1961C>T(T654M)錯(cuò)義突變，且突變位點(diǎn)位于CELSR3基因編碼蛋白的一個(gè)Cadherin功能域(圖2)，其臨床類型分別為長(zhǎng)段型和全結(jié)腸型巨結(jié)腸(巨結(jié)腸合并膽總管囊腫)，病情均較嚴(yán)重。 2例患兒PRICKLE1基因出現(xiàn)c.113C>T(P38L)和c.797C>T(T266I) 2個(gè)錯(cuò)義突變，另2例患兒DVL2基因出現(xiàn)c.319C>T(R107W)和c.1276G>T(V426L)2個(gè)錯(cuò)義突變。9例患兒中1例(HSCR0051)PCP通路兩個(gè)核心基因CELSR3和PRICKLE1同時(shí)發(fā)生錯(cuò)義突變，突變位點(diǎn)分別為 c.2230G>A(V744M)和c.797C>T(T266I)，其攜帶的c． 2230G > A( V744M) 突變位點(diǎn)也位于CELSR3 基因編碼蛋白的Cadherin 功能域，該患兒臨床分類為長(zhǎng)段型巨結(jié)腸，病情嚴(yán)重。Sanger 測(cè)序法的驗(yàn)證結(jié)果與2 代測(cè)序完全吻合。全部錯(cuò)義突變位點(diǎn)的信息見(jiàn)表2。

表1 PCP通路核心基因罕見(jiàn)突變位點(diǎn)驗(yàn)證引物信息

圖1 CELSR3、PRICKLE1、DVL2的9個(gè)錯(cuò)義突變位點(diǎn)Sanger測(cè)序驗(yàn)證

A: HSCR0120患者CELSR3基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.7724A>G(H2575R)；B：HSCR0013患者CELSR3基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.6613G>A(A2205T)；C：HSCR0031和HSCR0048患者CELSR3基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.1961C>T(T654M)；D：HSCR0051患者CELSR3基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.2230G>A(V744M)；E:HSCR0058患者CELSR3基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.8615C>G(A2872G)；F: HSCR0009患者PRICKLE1基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.113C>T(P38L)；G：HSCR0051患者PRICKLE1基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.797C>T(T266I)；H：HSCR0126患者DVL2基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.319C>T(R107W)；I：HSCR0030患者DVL2基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)：c.1276G>T(V426L)

圖2 CELSR3基因編碼蛋白模式圖及本研究發(fā)現(xiàn)的5個(gè)錯(cuò)義突變位置

2.2 PCP通路核心基因突變患兒的臨床表型 PCP通路核心基因突變共累及9例患兒，男7例，女2例，男性明顯多于女性(3.5 ∶1)，與HSCR發(fā)生的性別比接近?；純号R床分型分別為短段型4例，長(zhǎng)段型3例，全結(jié)腸2例，長(zhǎng)段型和全結(jié)腸型患兒的就診年齡早于短段型。見(jiàn)表3。

3 討論

HSCR是一種多基因、多因素參與的復(fù)雜性疾病，可散發(fā)，也可呈家族性遺傳。目前已經(jīng)鑒定的14個(gè)疾病易感基因主要來(lái)自ENS發(fā)育中起主要作用的3個(gè)信號(hào)通路(RET、EDNRB和SEMA3C/D)[2]，以及可調(diào)控、影響這些基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子編碼基因和其他幾個(gè)在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中已明確具有重要作用的基因。目前該病研究主要集中在與信號(hào)通路相關(guān)的腸神經(jīng)嵴細(xì)胞發(fā)育以及腸道微環(huán)境等方面，關(guān)注神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)形成、神經(jīng)突起導(dǎo)向等方面的研究尚少。研究[7]表明PCP信號(hào)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過(guò)程中如神經(jīng)元遷移、軸突導(dǎo)向和樹(shù)突形成等方面均起著不可或缺的作用。Celesr3和Fzd3基因敲除小鼠研究[6]也已證實(shí)PCP通路參與了小鼠腸神經(jīng)系統(tǒng)的形成，推測(cè)PCP通路核心基因的功能異?？赡芘c人類HSCR的易感性增高有關(guān)。本研究采用二代測(cè)序方法對(duì)83例患兒的PCP通路核心基因進(jìn)行篩查，在9個(gè)患兒中發(fā)現(xiàn)了3個(gè)基因的9個(gè)雜合錯(cuò)義突變，其中6例存在CELSR3基因的有害突變，2例存在PRICKLE1基因的有害突變，2例存在DVL2的有害突變，1例患兒同時(shí)存在CELSR3基因和PRICKLE1基因的2個(gè)突變。全部9個(gè)錯(cuò)義突變累及的位點(diǎn)都具有高度保守性，平均GERP分值達(dá)到5.04(最低3.91，最高5.57)，且在正常人群數(shù)據(jù)庫(kù)中均未出現(xiàn)或者出現(xiàn)頻率極低。

表2 HSCR患者PCP通路核心基因錯(cuò)義突變位點(diǎn)信息

表中的變異等位基因頻率的數(shù)據(jù)分別來(lái)自ESP、ExAc和北京邁基諾基因科技有限責(zé)任公司自建數(shù)據(jù)庫(kù)等3個(gè)正常對(duì)照人群數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)

表3 PCP通路基因罕見(jiàn)突變累及患者的臨床信息

CELSR3基因編碼蛋白是長(zhǎng)度超過(guò)3 000個(gè)氨基酸的非典型鈣黏蛋白，其胞外域極大，其中8個(gè)N末端重復(fù)鈣黏結(jié)構(gòu)域(Cadherin)在細(xì)胞遷移中起重要作用[8]。神經(jīng)嵴細(xì)胞是腸神經(jīng)嵴細(xì)胞的祖細(xì)胞，其遷移障礙可導(dǎo)致其下游發(fā)生一系列變化，而CELSR3基因N端鈣黏結(jié)構(gòu)域可激活PCP通路并導(dǎo)致細(xì)胞極性變化，一旦發(fā)生錯(cuò)義突變可影響其蛋白功能，進(jìn)而干擾其調(diào)控神經(jīng)嵴細(xì)胞遷移功能[9]。CELSR3-/-小鼠模型研究[6]證實(shí)，突變小鼠病變段結(jié)腸呈現(xiàn)神經(jīng)元遷移、軸突導(dǎo)向異常等多種障礙，其腸道運(yùn)動(dòng)功能的改變、排便障礙都和人類HSCR患者的臨床表現(xiàn)高度相似。本研究CELSR3基因5個(gè)突變位點(diǎn)中有2個(gè)位于N末端重復(fù)鈣黏結(jié)構(gòu)域內(nèi)，HSCR0031和HSCR0048患兒均存在編碼區(qū)1961位“C”、“T”堿基互換，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由蘇氨酸變成蛋氨酸，患兒表現(xiàn)為長(zhǎng)段型巨結(jié)腸；HSCR0051患兒編碼區(qū)2230位“G”、“T” 堿基互換，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由纈氨酸變成蛋氨酸(圖2)，患兒表現(xiàn)為全結(jié)腸型巨結(jié)腸，3例患兒病情均較嚴(yán)重。

作為PCP通路的核心基因，PRICKLE1基因編碼的蛋白由831個(gè) 氨基酸構(gòu)成，主要參與神經(jīng)突的生長(zhǎng)和神經(jīng)元的遷移[10]。HSCR0009患兒編碼區(qū)113位“C”、“T”堿基互換，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由脯氨酸變成亮氨酸，HSCR0051患兒編碼區(qū)797位“C”、“T”堿基互換，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由蘇氨酸變成異亮氨酸。DVL2同樣是PCP通路的核心基因，編碼蛋白由 736個(gè)氨基酸構(gòu)成，HSCR0126患兒編碼區(qū)319位“C”、“T”堿基互換，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由精氨酸變成色氨酸；HSCR0030患兒編碼區(qū)1276位“G”、“T”堿基互換，導(dǎo)致其編碼的氨基酸由纈氨酸變成亮氨酸。由于PCP通路的核心基因間相互緊密關(guān)聯(lián)，任何一個(gè)基因的缺失或者功能受損都將影響其它核心蛋白的功能[7]，因此PRICKLE1和DVL2基因的錯(cuò)義突變可能會(huì)干擾PCP通路在ENS發(fā)育中的正常作用，參與HSCR的發(fā)生。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)83例HSCR患兒PCP通路核心基因突變篩查，在9例患兒中檢出3個(gè)核心基因的9個(gè)雜合突變位點(diǎn)，其編碼蛋白的受累氨基酸均高度保守且在正常人群中發(fā)生率極低，提示PCP通路核心基因編碼蛋白的功能異?？赡苁荋SCR發(fā)病的原因之一，或可顯著增加其發(fā)病的易感性。鑒于本研究的病例樣本數(shù)有限，尚不能得出確切結(jié)論，有待于進(jìn)一步增加樣本量，并從蛋白表達(dá)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能等多方面進(jìn)行深入研究，以揭示人類ENS發(fā)育和HSCR發(fā)生的確切機(jī)制。

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網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2016-8-10 11:04:49 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.032.html

Mutation screening of the core genes in planar cell polarity pathway in patients with Hirschsprung disease

Su Lin1, Jiang Qian2, Yu Kaihui3, et al

(1ReproductiveMedicineCenter,TheClinicalCollegeofPLAAffiliatedAnhuiMedicalUniversity,Hefei230031;2DeptofMedicalGenetics,BeijingMunicipalKeyLaboratoryofChildDevelopmentandNutriomics,CapitalInstituteofPediatrics,Beijing100020;3DeptofPathophysiology,SchoolofPreclinicalSciences,GuangxiMedicalUniversity,Nanning530021)

ObjectiveToinvestigatetheeffectofcoregenesmutationinplanarcellpolarity(PCP)pathwayonthepathogenesisofHirschsprungdisease(HSCR).Methods83ChinesechildrenwithHSCRwererecruitedinthisstudyafterobtaininginformedconsents,andgenomicDNAofallsubjectswasextractedfromperipheralblood.Thesuspectedmutationsof8coregenes(CELSR3,FZD3,VANGL1,VANGL2,PRICKLE1,PRICKLE2,DVL1,DVL2)inPCPpathwaywereverifiedbySangersequencingafterthenextgenerationsequencing.TherawdatawereanalyzedwiththemolecularbiologicalwebsitesandtheGeneToolsoftware.ResultsHeterozygousmissensemutationswere

Hirschsprungdisease;planarcellpolarity;genemutation; CELSR3

時(shí)間：2016-8-10 11:04:49

http://www.cnki.net/kcms/detail/34.1065.R.20160810.1104.031.html

2016-05-30接收

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81300266)；北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(編號(hào)：7142029)；北京市優(yōu)秀人才培養(yǎng)個(gè)人項(xiàng)目(編號(hào)：2013D003034000007)；北京市科技新星(編號(hào)：Z151100000315091)

1安徽醫(yī)科大學(xué)解放軍臨床學(xué)院生殖中心，合肥 230031

2首都兒科研究所遺傳研究室、兒童發(fā)育營(yíng)養(yǎng)組學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100020

3廣西醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，南寧 530021

首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院4新生兒外科、5病理科，北京 100020

蘇 琳，女，碩士研究生；

姜 宏，男，教授，碩士生導(dǎo)師，責(zé)任作者，E-mail: jiangh105@sina.com

R 394.1；R 715.2；R 715.5；R 714.7；R 714.55

A

1000-1492(2016)10-1534-06

10.19405/j.cnki.issn1000-1492.2016.10.031

identifiedin9subjectswithadetectionrateof10.8%(9/ 83).Theywere: CELSR3genec.7724A>G(H2575R),c.6613G>A(A2205T),c.1961C>T(T654M),c.2230G>A(V744M)andc.8615C>G(A2872G); PRICKLE1genec.113C>T(P38L)andc.797C>T(T266I); DVL2genec.319C>T(R107W)andc.1276G>T(V426L),andallofthemhadnotbeenreportedbefore.Bioinformaticanalysisdemonstratedthatallthesemutationsweredeleteriousandmightbetheriskfactorsforpathogenesis.ConclusionAbnormalfunctionofPCPcoregenesmaybepossibleriskfactorforthepathogenesisofHSCR.