王月霞， 楊秀蘭， 杜榮斌， 劉立明， 劉義豪

(1山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺(tái) 264006；2煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

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枯草芽孢桿菌對海水魚塘生態(tài)因子的影響

王月霞1， 楊秀蘭2， 杜榮斌2， 劉立明2， 劉義豪1

(1山東省海洋資源與環(huán)境研究院，山東 煙臺(tái) 264006；2煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005)

為探討枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)在魚類養(yǎng)殖池塘中的生態(tài)作用，采用直接往養(yǎng)殖水體中投放該制劑的方法，研究分析微生物數(shù)量及其與環(huán)境因子的相關(guān)關(guān)系。結(jié)果顯示，枯草芽孢桿菌，實(shí)驗(yàn)池?cái)?shù)量為0.35×103～1.45×103cfu/mL，對照池為0.04×103～0.08×103cfu/mL；浮游植物生物量，實(shí)驗(yàn)池為0.094～1.521 mg/L，對照池為0.103～0.763 mg/L，實(shí)驗(yàn)池中枯草芽孢桿菌數(shù)量和浮游植物生物量均高于對照組。試驗(yàn)魚塘中枯草芽孢桿菌與硅藻數(shù)量呈顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)0.844(P<0.05)；當(dāng)溶氧≥6 mg/L時(shí), 枯草芽孢桿菌與亞硝酸鹽氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)-0.915(P<0.05)。溶氧過低(<2 mg/L)時(shí)，枯草芽孢桿菌對亞硝酸鹽氮、氨氮沒有明顯的降解作用；溶氧≥6 mg/L時(shí),對亞硝酸鹽氮、氨氮的降解作用明顯。研究表明，投放適量濃度的枯草芽孢桿菌能有效改善養(yǎng)殖水體狀況，對水質(zhì)起到進(jìn)一步凈化作用。

枯草芽孢桿菌；菌落數(shù)；溶氧；海水魚池；氨氮：亞硝酸鹽氮

枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為水產(chǎn)養(yǎng)殖中的飼料添加劑或輔助劑[1-4]，對于提高魚類消化力與免疫力有明顯作用[5-7]；其作為降解氨氮、亞硝酸鹽氮的水質(zhì)凈化劑也獲得了顯著的效果[8-14]。枯草芽孢桿菌是好氧菌，在自然條件下魚池溶氧主要來源于浮游植物和大型藻類的光合作用，因此其凈化水質(zhì)不僅與溶氧有關(guān)，而且還與浮游植物等其它生態(tài)條件有關(guān)[15-16]。對于室外養(yǎng)魚池，施加枯草芽孢桿菌對各生態(tài)因子的影響目前報(bào)道的尚不夠全面，特別是枯草芽孢桿菌與溶氧、浮游植物、大型藻類的關(guān)系有待于進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)在這些方面做了一些探索，以豐富枯草芽孢桿菌應(yīng)用技術(shù)和基礎(chǔ)理論的研究。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2015年4—5月在煙臺(tái)大學(xué)海洋學(xué)院小黑山島科研基地進(jìn)行。2個(gè)面積均為40.0 m2、平均水深3.5 m的室外養(yǎng)魚池作為對照池和試驗(yàn)池，分別放養(yǎng)體重約(150±5.8)g梭魚(Chelonhaematocheilus)(500尾/池)和體重約(50±3.4)g黒鯛(Sparusmacrocephlus)(1 000尾/池)。

1.2.1 養(yǎng)殖管理

餌料投喂定時(shí)、定點(diǎn)，配合飼料日投餌量為魚體重的0.5%～2%；4月28日試驗(yàn)池投放枯草芽孢桿菌單一微生態(tài)制劑1 600 mL(實(shí)測該原液濃度為3.4×109cfu/mL)，換算后池水濃度為4.5×104cfu/mL；對照池沒有施加制劑。

1.2.2 水樣采集與測定

實(shí)驗(yàn)池和對照池各設(shè)2個(gè)采樣點(diǎn)，先用采水器采下層水作為溶氧水樣，再采上、下兩層的混合水樣作為其它水化學(xué)檢測水樣和微生物檢測水樣。微生物檢測水樣用滅菌瓶單獨(dú)存放，6 h內(nèi)進(jìn)行檢測。4月28日當(dāng)日采樣1次，以后每5 d采樣1次。

測定方法：溶氧(DO)使用碘量法，亞硝酸鹽氮(NO2--N)使用萘乙二胺分光光度法，氨氮(NH4+-N)使用次溴酸鹽氧化法(GB 17378.4—2007)，硝酸鹽氮(NO3--N)使用鋅鎘還原法(GB/T 12763.4—2007)，COD使用堿性高錳酸鉀法(GB 17378.4—2007)。

1.2.3 微生物測定

總菌數(shù)計(jì)數(shù)目前大多采用傾注平板計(jì)數(shù)法，該法取量準(zhǔn)確，有規(guī)范的技術(shù)與器材，總計(jì)數(shù)的準(zhǔn)確度高于涂布法，但由于此法菌落容易包埋于培養(yǎng)基中，不易辨別枯草芽孢桿菌典型菌落特征，所以枯草芽孢桿菌計(jì)數(shù)采用涂布平板計(jì)數(shù)法。

傾注平板計(jì)數(shù)：取1mL搖勻的水樣，稀釋濃度為1.0×10-1、1.0×10-2和1.0×10-3，分別在三個(gè)梯度中各均勻取出1 mL稀釋液，加入到無菌培養(yǎng)皿中，添加約48 ℃的培養(yǎng)基進(jìn)行平板培養(yǎng)，每個(gè)梯度做2個(gè)平板，30 ℃培養(yǎng)48 h后計(jì)數(shù)菌落數(shù)。選擇每板30～300菌落的稀釋梯度為有效菌落數(shù)，計(jì)算出魚池中的總菌數(shù)。

涂布平板計(jì)數(shù)：同步用傾注平板計(jì)數(shù)時(shí)制作的同一水樣及梯度進(jìn)行涂布平板計(jì)數(shù)。首先制作瓊脂平板，然后在其表面涂布各梯度水樣(用量0.1 mL)。30 ℃下培養(yǎng)48～96 h后(以能區(qū)分枯草芽孢桿菌典型特征為標(biāo)準(zhǔn))，計(jì)數(shù)枯草芽孢桿菌典型菌落數(shù)，求出百分比，再用傾注平板計(jì)數(shù)法觀察的總菌數(shù)換算出菌落數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌數(shù)與總菌數(shù)

枯草芽孢桿菌菌數(shù)及魚塘總菌數(shù)見表1。對照池中的枯草芽孢桿菌是自然水域中存在的，其數(shù)量遠(yuǎn)少于實(shí)驗(yàn)池。

表1 枯草芽孢桿菌在魚池中的分布與數(shù)量

2.2 溶氧的變化

從試驗(yàn)期間溶氧的變化(圖1)可知，4月28日至5月19日，實(shí)驗(yàn)池中的溶氧一直低于對照池，其中5月5日—5月10日溶氧不足2.0 mg/L，枯草芽孢桿菌也出現(xiàn)滯長。因枯草芽孢桿菌是好氧菌，會(huì)大量消耗水中溶氧。5月10日取水后使用氣泡石機(jī)械充氧，溶氧明顯回升，5月26日由于實(shí)驗(yàn)池浮游植物數(shù)量急劇增加，溶氧達(dá)到最大值13.51 mg/L，枯草芽孢桿菌回升到1.06×103cfu/mL。

2.3 氨氮的變化

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)池氨氮濃度除5月26日其他都高于同期對照池，該日的實(shí)驗(yàn)池氨氮濃度(0.011 mg/L)低于同期對照池的氨氮濃度(0.020 mg/L)，結(jié)合圖1，此時(shí)溶氧已上升并超過對照池，顯示溶氧濃度較低時(shí)(6.0 mg/L以下)，實(shí)驗(yàn)池枯草芽孢桿菌雖然較多但氨氮仍高于對照池，當(dāng)實(shí)驗(yàn)池溶氧濃度超過6.0 mg/L，氨氮濃度才由5月10日的1.837 mg/L直至降到5月26日的0.011 mg/L。

圖1 溶氧的變化Fig.1 The variation of dissolved oxygen

圖2 氨氮的變化Fig.2 The variation of ammonia nitrogen

2.4 亞硝酸鹽氮的變化

4月28日實(shí)驗(yàn)池投放了枯草芽孢桿菌，亞硝酸鹽氮濃度開始明顯上升，直至5月19日始終高于對照池，說明枯草芽孢桿菌對降解亞硝酸鹽氮沒有作用，但5月26日測定結(jié)果表明枯草芽孢桿菌降解亞硝酸鹽氮的作用明顯，這可能與實(shí)驗(yàn)池溶氧上升到6.0 mg/L以上有關(guān)(圖3)。

圖3 亞硝酸鹽氮的變化Fig.3 The variation of nitrite nitrogen

2.5 硝酸鹽氮的變化

由圖4可知，實(shí)驗(yàn)池硝酸鹽含量大多比對照池少，這可能與缺氧有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)由于施加枯草芽孢桿菌過量，使得水中溶氧降低，因此影響了亞硝酸鹽氮降解轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮的作用。所以，實(shí)驗(yàn)池硝酸鹽氮并沒有因施加好氧性枯草芽孢桿菌而增加。

圖4 硝酸鹽氮的變化Fig.4 The variation of nitrate nitrogen

2.6 枯草芽孢桿菌與浮游植物

將枯草芽孢桿菌數(shù)(表1)與主要浮游植物優(yōu)勢種的個(gè)體數(shù)(表2、表3)用SPSS 19.0軟件進(jìn)行了相關(guān)性分析(表4)，枯草芽孢桿菌與小球藻幾乎不相關(guān)；與色球藻在對照池出現(xiàn)明顯負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)-0.929)；與硅藻在實(shí)驗(yàn)池出現(xiàn)正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0.844)。色球藻在有枯草芽孢桿菌、溶氧充足的條件下生長受到抑制，可能與色球藻個(gè)體小(2 μm左右)且主要以氨氮為營養(yǎng)鹽有關(guān)。而枯草芽孢桿菌在溶氧充足的條件下降解氨氮，所以不利于其生長。實(shí)驗(yàn)后期，色球藻、裸藻爆發(fā)，可能與先前溶氧不足、氨氮過高有關(guān)。硅藻一般個(gè)體較大(20～200 μm)，可利用氨氮及硝酸鹽氮，故其生長較快。

2.7 枯草芽孢桿菌與主要生態(tài)因子的相關(guān)性分析

枯草芽孢桿菌數(shù)與各化學(xué)指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)見表4。本實(shí)驗(yàn)中，由于實(shí)驗(yàn)池溶氧缺乏，枯草芽孢桿菌與亞硝酸鹽氮的相關(guān)性小于對照池，在對照池有明顯的負(fù)相關(guān)(相關(guān)系數(shù)-0.915)；枯草芽孢桿菌與氨氮、硝酸鹽氮相關(guān)系數(shù)均較小。從枯草芽孢桿菌與各生態(tài)因子相關(guān)性分析看，實(shí)驗(yàn)池沒有對照池理想，也可以認(rèn)為對照池的枯草芽孢桿菌量更為適宜。

表2 對照池浮游植物個(gè)數(shù)及生物量

表3 實(shí)驗(yàn)池浮游植物個(gè)數(shù)及生物量

表4 枯草芽孢桿菌與各生態(tài)因子的相關(guān)系數(shù)

注：*表示在0.05水平(雙側(cè))上顯著相關(guān)。

3 討論

3.1 大量施加枯草芽孢桿菌會(huì)使魚池溶氧短時(shí)間內(nèi)大幅下降

在實(shí)驗(yàn)池加入枯草芽孢桿菌單一微生態(tài)制劑13.3 mL/m3后，實(shí)驗(yàn)池中枯草芽孢桿菌數(shù)瞬時(shí)可達(dá)4.5×104cfu/mL(實(shí)測該制劑濃度3.4×109cfu/mL)，好氧菌的突然增加，使溶氧在幾天內(nèi)迅速下降，這與湯寶貴[17]等所做的研究相符。溶氧的迅速下降，會(huì)導(dǎo)致枯草芽孢桿菌沉淀、養(yǎng)殖生物缺氧死亡、氨氮等有毒有害物質(zhì)積累，形成惡性循環(huán)，為養(yǎng)殖生產(chǎn)帶來不利影響。因此，本研究認(rèn)為利用枯草芽孢桿菌凈化海水魚池水質(zhì)時(shí)，其魚池中枯草芽孢桿菌數(shù)量應(yīng)控制在1.0×104cfu/mL數(shù)量級以下，并及時(shí)補(bǔ)充溶氧。

3.2 枯草芽孢桿菌降解亞硝酸鹽氮、氨氮的效果與溶氧關(guān)系密切

本實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)溶氧濃度超過5.92 mg/L時(shí)，枯草芽孢桿菌才能使實(shí)驗(yàn)池中氨氮、亞硝酸鹽氮濃度顯著下降?？莶菅挎邨U菌對氨氮的降解作用受到菌量、轉(zhuǎn)化作用的影響，有一定的滯后，溶氧升高并不能立即使氨氮濃度降低。對照池中溶氧濃度高于6 mg/L，枯草芽孢桿菌濃度在0.1×104～0.4×104cfu/mL是最佳生態(tài)調(diào)控指標(biāo)，枯草芽孢桿菌與亞硝酸鹽氮的相關(guān)性顯著(相關(guān)系數(shù)-0.915)，隨著枯草芽孢桿菌數(shù)升高，亞硝酸鹽氮含量降低。實(shí)驗(yàn)池溶氧前期低于6 mg/L時(shí)，枯草芽孢桿菌與亞硝酸鹽氮相關(guān)系數(shù)只有-0.358。實(shí)驗(yàn)池最后2次測定：溶氧由5.915 mg/L升到13.51 mg/L，亞硝酸鹽氮?jiǎng)t由0.172 5 mg/L降至0.003 mg/L，氨氮由0.267 5 mg/L降至0.011 0 mg/L， 這時(shí)對亞硝酸鹽氮、氨氮的去除率分別為98%、95.88%，比王庚申等[18]用復(fù)合微生態(tài)制劑去除梭子蟹養(yǎng)殖廢水亞硝酸鹽氮的去除率20%～55%、氨氮的去除率36.17%～86.96%更高。

3.3 枯草芽孢桿菌對浮游植物優(yōu)勢種的影響

從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，枯草芽孢桿菌可以促進(jìn)水體中小球藻、硅藻、裸藻的生長，隨著水溫的逐漸升高，優(yōu)勢種依次為小球藻、硅藻、裸藻。但在試驗(yàn)后期，裸藻、色球藻大量增殖，抑制了小球藻的數(shù)量，特別是喜氮裸藻的大量繁殖，有制造氧氣、降低氨氮的作用，益于枯草芽孢桿菌的繁殖，使得后期的枯草芽孢桿菌菌落數(shù)量增多。

4 結(jié)論

綜上所述，由于室外海水魚塘施加了枯草芽孢桿菌，使得養(yǎng)殖水域的溶氧、氨氮、亞硝酸鹽及浮游植物等發(fā)生了很大變化，枯草芽孢桿菌不僅影響了化學(xué)指標(biāo)，還影響了生物指標(biāo)在魚池中的消長與變化，特別是造成溶氧的變化，溶氧的變化反過來又影響到枯草芽孢桿菌自身降解氨氮與亞硝酸鹽氮的效果，說明枯草芽孢桿菌與溶氧是一個(gè)生態(tài)調(diào)控的統(tǒng)一體。在沒有增氧設(shè)備的室外養(yǎng)殖水域中不宜使用過多的枯草芽孢桿菌；在充氧設(shè)備較好的室內(nèi)魚類養(yǎng)殖池，使用枯草芽孢桿菌可以降低養(yǎng)殖成本，提高養(yǎng)殖效益。

□

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Effects of Bacillus subtilis on the ecological factors in marine fish pond

WANG Yuexia1， YANG Xiulan2， DU Rongbin2， LIU Liming2， LIU Yihao1

(1 Shandong Marine Resource and Environment Research Institute, Yantai 264006,China; 2 School of Ocean, Yantai University, Yantai 264005, China)

To discuss the ecological effects of micro-ecological agents ofBacillussubtilisinto marine fish pond, the relationship between microorganism quantity and environmental factors was investigated in marine fish pond by artificially adding method. The results showed that the quantity ofBacillussubtilisamounted to 0.35×103-1.45×103cfu/mL in the experiment group, and 0.04×103- 0.08×103cfu/mL in the control group; the phytoplankton biomass (0.102 6-0.763 2 mg/L in the experiment group and 0.093 6-1.520 9 mg/L in the control group) were both significantly higher in the experiment group than those in the control group. In the experiment group; the Bacillus subtilis amounts were significantly positive correlative with the diatom abundance (correlation coefficient=0.844,P<0.05), but those were significantly negative correlative with the nitrite nitrogen concentration (correlation coefficient=-0.915,P<0.05), if the dissolved oxygen concentration was more than 6 mg/L. In addition, if the dissolved oxygen concentration was too low (<2 mg/L), there was no degradation effect ofBacillussubtilison ammonia nitrogen and nitrite nitrogen in the seawater, but there was a significant degradation effect of Bacillus subtilis on ammonia nitrogen and nitrite nitrogen when the dissolved oxygen concentration reached to 6 mg/L or more. Thus it can be inferred that the appropriate concentration ofBacillussubtiliscan effectively improve the condition of aquaculture water, and further purify the water quality.

Bacillussubtilis; colony number; dissolved oxygen; marine fish pond; ammonia nitrogen; nitrite nitrogen

2015-07-16

2015-11-09

國家海洋公益性行業(yè)科研專項(xiàng)(201205025)

王月霞(1974—)，女，助理工程師，研究方向：海洋生物與水產(chǎn)養(yǎng)殖。E-mail：zuweiliyt@163.com

楊秀蘭(1957—)，女，教授，研究方向：水域生態(tài)學(xué)。E-mail：yangxiulan@126.com

10.3969/j.issn.1007-9580.2016.01.001

S917.1

A

1007-9580(2016)01-001-06