田清武 孫樹凱 翟玉娥 趙鵬 趙涵 申井利 翟木緒

·論著·

雌激素對去卵巢大鼠內(nèi)臟脂肪細胞脂肪因子表達水平的影響

田清武 孫樹凱 翟玉娥 趙鵬 趙涵 申井利 翟木緒

目的觀察雌激素對去卵巢大鼠內(nèi)臟脂肪細胞瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達水平的影響，探討雌激素對體脂分布的影響機制。方法6周齡Sprauge-Dawley雌性大鼠30只，采用隨機數(shù)字表法分成3組：假手術組、去卵巢組和去卵巢+戊酸雌二醇組(OVX+E2組)，每組10只。術后1周，OVX+E2組大鼠每天按1 mg/kg體重灌胃戊酸雌二醇水溶液，其他組大鼠灌胃等體積蒸餾水。連續(xù)給藥12周后，腹主動脈取血，迅速剝離內(nèi)臟脂肪組織。采用全自動生化分析儀檢測血脂、血糖。采用免疫組化染色、實時熒光定量RT-PCR和Western印跡檢測脂肪細胞瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的表達。結果3組血清瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素水平差異無統(tǒng)計學意義(P均gt;0.05)， 但去卵巢組TNF-α水平顯著高于假手術組(F=4.785，Plt;0.05)。免疫組化顯示，與假手術組相比，去卵巢組內(nèi)臟脂肪組織中瘦素表達明顯減弱，而脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α表達明顯增強；與去卵巢組相比，OVX+E2組內(nèi)臟脂肪組織中瘦素表達明顯增強，脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α表達明顯減弱(F=3.712～5.198，P均lt;0.05)。3組內(nèi)臟脂肪細胞瘦素mRNA和蛋白表達水平差異無統(tǒng)計學意義(P均gt;0.05)；去卵巢組內(nèi)臟脂肪細胞脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的mRNA和蛋白表達水平顯著高于假手術組，而OVX+E2組內(nèi)臟脂肪細胞脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的mRNA和蛋白表達水平顯著低于去卵巢組(F=3.175～5.342，P均lt;0.05)。結論雌激素可通過下調(diào)去卵巢大鼠內(nèi)臟脂肪細胞脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的表達，進而影響去卵巢大鼠體脂再分布。

卵巢切除；脂肪組織；脂肪因子

脂肪組織不僅是一個能源儲存器官，而且是一個重要的內(nèi)分泌器官，可分泌多種脂肪因子，包括瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、腫瘤壞死因子(TNF)-α等。這些因子通過多種機制影響機體的能量平衡和糖、脂代謝，進而調(diào)控體脂量。絕經(jīng)后女性存在體脂再分布的傾向，特別是內(nèi)臟脂肪組織增多，進而導致肥胖相關疾病如代謝綜合征、糖尿病、心血管疾病的發(fā)病風險增加，嚴重影響身心健康。研究證實，絕經(jīng)后女性雌激素的缺乏與其內(nèi)臟脂肪堆積密切相關，但其具體機制尚未完全闡明[1-2]。本研究以去卵巢大鼠為研究對象，觀察外源性雌激素對脂肪因子表達水平的影響，進而探討雌激素影響脂肪分布的可能機制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡Sprauge-Dawley雌性大鼠30只，體重(200±20)g，由青島藥品研究所實驗動物中心提供[許可證號：SCXK(魯) 201400061，批號：0028322]。分籠飼養(yǎng)，室溫23～25℃，相對濕度50%～70%，使用普通飼料，自由攝水。

1.1.2 主要試劑及設備 補佳樂(法國 DELPHARM LilleS.A.S公司)，每片含 1 mg戊酸雌二醇。Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，PCR引物(上海生工生物工程技術公司)，F(xiàn)astQuant cDNA第一鏈合成試劑盒、SuperReal熒光定量PCR(SYBR Green)試劑盒(北京天根生物技術公司)，兔抗鼠瘦素單克隆抗體、兔抗鼠脂聯(lián)素單克隆抗體、兔抗鼠TNF-α單克隆抗體(英國abcam公司)，兔抗鼠抵抗素單克隆抗體(英國Biorbyt公司)，山羊抗兔二抗PV-6001、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)，脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、TNF-α酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技公司)。

實驗用儀器主要有高速低溫離心機(德國Heraeus)，微量可調(diào)移液器(德國Eppendorf)，微量核酸測量儀(瑞典Amershan)，超聲勻漿器(德國IKA)，Stratagene MX3000 PCR擴增儀(美國Agilent)，貝克曼AU5400全自動生化分析儀(美國Beckman)，Leica A、Leica EG1150H包埋機、Leica RM2235切片機(德國Leica)。

1.2 方法

1.2.1 去卵巢大鼠模型的建立 Sprauge-Dawley大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分成假手術組(n=10)和手術組(n=20)。手術前大鼠禁食12 h，腹腔注射10%水合氯醛麻醉。假手術組無菌條件下經(jīng)腰背部雙側切口進入腹腔，摘除腹腔內(nèi)卵巢體積大小脂肪組織，即可縫合切口。手術組打開腹腔，切除雙側卵巢，切口分層縫合。術后用青霉素注射3 d，防止傷口感染。術后1周美藍染色觀察陰道上皮細胞，如無動情周期變化則確定去勢成功，術后 1 周開始干預。

1.2.2 實驗動物分組及給藥方法 手術恢復1周后， 手術組大鼠再采用隨機數(shù)字表法分成去卵巢組(n=10)和去卵巢+戊酸雌二醇組(OVX+E2組，n=10)。OVX+E2組每天灌胃戊酸雌二醇水溶液，給藥劑量為1 mg/kg，而其他組給予相應體積的蒸餾水，連續(xù)給藥12周，每周稱重 1 次，按體重調(diào)整藥量。以假手術組每日平均進食量為標準，控制其他各組飼料攝入量。

1.2.3 樣品采集與制備 12周后所有大鼠禁食過夜，稱重。采用腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉，然后把大鼠固定于手術臺，腹主動脈取血，以4 000 r/min(r=16 cm)離心10 min分離血清，于-20℃保存。取血后迅速剝離內(nèi)臟脂肪組織，用預冷生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干組織表面水分，并分別稱重，計算內(nèi)臟脂肪指數(shù)(內(nèi)臟脂肪重量/體重×100%)。然后取部分內(nèi)臟脂肪組織速凍于液氮中，隔日移入-80℃冰箱中保存，用于后續(xù)mRNA和免疫組化檢測。

1.2.4 血清中指標的檢測 取大鼠血清，室溫復溶后用全自動生化分析儀測定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白-膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白-膽固醇(HDL-C)，ELISA法檢測瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和 TNF-α水平。

1.2.5 免疫組化方法 取材后4%多聚甲醛固定，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋制成蠟塊。常規(guī)石蠟切片，64℃烤片60 min，梯度酒精脫蠟至水，抗原熱修復，3%過氧化氫10 min滅活內(nèi)源性酶。山羊血清工作液封閉，37℃10 min。分別加稀釋好的一抗脂聯(lián)素(1∶300)、瘦素(1∶300)、抵抗素(1∶200)、TNF-α(1∶300)37℃孵育1 h。PBS清洗后加二抗PV-6001，37℃ 30 min，PBS清洗后加DAB顯色1 min，清洗，蘇木素復染、脫水、透明、封片，顯微鏡觀察、拍照。灰度分析采用Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件。

1.2.6 RT-PCR測定內(nèi)臟脂肪組織中脂聯(lián)素、瘦素、抵抗素、TNF-α mRNA水平 提取內(nèi)臟脂肪組織總RNA，紫外分光光度計檢測確定總RNA濃度及純度。嚴格按照cDNA第一鏈合成試劑盒說明，合成cDNA第一鏈。取2 μl合成的cDNA產(chǎn)物及相應的上、下游引物加入SuperReal PreMix Plus實時熒光定量PCR反應體系中，總反應體系為20 μl ，擴增條件為95℃預變性15 min，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)，β-actin作為內(nèi)參。以β-actin基因的表達量作為內(nèi)參來校正目的基因的表達量，結果以2-ΔΔCt表示，實驗重復3次取平均值。RT-PCR引物序列由上海生工生物工程技術公司設計、合成，見表1。

表1 RT-PCR引物序列

注：TNF-α：腫瘤壞死因子-α

1.2.7 Western印跡檢測大鼠內(nèi)臟脂肪中瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-ɑ的表達 取適量凍存的大鼠內(nèi)臟脂肪組織，提取組織中的總蛋白，取上清用 BCA 法測定蛋白含量。取提取的總蛋白30 μg經(jīng)12%SDS-PAGE分離后，轉至硝酸纖維素(PVDF)膜，用5%脫脂奶粉封閉2 h，隨后加入稀釋后兔抗鼠瘦素(1∶500)、脂聯(lián)素(1∶500)、抵抗素(1∶300)和TNF-α(1∶500)抗體，4℃過夜。用TBST洗膜，加入稀釋后羊抗兔HRP標記的二抗(1∶10 000)，室溫孵育2 h，再用TBST洗膜。取PVDF膜置于凝膠成像儀中，然后進行發(fā)光，顯影，定影，電腦觀察蛋白質條帶，并成像記錄，計算灰度值。

2 結果

2.1 各組一般資料比較 3組初始體重、初始身長、終末身長以及空腹血糖、總膽固醇水平差異無統(tǒng)計學意義(P均gt;0.05)，去卵巢組血清甘油三酯水平、終末體重顯著高于假手術組(P均lt;0.05)，而去卵巢組和OVX +E2組間終末體重差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)；與假手術組相比，去卵巢組內(nèi)臟脂肪指數(shù)、血清LDL-C水平顯著升高，而血清HDL-C水平顯著降低(Plt;0.05)；與去卵巢組相比，OVX +E2組內(nèi)臟脂肪指數(shù)、血清LDL-C水平顯著降低，而血清HDL-C水平顯著升高(Plt;0.05)，見表2。

2.2 血清瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α水平比較 3組血清瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素水平的差異無統(tǒng)計學意義(P均gt;0.05)，去卵巢組TNF-α水平顯著高于假手術組(F=4.785，Plt;0.05)，見表3。

2.3 內(nèi)臟脂肪組織脂肪因子免疫組化染色結果 免疫組化顯示，瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α均在脂肪細胞胞質表達，棕黃色顆粒散在分布，細胞核內(nèi)幾乎沒有表達。圖像掃描分析顯示，與假手術組相比，去卵巢組內(nèi)臟脂肪組織中瘦素表達顯著顯減弱，而脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α表達顯著增強；與去卵巢組相比，OVX +E2組內(nèi)臟脂肪組織中瘦素表達顯著增強，而脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α顯著減弱(F=3.712～5.198，P均lt;0.05)，見圖1(封3)。

2.4 實時熒光定量PCR結果 3組內(nèi)臟脂肪組織瘦素mRNA表達水平差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)；去卵巢組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的mRNA表達水平顯著高于假手術組，而OVX+E2組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的mRNA表達水平顯著低于去卵巢組(P均lt;0.05)；OVX+E2組與假手術組間各指標的差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)，見表4。

表2 3組大鼠一般資料的比較

注：OVX+E2組: 去卵巢+戊酸雌二醇組；LDL-C：低密度脂蛋白-膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白-膽固醇；與假手術組相比，aPlt;0.05；與去卵巢組相比，bPlt;0.05

表3 3組大鼠血清中瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、TNF-α水平檢測結果比較

注：OVX+E2組: 去卵巢+戊酸雌二醇組；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；與假手術組相比，aPlt;0.05

2.5 Western印跡結果 3組內(nèi)臟脂肪組織瘦素蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(Pgt;0.05)。與假手術組相比，去卵巢組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α蛋白表達水平顯著升高(Plt;0.05)；與去卵巢組相比，OVX +E2組內(nèi)臟脂肪組織脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α蛋白表達水平顯著降低(F=3.175～4.894，P均lt;0.05)，見圖2。

3 討論

有研究認為雌激素及其受體(ER)對脂肪組織的代謝和分布發(fā)揮重要影響，人體皮下和內(nèi)臟脂肪組織均表達ERα和ERβ[6]。其中，ERα在脂肪細胞的活性和脂肪分布的性別差異方面發(fā)揮主要作用。無論雌性還是雄性，ERα基因敲除小鼠均表現(xiàn)為腹型肥胖、嚴重的胰島素抵抗和糖尿病[7-8]。ERα基因多態(tài)性與脂肪組織的堆積，尤其是內(nèi)臟脂肪組織的堆積密切相關[9-10]。雌激素可由ERα介導上調(diào)內(nèi)臟脂肪組織β腎上腺素能受體表達，增強腎上腺素的脂解作用，以減少內(nèi)臟脂肪的堆積。雌激素還可通過下調(diào)脂蛋白脂肪酶的活性，減少脂肪的生成直接，抑制脂肪組織堆積。此外，雌激素通過多個機制影響能量平衡，進而抑制脂肪組織過度積累[11-13]。

表4 3組瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素及TNF-α mRNA表達結果比較

注：OVX+E2組: 去卵巢+戊酸雌二醇組；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；與假手術組相比，aPlt;0.05

注：OVX+E2組: 去卵巢+戊酸雌二醇組；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；與假手術組相比，aPlt;0.05；與去卵巢組相比，bPlt;0.05圖2 3組瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素及TNF-α蛋白表達的比較

同時，脂肪細胞可合成和分泌多種脂肪因子，包括瘦素、脂聯(lián)素、抵抗素、內(nèi)臟脂肪素、TNF-α等，這些因子可通過內(nèi)分泌機制參與食欲和能量平衡的調(diào)節(jié)，影響胰島素敏感性，同時這些因子也可以調(diào)節(jié)脂肪細胞的大小和數(shù)目，通過旁分泌機制參與血管的生成，從而在脂肪量的調(diào)節(jié)中發(fā)揮主要作用[14]。絕經(jīng)后女性循環(huán)雌激素水平與血脂異常、腹型肥胖以及血清瘦素水平呈正相關，與脂聯(lián)素水平呈負相關[15]。提示雌激素可能參與脂肪組織內(nèi)分泌功能的調(diào)控。已有研究表明，雌激素可通過調(diào)控脂肪細胞過氧化物酶體增殖物活化受體γ或炎性因子如一氧化氮、一氧化氮合酶的表達等途徑，進而影響脂肪因子的表達[16]。處于動情周期的動物循環(huán)瘦素水平的波動研究證實，雌激素可刺激脂肪組織瘦素的表達，而拮抗雌激素藥物如他莫西芬則抑制其表達[17-18]。本研究中免疫組化結果顯示，Sprauge-Dawley大鼠去卵巢后內(nèi)臟脂肪組織中瘦素表達明顯減弱，而雌激素替代治療可使其逆轉，提示雌激素可刺激脂肪組織瘦素的表達，但在mRNA和蛋白質水平未得到進一步的印證。另外，雌激素可顯著降低芳香化酶基因敲除鼠血清脂聯(lián)素水平，以及脂肪組織脂聯(lián)素mRNA的表達[19]。去卵巢大鼠循環(huán)脂聯(lián)素和抵抗素水平顯著升高，而雌激素替代治療也可使其逆轉[20-22]。本研究也證實，Sprauge-Dawley大鼠去卵巢后內(nèi)臟脂肪細胞脂聯(lián)素和抵抗素的表達顯著增強，而雌激素替代治療可降低其表達，與上述研究一致。

芳香化酶基因敲除鼠脂肪組織TNF-α mRNA表達顯著升高，而雌激素替代治療可進一步升高芳香化酶基因敲除鼠脂肪組織TNF-α mRNA表達[19]。但本研究與上述研究正好相反，雌激素替代治療可逆轉去卵巢大鼠內(nèi)臟脂肪細胞TNF-α的高表達。本研究血清學檢測未發(fā)現(xiàn)3組大鼠瘦素、脂聯(lián)素和抵抗素存在顯著差異，僅發(fā)現(xiàn)去卵巢組TNF-α水平顯著升高，而雌激素替代治療后有所下降，但未達統(tǒng)計學顯著意義，分析可能是由于血清脂肪因子水平反映機體總體脂肪組織脂肪因子分泌水平，而皮下脂肪組織和內(nèi)臟脂肪組織脂肪因子的表達可能存在差異[24]。未來將進一步研究這種差異及其對體脂分布的影響。

綜上所述，去卵巢大鼠內(nèi)臟脂肪細胞脂聯(lián)素、抵抗素和TNF-α的表達顯著增強，而雌激素替代治療可逆轉其高表達，提示雌激素可通過調(diào)控內(nèi)臟脂肪細胞脂肪因子的合成和分泌，進而影響去卵巢大鼠脂肪再分布。

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Effectsofestrogenontheexpressionofadipokinesinvisceralfatcellsinovariectomizedrats

TianQingwu*,SunShukai,ZhaiYu′e,ZhaoPeng,ZhaoHan,ShenJingli,ZhaiMuxu.

DepartmentofLaboratory,TheAffiliatedHospitalofQingdaoUniversity,Qingdao266555,China

Correspondingauthor：ZhaiMuxu,Email:mxzhai@163.com

ObjectiveTo observe the effects of estrogen on the expression of leptin, adiponectin, resistin and tumor necrosis factor-α(TNF-α) in visceral fat cells in ovariectomized rats and to investigate the mechanism of estrogen on body fat distribution.MethodsA total of 30 female Sprauge-Dawley(SD) rats (6 weeks) were divided into three groups by random number table method: sham operation group, ovariectomy group and ovariectomy combined with estrogen treatment group (OVX+E2group), with 10 rats in each group. One week after surgery, rats in OVX+E2group were gavaged with estradiol valerate (1 mg/kg) whereas rats in the other groups were gavaged with the same volume of distilled water per day for 12 weeks. Blood was obtained from abdominal aorta, and then the visceral adipose tissue was quickly removed. Blood glucose and lipids were measured by full automatic biochemical analyzer. Expression of leptin, adiponectin, resistin and TNF-α were detected by immunocytochemichal staining, real-time fluorescence quantitative RT-PCR and Western blotting, respectively.ResultsThere were no significant differences in serum leptin, adiponectin and resistin among three groups(allPgt;0.05), but serum TNF-α was significantly higher in ovariectomy group than that in sham operation group (F=4.785，Plt;0.05). Immunohistochemical staining showed that the expression of leptin in visceral adipose tissue of ovariectomy group was significantly decreased, and adiponectin, resistin and TNF-α were increased greatly compared with those in sham operation group. The expression of leptin was enhanced, whereas expression of adiponectin, resistin and TNF-α were significantly decreased in OVX+E2group compared with those in ovariectomy group(F=3.712-5.198, allPlt;0.05).There were no significant differences in leptin mRNA and protein expression in visceral adipocyte among three groups(allPgt;0.05). The mRNA and protein of adiponectin, resistin and TNF-α were significantly higher in visceral fat cells of OVX+ E2group than those of sham operation group, and were significantly lower in visceral fat cells of OVX+E2group compared with those of ovariectomy group(F=3.175-5.342, allPlt;0.05).ConclusionEstrogen affects the redistribution of body fat in ovariectomized rats through downregulating the expression of adiponectin, resistin and TNF-α in visceral fat cells．

Ovariectomy； Adipose tissue； Adipokine

青島經(jīng)濟技術開發(fā)區(qū)重點科技發(fā)展計劃項目(2013-1-83)

10.3760/cma.j.issn.1673-4157.2016.06.04

266555 青島大學附屬醫(yī)院檢驗科(田清武，孫樹凱，翟玉娥，趙鵬，申井利)，病理科(趙涵)；255000 淄博市婦幼保健院內(nèi)分泌科(翟木緒)

翟木緒，Email: mxzhai@163.com

FundprogramKey Science and Technology Development Project of Qingdao Economic and Technological Development Zone(2013-1-83)

2015-12-15)