瀘寧雞MyoD基因的克隆及生物信息學(xué)分析

龔靜+林森+徐亞歐+賀慶華+林亞秋

摘要：為了研究MyoD基因在雞生長(zhǎng)發(fā)育與肉質(zhì)形成中的作用，以瀘寧雞為研究對(duì)象，采用RT-PCR技術(shù)克隆MyoD基因序列，并利用生物信息學(xué)的方法，對(duì)其氨基酸同源性、理化性質(zhì)等進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。結(jié)果表明：瀘寧雞MyoD基因序列長(zhǎng)度為988 bp，其編碼的蛋白含299個(gè)氨基酸殘基，具有堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)（bHLH）；根據(jù)MyoD基因比對(duì)，構(gòu)建的進(jìn)化樹顯示瀘寧雞與人等哺乳動(dòng)物的同源性為63%～67%，與原雞、綠頭鴨、游隼的同源性為94%～99%。

關(guān)鍵詞：MyoD基因；基因克隆；瀘寧雞；生物信息學(xué)

中圖分類號(hào)： S831.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2016）09-0053-05

自Davis等首次對(duì)人類生肌決定因子（myogenic determining factor，MyoD）進(jìn)行克隆以來，生物學(xué)家對(duì)該基因的結(jié)構(gòu)特征及生物學(xué)功能產(chǎn)生了濃厚興趣[1]；MyoD在肌肉生成早期分化過程中和成肌細(xì)胞增殖階段進(jìn)行表達(dá)，主要參與生肌過程[2]，具有決定肌衛(wèi)星細(xì)胞能否成為肌肉干細(xì)胞的功能，并控制著整個(gè)肌肉的發(fā)育過程[3-5]，屬于初級(jí)生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）。由于MyoD基因產(chǎn)物在多種分化細(xì)胞向肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過程中扮演了重要角色，因此，近年來在動(dòng)物肉質(zhì)改良育種工作中，對(duì)該基因的研究成為熱點(diǎn)。對(duì)于成年動(dòng)物而言，MyoD基因可以調(diào)節(jié)控制肌細(xì)胞的增殖、分化和肌肉組織的增生[6]。Akizawa等學(xué)者研究表明，MyoD可與肌球蛋白、肌細(xì)胞生成素及肌酸激酶CK等基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合，正調(diào)控骨骼肌的生長(zhǎng)發(fā)育[7-8]。Liu在研究火雞胚胎發(fā)育時(shí)發(fā)現(xiàn)，隨著火雞的胚胎發(fā)育，MyoD的mRNA表達(dá)量呈顯著下降趨勢(shì)[9]。Gayraud-Morel等學(xué)者指出了，MyoD和Myf5表達(dá)量在成年動(dòng)物的骨骼肌發(fā)育有關(guān)[6]。國(guó)外學(xué)者Powell等、國(guó)內(nèi)學(xué)者李娟等研究發(fā)現(xiàn)，營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)動(dòng)物肌衛(wèi)星細(xì)胞的分裂活性以及肌肉發(fā)育有重要影響，并且賴氨酸、蛋氨酸、胱氨酸及亮氨酸的濃度與MyoD蛋白表達(dá)水平有著正相關(guān)關(guān)系[10-16]，以上均表明MyoD在動(dòng)物肌肉生長(zhǎng)中具有不可或缺的調(diào)控作用。

基于上述研究，對(duì)MyoD的功能研究顯得尤為重要，但目前研究多集中于豬、牛、山羊等動(dòng)物[17-21]，而關(guān)于禽類MyoD基因特征研究報(bào)道相對(duì)較少，并尚未見在瀘寧雞的研究中報(bào)道。瀘寧雞作為四川涼山州肉蛋兼用型的優(yōu)質(zhì)地方養(yǎng)殖雞種，胸腿肌占胴體質(zhì)量比例較大，耐粗飼，抗病力強(qiáng)，是一個(gè)有發(fā)展前途的地方良種雞[22]。因此，本研究以瀘寧雞為研究對(duì)象，通過克隆MyoD基因，并分析其基因及編碼蛋白特征，探討MyoD基因在瀘寧雞生長(zhǎng)、發(fā)育過程中的作用具有實(shí)際的理論和應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑

試驗(yàn)用的瀘寧雞采自四川省涼山州冕寧縣原生農(nóng)業(yè)有限公司，屠宰后迅速采其肌肉組織樣品置于液氮中以備用；主要試劑為：Taq酶及DH5α感受態(tài)細(xì)胞[天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品]，轉(zhuǎn)化載體pMD19-T及反轉(zhuǎn)錄試劑盒（大連TaKaRa），Trizol試劑（Invitrogen公司），膠回收試劑盒（博大泰克生物技術(shù)有限公司）。

1.2 MyoD基因引物的設(shè)計(jì)與合成

依據(jù)原雞的MyoD基因序列（GenBank中登錄號(hào)為NP_989545.2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增ORF的上、下游引物（設(shè)計(jì)軟件為Premier 5.0）[PF（上游），5′-ACCGCCATCTCACCCCACTC-3′；PR（下游），5′-TGGCTGAACGGAGCAATTTGTT-3′]，送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 瀘寧雞MyoD基因克隆

瀘寧雞肌肉組織樣中的總RNA提取辦法參考梅寒等在瀘寧雞MyoG基因克隆中的辦法[23]。經(jīng)分光光度儀檢測(cè)，將質(zhì)量符合要求的瀘寧雞總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，25 μL反應(yīng)體系包括：PF和PR各1 μL，cDNA1 μL，9.5 μL滅菌去離子水，最后加Taq酶12.5 μL。其反應(yīng)條件分別為：在94 ℃溫度下預(yù)變性5 min；94 ℃30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s 35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。膠回收，凝膠電泳檢測(cè)得到目的條帶產(chǎn)物，連接于pMD-19T載體（溫度為16 ℃，時(shí)間為45 min），轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞（DH5α），提取經(jīng)篩選得到陽(yáng)性克隆質(zhì)粒，送Invitrogen公司測(cè)序。

1.4 瀘寧雞MyoD基因氨基酸殘基序列分析

克隆測(cè)序所得的MyoD序列經(jīng)軟件拼接并翻譯成相應(yīng)氨基酸序列（DNAman軟件），并利用該軟件對(duì)比分析瀘寧雞與其他物種之間的同源關(guān)系，制作進(jìn)化樹。利用上述翻譯得到的蛋白質(zhì)氨基酸殘基序列，通過在線軟件（www.expasy.org）分析MyoD蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)等理化性質(zhì)，通過在線軟件（www.cbs.dut.dk/servcs/）對(duì)其信號(hào)肽序列、蛋白磷酸化位點(diǎn)、N-糖基化位點(diǎn)及O-糖基化位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA提取結(jié)果

利用上述方法提取到瀘寧雞肌肉組織樣中的總RNA。由圖1可知，雖然5S較淺，但容易分辨出28S、18S，條帶非常清楚，說明瀘寧雞的總RNA提取是比較完整的。再用分光光度儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)D260 nm/D280 nm的值介于1.8～2.0，表明提取的瀘寧雞總RNA純度符合進(jìn)一步試驗(yàn)的要求。

2.2 瀘寧雞MyoD基因cDNA的克隆

由圖2可知，瀘寧雞MyoD基因采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增獲得長(zhǎng)度為988 bp的特異性條帶，得到的核苷酸及推測(cè)出對(duì)應(yīng)的氨基酸殘基序列。位于40 bp位點(diǎn)的ATG作為MyoD cDNA的起始密碼子，其終止密碼子居于937 bp處，整個(gè)序列包括完整的開放閱讀框（ORF）共編碼299個(gè)氨基酸，其中核苷酸序列的堿基組成分別為A=23.4%、T=15.4%、C=33.8%、G=27.3%。

2.3 瀘寧雞MyoD蛋白保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

由圖3可知，經(jīng)DNAman軟件處理克隆得到988 bp長(zhǎng)度的瀘寧雞MyoD基因序列，得到1個(gè)由299個(gè)氨基酸殘基組成的一級(jí)結(jié)構(gòu)編碼序列，該序列清楚地反映MyoD蛋白具有保守的堿性螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)區(qū)域（basic helix-loop-helix，bHLH）。

根據(jù)SMART軟件（http：//smart.embl-heidelberg.de/）預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，瀘寧雞MyoD蛋白包括2個(gè)低組分復(fù)雜性區(qū)域（從196～208個(gè)氨基酸，從220～231個(gè)氨基酸） 和1個(gè)b-HLH 結(jié)構(gòu)域（螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)域，從107～158個(gè)氨基酸）。

2.4 蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

通過在線軟件NPSA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_gor4.html）分析結(jié)果推測(cè)瀘寧雞MyoD蛋白具有的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖4），結(jié)果顯示，瀘寧雞MyoD編碼的蛋白中含299個(gè)氨基酸殘基，其中58 個(gè)（19.40%）氨基酸殘基可能形成α-螺旋（h），34個(gè)（11.37%）氨基酸殘基可能形成延伸鏈，207個(gè)（69.23%）氨基酸殘基可能形成無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)（c）。用在線軟件Swiss model預(yù)測(cè)MyoD蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白為螺旋-環(huán)-螺旋二聚體，這與上面蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果是一致的。

2.5 蛋白理化性質(zhì)分析

在線（http：//web.expasy.org/protparam/）分析結(jié)果表明，瀘寧雞MyoD蛋白分子式為C1409H2198N422O468S19，包括299個(gè)氨基酸殘基，其中帶負(fù)電荷的谷氨酰胺（Glu）殘基和天冬酰胺（Asp）殘基總共為41個(gè)，帶正電荷的精氨酸（Arg）殘基和賴氨酸（Lys）殘基總共為30個(gè)。由此可以看出，MyoD蛋白中負(fù)電荷氨基酸殘基總數(shù)多于正電荷，可推定該蛋白可能帶負(fù)電荷。其分子質(zhì)量33.15 ku，結(jié)合不穩(wěn)定系數(shù)為69.54，理論等電點(diǎn)為5.74，平均疏水指數(shù)為-0.787。

2.6 蛋白磷酸化與糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果分析

通過在線預(yù)測(cè)軟件（http：//www.cbs.dtu.dk/）對(duì)MyoD蛋白氨基酸序列進(jìn)行磷酸化位點(diǎn)及糖基化位點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果[KG*8]發(fā)現(xiàn)具有32個(gè)磷酸化位點(diǎn)及17個(gè)糖基化位點(diǎn)，其中含有22個(gè)絲氨酸（Ser） 磷酸化位點(diǎn)、5有個(gè)蘇氨酸（Thr） 磷酸化位點(diǎn)、5個(gè)酪氨酸（Tyr） 磷酸化位點(diǎn)、3個(gè)N-糖基化位點(diǎn)及14個(gè)O-糖基化位點(diǎn)。

2.7 蛋白質(zhì)疏水性分析

采用 ExPASy 軟件工具的 ProtScale 程序（http：//web.expasy.org/protscale/）推測(cè)瀘寧雞MyoD基因所編碼蛋白的親水、疏水性。結(jié)果顯示，最強(qiáng)疏水性位于第89位氨基酸處，其值為1.544；最強(qiáng)親水性位于第56位氨基酸處，其值為-2.989。按分值大?。⊿core>1.5）劃分發(fā)現(xiàn)，具有極少的疏水性序列，但親水性高的區(qū)域具有多個(gè)，大部分氨基酸屬于親水性氨基酸，這與理化性質(zhì)中的預(yù)測(cè)結(jié)果相一致。

2.8 蛋白信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)分析

通過軟件TargetP和TMHMM在線進(jìn)行在線推測(cè)發(fā)現(xiàn)，瀘寧雞MyoD蛋白不具備信號(hào)肽及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)存在的條件（http：//www.cbs.dtu.dk/services/）。

2.9 蛋白亞細(xì)胞定位及蛋白相互作用分析

通過PSORT Ⅱ 預(yù)測(cè)，該蛋白主要在核（87.0%）、細(xì)胞質(zhì)（8.7%）和細(xì)胞骨架（17.4%）上發(fā)揮生物學(xué)作用。

由圖5可知，利用STRING交互式數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索MyoD蛋白相互作用，條件限制在10個(gè)蛋白以內(nèi)。搜索結(jié)果表明，MyoD蛋白（即圖5中的MyoD1蛋白）可能和SMAD3、TCF3、MEF2A、MYH1、PAX7、MYB、KAT2A、KAT2B、MEF2C、MEF2D等10個(gè)蛋白存在相互作用。

2.10 瀘寧雞MyoD基因及其編碼氨基酸序列與其他物種同源性的對(duì)比分析

通過GenBank中登錄的禽類及其他物種的氨基酸序列與瀘寧雞MyoD蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源性對(duì)比分析（表1）及構(gòu)建物種間進(jìn)化樹進(jìn)行聚類分析（圖6）可知，瀘寧雞與其他禽類的MyoD基因有較高的同源性，與人、豬等哺乳動(dòng)物的同源性較低。

3 結(jié)論與討論

自人類發(fā)現(xiàn)并克隆MyoD基因[1]以來，生物學(xué)家對(duì)MyoD基因的研究從未停止。Charge等在研究中發(fā)現(xiàn)，MyoD基因在肌肉發(fā)育初對(duì)成肌前體細(xì)胞能否轉(zhuǎn)化成肌肉細(xì)胞具有主宰作用，并且能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)化成的肌肉細(xì)胞增殖[24]。Tapscott 等通過將小鼠的MyoD基因轉(zhuǎn)入成纖維細(xì)胞試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞在MyoD基因誘導(dǎo)下出現(xiàn)了成肌作用，證實(shí)MyoD與肌肉發(fā)育兩者之間確實(shí)存在關(guān)聯(lián)[25]。MyoD基因相對(duì)于其他生肌調(diào)節(jié)因子 （myogenic regulatory factors，MRFs）而言， 在肌肉細(xì)胞系的分化過程中、骨骼肌成肌形成時(shí)、脊椎動(dòng)物胚胎期肌肉發(fā)育期均起到關(guān)鍵作用，該基因缺失可直接致使成肌細(xì)胞的增殖和分化無法順利完成[26-28]。因此，對(duì)瀘寧雞MyoD基因進(jìn)行研究可在瀘寧雞的育種工作中，為改善瀘寧雞生長(zhǎng)速度和肉質(zhì)品質(zhì)等后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

本研究克隆得到長(zhǎng)度為988 bp的瀘寧雞MyoD基因片段，其核苷酸序列堿基組成中GC含量約為61.1%，數(shù)值較高，容易推測(cè)該基因DNA密度較高，并具有熱與堿均不易使之變性的較高穩(wěn)定性。該基因共編碼的299個(gè)氨基酸中含有2個(gè)低組分復(fù)雜性區(qū)域和1個(gè)b-HLH結(jié)構(gòu)域，這與生肌調(diào)節(jié)因子（MRFs）家族的結(jié)構(gòu)特征具有一致性[29]。在肌肉發(fā)生過程中，MyoD基因與其他3個(gè)生肌調(diào)節(jié)因子一起各自發(fā)揮著不同的調(diào)節(jié)、控制作用[30]。

在線預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，磷酸化位點(diǎn)共有32個(gè)，糖基化位點(diǎn)17個(gè)。由此推定，MyoD蛋白在骨骼肌生長(zhǎng)發(fā)育中所起的開關(guān)作用在一定程度上與這些位點(diǎn)有著緊密的關(guān)系。通過TargetP 和TMHMM推測(cè)可知，瀘寧雞MyoD蛋白不具有信號(hào)肽及跨膜螺旋結(jié)構(gòu)，由此可推定該基因蛋白質(zhì)類型應(yīng)為非分泌型。

瀘寧雞MyoD基因編碼的氨基酸序列與人等哺乳動(dòng)物、雞等禽類動(dòng)物及斑馬魚等魚類的同源性為63%～99%，說明MyoD基因在不同的物種中作用方式可能存在一定差異[31]，保守性不算太高。進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，該研究中瀘寧雞與雞、游隼、綠頭鴨的親源關(guān)系較近，與人、豬等哺乳動(dòng)物的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類和生化特征分類的進(jìn)化地位是相吻合的，表明MyoD在用于物種與物種間的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系分析中具有一定的價(jià)值。

本試驗(yàn)對(duì)該基因編碼的蛋白分子性質(zhì)主要是通過生物信息學(xué)進(jìn)行預(yù)測(cè)的，仍須通過試驗(yàn)對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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