菌渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料的工藝優(yōu)化

張婷婷+馬磊

摘要：為了綜合利用菌渣廢棄物，采用酵母菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵技術，探究將食用菌多糖提取廢渣轉化為蛋白飼料的工藝條件。從不同基質、溫度、水料比、發(fā)酵時間4個方面，分析影響固態(tài)發(fā)酵菌渣轉化蛋白的因素，并通過正交試驗優(yōu)化菌渣固態(tài)發(fā)酵工藝。結果表明，影響蛋白質含量的主次因素依次為基質配比>發(fā)酵時間>溫度>水料比；在酵母菌接種量13%條件下，菌渣與麩皮的適宜質量比8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培養(yǎng)96 h，此時發(fā)酵物的粗蛋白含量可達峰值18.43%。本研究將廢棄菌渣轉化高蛋白的方法，可促進菌渣的再利用，為高效資源循環(huán)使用奠定基礎。

關鍵詞：菌渣，固態(tài)發(fā)酵，蛋白飼料，正交設計

中圖分類號： S816.4 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2016）09-0270-02

菌渣廢棄物一般富含水分、易腐爛、不易保存，直接排放污染環(huán)境。隨著經(jīng)濟的快速發(fā)展和人們生活水平日益提高，畜牧產(chǎn)品需求增大，致使飼料缺口逐年增加，出現(xiàn)了供求關系難以平衡的局面[1]。因而，尋求新蛋白源成為飼料科學中的一項重要課題[2]。目前，運用微生物發(fā)酵生產(chǎn)蛋白飼料越來越受重視[3-4]。本研究探討不同基質配比、不同溫度、不同料水比以及不同培養(yǎng)時間對酵母菌發(fā)酵蛋白質含量的影響，并在單因素試驗的基礎上，采用正交試驗法對菌渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料的工藝進行優(yōu)化。

1 材料與方法

1.1 材料

酵母菌、提取金頂側耳菌菇多糖后殘留菌渣、麩皮、馬鈴薯浸取液、葡萄糖、瓊脂粉、玉米粉、濃硫酸、硫酸鉀、硫酸銅、40 % NaOH溶液、HCl溶液、混合滴指示劑（0.1%甲烯藍 ∶0.1% 甲基紅=1 ∶4）。

1.2 方法

1.2.1 基礎培養(yǎng)基的制備

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：自制馬鈴薯浸取液1.0 L，加入瓊脂粉15.0 g，葡萄糖20.0 g，121 ℃滅菌25 min后，取出斜面放置，冷卻備用。

固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基：分別以菌渣、菌渣+麩皮、菌渣+玉米粉為培養(yǎng)基基質，添加一定量的水分、配制成用于考察水料質量比（簡稱水料比）、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間對發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量影響的不同培養(yǎng)基，于121 ℃滅菌25 min 。

1.2.2 菌種的活化

在無菌條件下，將酵母菌種接種到PDA斜面培養(yǎng)基上，放置恒溫箱內(nèi)，在30 ℃下恒溫培養(yǎng)，活化72 h，得到優(yōu)質菌種。

1.2.3 液體種子培養(yǎng)

在無菌條件下，用10 mL無菌水沖洗斜面培養(yǎng)基上已活化的菌種，接種至盛有80 mL 液體種子培養(yǎng)基的三角燒瓶中，置于搖床中，在30 ℃、160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)72 h。

1.2.4 固體發(fā)酵培養(yǎng)

在無菌條件下，將酵母菌以13% 的接種量接種到已滅菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基中，置于25～40 ℃恒溫箱中培養(yǎng)72 h。待培養(yǎng)結束后，將培養(yǎng)物置于50 ℃烘箱中風干，測粗蛋白質含量?；A對照為未發(fā)酵樣品，將試驗所用的金頂側耳菌菇多糖提取后的殘渣在50 ℃條件下烘干，隨機稱取0.2 g未經(jīng)酵母菌發(fā)酵樣品，測定其蛋白質含量。

1.2.5 粗蛋白質含量的測定

采用微量凱氏定氮法測定粗蛋白質含量。將發(fā)酵好的培養(yǎng)基烘干至恒質量，稱取0.2 g烘干后的培養(yǎng)基，放入干燥的消化管中，再加入0.4 g的混合催化劑后，加入20 mL 的濃硫酸。待消化管中液體冷卻后，加入蒸餾水20 mL，進行蒸餾，在接收瓶中加入2% H3BO350 mL 和2～3滴指示劑，用0.05 mol/L HCl 滴定接收瓶內(nèi)的溶液，滴定溶液由綠色變成淡紫色或灰色時為滴定終點，記下消耗HCl的體積（mL），計算粗蛋白質含量。

1.2.6 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗法對基質配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時間這4個影響因素進行優(yōu)化，每組試驗重復3次，正交試驗因素水平見表1。

2 結果與分析

本研究探討了不同基質配比、不同溫度、不同水料比以及不同培養(yǎng)時間對酵母菌發(fā)酵蛋白質含量的影響，并在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗法對基質配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時間4個因素進行優(yōu)化。

2.1 不同基質配比對粗蛋白含量的影響

由圖1可知，優(yōu)化后的蛋白含量顯著高于未發(fā)酵樣品的蛋白含量（7.8%）。在1 mL ∶2.5 g的水料比、13% 接種量、30 ℃培養(yǎng)96 h條件下，不同基質配比所獲蛋白質含量呈現(xiàn)顯著差異。當菌渣與麩皮以質量比9 ∶1的比例混合時，粗蛋白質含量可達最高值（18.3%），與純菌渣組和質量比9 ∶1菌渣玉米粉組呈現(xiàn)顯著差異。這可能是因為在培養(yǎng)基的發(fā)酵體系中，麩皮含有較豐富的營養(yǎng)組分，其所含糖分、蛋白質、維生素和礦物質等都是菌種發(fā)酵所必需的物質。因此，添加麩皮有利于菌體生長。同時，麩皮質地粗糙，能增強物料通透性，促進菌生長。添加玉米粉的培養(yǎng)基，粗蛋白質含量增加不明顯，僅為12.1%，這可能是由于玉米粉顆粒較細，易使培養(yǎng)基黏性大、結塊、通透性差，從而不利于菌體生長。

2.2 不同溫度對粗蛋白含量的影響

圖2顯示，在1 mL ∶2.5 g的水料比、13%接種量、菌渣和麩皮質量比9 ∶1、培養(yǎng)96 h的條件下，不同溫度下所獲蛋白質含量呈顯著差異。蛋白質含量隨溫度升高而增加，當溫度為30 ℃ 時，蛋白質含量達最高值，30 ℃也是酵母菌體較為適宜的生長溫度。當溫度升至35 ℃時，蛋白質含量開始隨溫度升高而降低，這可能是由于溫度過高，加快了發(fā)酵物的水分蒸發(fā)，造成了不利于菌體生長的環(huán)境，從而降低蛋白質含量。

2.3 不同水料比對粗蛋白含量的影響

菌體的生長需要適宜的水分，固態(tài)發(fā)酵物料中的含水量是影響蛋白質產(chǎn)量的重要因素之一。由圖3可知，在菌渣和麩皮質量比9 ∶1、13%接種量、30 ℃培養(yǎng)96 h條件下，不同水料比會使蛋白質含量呈顯著現(xiàn)差異。水料比為1 mL ∶1.0 g時，粗蛋白含量最低，僅有10.8%；當水料比為1 mL ∶2.5 g時，粗蛋白質含量高達17.7%；當水料比為1 mL ∶3.0 g時，粗蛋白量降低至15.3%?；|水分過多，培養(yǎng)基易黏結，多孔性降低，通透性削弱，基質易變質，雜菌易污染；含水量過低，則會降低培養(yǎng)基的膨脹程度，妨礙菌體利用基質營養(yǎng)，從而影響菌體生長，導致菌體生長不完全，蛋白質含量低。

2.4 不同發(fā)酵時間對粗蛋白含量的影響

由圖4可知，在1 mL ∶2.5 g的水料比、菌渣和麩皮質量比9 ∶1、13%接種量、30 ℃培養(yǎng)條件下，不同發(fā)酵時間下蛋白質含量呈現(xiàn)顯著差異。發(fā)酵初始，粗蛋白含量隨時間增加而增長，當發(fā)酵 96 h 時粗蛋白含量高達 17.6%；隨著發(fā)酵時間延長至120 h，蛋白質含量降低至15.7%。由此可見，當發(fā)酵24 h時，菌體沒有達到完全生長，隨著時間的延續(xù)，菌體逐漸成熟。在發(fā)酵96 h時，菌體生長最佳。發(fā)酵120 h后，菌體有可能已經(jīng)完成了生長周期，表現(xiàn)出衰退或死亡的現(xiàn)象，并引起菌體的自溶現(xiàn)象，從而降低粗蛋白含量。

2.5 固態(tài)發(fā)酵條件的正交優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，采用L9（34）正交試驗法對基質配比、溫度、水料比以及培養(yǎng)時間這4個影響因素進行優(yōu)化，結果見表2。極差分析結果顯示，影響粗蛋白含量影響因素主次順序分別為基質配比>發(fā)酵時間>溫度>水料比；方差分析結果也顯示，基質配比是影響粗蛋白含量的主要因素。固體發(fā)酵菌渣蛋白飼料工藝中的最優(yōu)組合為A3B2C1D3，即在酵母菌接種量13%條件下，菌渣 ∶麩皮質量比為8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培養(yǎng)96 h，發(fā)酵物的粗蛋白含量可達18.43%。

3 結論與討論

本研究分析了固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料的生產(chǎn)工藝，研究各因素對蛋白質含量影響的主次順序，并通過正交試驗優(yōu)化菌渣固態(tài)發(fā)酵菌體蛋白飼料工藝。試驗結果表明，影響蛋白質含量的主次因素依次為基質配比、發(fā)酵時間、溫度、水料比。在酵母菌接種量13%條件下，菌渣 ∶麩皮質量比為8 ∶2、水料比1 mL ∶2.5 g、30 ℃下培養(yǎng)96 h，發(fā)酵物的粗蛋白含量可達峰值（18.43%）。

本試驗所用菌渣是金頂側耳菌菇多糖提取后的廢料，具有一定水分，易腐爛發(fā)臭，不易保存，如果直接排放會造成環(huán)境污染。菌渣含有比較豐富的營養(yǎng)物質[5]。試驗前測得未經(jīng)固體發(fā)酵的菌渣粗蛋白質含量約為7.8%，條件優(yōu)化后蛋白含量升高到18.43%。因而，以菌渣作為發(fā)酵的主料，再添加一些輔料，采用酵母菌協(xié)同固態(tài)發(fā)酵技術，可將菌殘渣轉化為蛋白含量較高的飼料，能大幅提高飼料的營養(yǎng)價值，從而建立高效的資源循環(huán)再利用系統(tǒng)。

參考文獻：

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