黃春麗，張德芹，張青霞，文靜

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津300193）

·實驗研究·

和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮形態(tài)及細胞凋亡的影響*

黃春麗，張德芹，張青霞，文靜

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津300193）

[目的]研究和顏坤泰膠囊對卵巢去勢模型大鼠子宮形態(tài)及細胞凋亡的影響。[方法]以雌性去勢大鼠為動物模型，分為空白對照組，假手術組，模型組，補佳樂組，莉芙敏組，和顏坤泰膠囊8、4、2 g生藥/kg劑量組。給藥8周后，觀察藥物對子宮病理學的影響，檢測子宮細胞凋亡率及Bcl－2 mRNA、Bax mRNA和蛋白的表達。[結果]和顏坤泰膠囊可增加去勢大鼠子宮橫截面及壁厚，肌層面積及厚度，內(nèi)膜面積及厚度，上皮厚度和腺體數(shù)（P＜0.01，P＜0.05）；能降低去勢大鼠子宮細胞的凋亡率（P＜0.01，P＜0.05），升高子宮Bcl－2 mRNA和蛋白的表達（P＜0.01，P＜0.05），降低Bax mRNA和蛋白的表達（P＜0.01，P＜0.05）。[結論]和顏坤泰膠囊有一定的子宮營養(yǎng)作用，可通過調(diào)控Bcl－2和Bax基因與蛋白的表達來抑制子宮細胞的凋亡。

和顏坤泰膠囊；子宮形態(tài)學；細胞凋亡；Bcl－2 mRNA和蛋白；Bax mRNA和蛋白

更年期綜合征（CLS）是指婦女在絕經(jīng)前后由于卵巢功能衰退的內(nèi)分泌變化所引起的各器官系統(tǒng)的綜合證候群[1]，是女性特定階段的常見病和多發(fā)病，嚴重影響了更年期婦女的生活質量[2]。中醫(yī)藥治療更年期綜合征在臨床已開展多年[3－5]，除能顯著地改善臨床癥狀外，還有不良反應小的優(yōu)勢。目前用于研究更年期綜合征動物模型較多，卵巢去勢模型是其中一種較為經(jīng)典的動物模型，通過摘除卵巢切斷雌激素的來源造成雌激素低下的環(huán)境模擬更年期[6]，在圍絕經(jīng)期病癥模型的研究中用途較廣[7]。和顏坤泰膠囊由熟地黃、黃連、白芍、黃芩、阿膠、茯苓6味藥物組成，功能滋陰清熱、安神除煩，臨床用于治療更年期綜合征取得了良好的效果[8－9]。張紹芬、段燕康等[10－11]已做了和顏坤泰膠囊對更年期大鼠的部分基礎藥效學研究，實驗結果顯示和顏坤泰膠囊可調(diào)節(jié)雌激素水平明顯改善更年期各種癥狀，但其作用機制尚不明確。本課題組前期實驗表明和顏坤泰膠囊可較明顯的提高卵巢去勢大鼠的子宮系數(shù)，本實驗以卵巢去勢大鼠為更年期模型，通過對去卵巢大鼠子宮形態(tài)及細胞凋亡的檢測，從子宮細胞凋亡方面探討和顏坤泰膠囊治療更年期綜合征的作用機制，以期為其臨床應用提供更多實驗依據(jù)。

1　材料與儀器

1.1動物雌性SD大鼠，體質量（200±20）g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動物合格證編號：SCXK（京）2002－0003。實驗前1周飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學實驗動物中心，自由飲食，溫度18～22℃。

1.2藥物和顏泰膠囊：貴陽新天藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品，批號130107；莉芙敏：德國夏普天然藥物制藥公司產(chǎn)品，批號200801；補佳樂：DELPHARM LilleS.A.A生產(chǎn)，由拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司分包裝，批號074A。

1.3試劑與儀器Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號66008）；anscriptorFirststrandcDNASynthesisKit（美國Applied Biosystems公司，批號10274023）；BR Green PCR Master Mix（美國Applied Biosystems公司，批號11226200）；引物合成（上海生工生物工程股份有限公司合成）；Tunel試劑盒（Roche in situ cell death detection kit cat，批號11684817910）；Bcl－2抗體（ABCAM公司，批號AB7973）；Bax抗體（ABCAM公司，批號AB7977）；二抗（DAKO公司，批號K5007）；DBA顯色試劑盒（DAKO公司，批號K5007）。

ALLEGRA－64R高速離心機（美國Molecular Devices公司），PC－1000 PCR逆轉錄儀（美國PERKIN ELMER公司），CFX96型Real－Time PCR儀（美國Bio－Red公司），BMJ－1生物組織包埋機（天津航空機電公司），ASP300S全自動封閉脫水機（LEICA公司），RM2135病理切片機（LEICA公司）。見表1。

表1　PCR引物序列Tab.1　Sequences primers of PCR

2　方法

2.1模型的建立參照文獻[12]卵巢去勢大鼠造模方法，選擇健康雌性SD大鼠64只，體質量（200±20）g，禁食12 h，以3.5%的水合氯醛腹腔注射麻醉，將大鼠俯臥置于固定臺上，從背部最末肋骨下，在腋中線和距脊柱外側約2 cm交叉處，剪除長毛，用安爾碘消毒后切開皮膚和背肌約1.5 cm，切口視野中可見一乳白色發(fā)亮的脂肪團，卵巢即包埋其中，用小鑷子輕輕夾住脂肪團拉出切口外，分離脂肪團，可見一團細線狀不規(guī)則呈黃紅色的卵巢，剪取時先將卵巢下輸卵管（包括脂肪）用細線結扎，再摘除卵巢，術后順勢將子宮角送回腹腔中，用青霉素清洗創(chuàng)口，縫合肌肉及皮膚，同法摘除另側卵巢。留取其中8只大鼠做假手術，方法同上，找出卵巢不摘除。大鼠術后連續(xù)3 d腹腔注射青霉素以防感染。術后第5天開始陰道涂片觀察持續(xù)5 d，每日1次，呈現(xiàn)不規(guī)則動情周期的即為造模成功。

2.2分組及給藥選擇符合模型標準的大鼠48只，按隨機數(shù)字表法分為6組，模型組，補佳樂組，莉芙敏組，和顏坤泰膠囊高、中、低劑量組，以及假手術組和正常組，每組8只。補佳樂組按0.2 mg/kg灌胃給予；莉芙敏組劑量為60 mg生藥/kg；和顏坤泰膠囊高、中、低劑量組分別為：8、4、2g生藥/kg；各組每日灌胃1次，連續(xù)8周，每次用藥體積按每100g體質量灌胃1mL。模型組，假手術組及正常組灌胃等體積的蒸餾水。計算用藥治療期間各組大鼠每日均飼以普通飼料，自由進食、飲水，每周稱質量1次。

2.3標本采集給藥8周后，末次給藥前禁食12 h，給藥1 h后，3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主動脈采血，3 500 r/min，離心15 min，分離血清，分裝凍存?zhèn)溆?；迅速摘除子宮剝離周圍脂肪組織，一半浸入10%福爾馬林溶液，用于病理及免疫組化檢測。一半凍存，用于RT-PCR檢測。

2.4指標檢測

2.4.1子宮病理的檢測取出浸于福爾馬林溶液中的固定好的子宮組織，通過改刀成所需大小，放入包埋盒內(nèi)并做標記，放入全自動封閉脫水機脫水，二甲苯透明，在全自動包埋機上對組織進行石蠟包埋。包埋后的蠟塊進行切片，石蠟切片厚度為4 μm，水浴鍋中伸展，裱于干凈載玻片上，62℃烤片3 h，二甲苯脫蠟10 min，蘇木精-伊紅（HE）染色，中性樹膠封片。利用高倍倒置顯微鏡對所得病理片進行觀察，拍照，用Image-Pru Plus 6.0軟件進行統(tǒng)計。

2.4.2子宮細胞凋亡檢測同上將固定好的子宮組織脫水，包埋，切片后脫蠟至水，用Tunel試劑盒測子宮細胞凋亡率，操作按說明進行，將子宮切片常規(guī)脫蠟至水，滴加末端標記酶及熒光抗體，DAB顯色，蘇木素復染，顯微鏡下檢測細胞凋亡情況（細胞核中有棕黃色顆粒者為陽性細胞，即為凋亡細胞），采用Image-Pro Plus 6.0顯微圖像分析系統(tǒng)掃描后并分析結果，每張切片隨機挑選3個視野，以陽性染色細胞百分比代表細胞凋亡率。

2.4.3子宮Bcl-2和Bax蛋白的檢測切片脫蠟后置入乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復緩沖液（pH8.0）的修復盒中進行抗原修復，放入3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，血清封閉，加一抗，4℃孵育過夜。加二抗，室溫孵育50 min。DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，陽性為棕黃色，自來水沖洗切片終止顯色。蘇木素復染細胞核，鹽酸酒精分化，脫水，中性樹膠封片。每個組織隨機挑選3個高倍鏡下視野進行拍照。應用Image-Pro Plus 6.0軟件對每張照片進行分析得出每張照片陽性面積的比率（陽性面積/總面積）即為陽性面積百分比。

2.4.4子宮Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的檢測采用RT-PCR法檢測，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成序列見表1。取子宮組織，加入1 mL Trizol按說明提取RNA并檢測其濃度與純度，A260/ A280在1.8-2.0即可。按照Transcriptor First strand cDNASynthesis試劑盒說明書進行反轉錄，反應條件：25℃10 min，48℃30 min，95℃5min。聚合酶反應，其中逆轉錄產(chǎn)物0.5 μL，PCR主反應液12.5 μL，上下游引物1 μL，加無酶雙蒸水至總反應體系25 μL，反應條件：95℃10 min，95℃15 s，60℃1 min，40 cycles。以β-actin作為參照基因，用2-△△CT方法計算各基因的相對表達量。

2.5統(tǒng)計學方法實驗結果用SPSS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，結果以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3　結果

3.1和顏坤泰膠囊對去勢大鼠子宮橫截面積和厚度的影響給藥8周后，與正常組相比，模型組大鼠子宮橫截面積和子宮壁厚顯著減?。≒＜0.01）；與模型組相比，和顏坤泰膠囊低劑量組（2g/kg）子宮橫截面積顯著增加（P＜0.05），和顏泰膠囊中、低（4、2 g/kg）劑量組子宮壁厚顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；補佳樂組子宮橫截面積及子宮壁厚顯著增加（P＜0.01）。結果見表2。

表2　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮橫截面和厚度的影響（±s）Tab.2　Effects of Heyan Kuntai capsules on cross-sectional area and thickness in uterus of ovariectomized rats（±s）

表2　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮橫截面和厚度的影響（±s）Tab.2　Effects of Heyan Kuntai capsules on cross-sectional area and thickness in uterus of ovariectomized rats（±s）

注：與正常組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別子宮橫截面積（μm2）子宮壁厚（μm）正常組63 013.98±10 191.80141.26±11.71假手術組49 515.31±6 430.71125.35±8.27模型組17 177.12±4 089.59##73.53±8.74##補佳樂組44 450.66±9 729.71**118.38±13.10**莉芙敏組20 945.88±4 969.7281.21±9.57和顏坤泰高劑量組18 694.62±1 501.1577.11±3.13和顏坤泰中劑量組22 505.78±4 023.7084.43±7.36*和顏坤泰低劑量組24 943.82±2 793.69*89.02±4.92**動物數(shù)劑量（g/kg）8 8 8 8 8 8 8 8－－－0.2×10－30.06 8 4 2

3.2和顏坤泰膠囊對去勢大鼠子宮肌層面積和厚度的影響給藥8周后，與正常組相比，模型組大鼠子宮肌層面積和肌層厚度顯著減?。≒＜0.01）；與模型組相比，和顏坤泰膠囊低劑量組（2g/kg）子宮肌層面積顯著增加（P＜0.05），和顏坤泰膠囊中、低（4、2 g/kg）劑量組子宮肌層厚度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；補佳樂組子宮肌層面積及厚度顯著增加（P＜0.01）。結果見表3。

3.3和顏坤坤泰膠囊對子宮內(nèi)膜及厚度的影響給藥8周后，與正常組相比，模型組大鼠子宮內(nèi)膜面積和內(nèi)膜厚度顯著減小（P＜0.01）；與模型組相比，和顏坤泰膠囊低劑量組（2 g/kg）子宮內(nèi)膜面積顯著增加（P＜0.01），和顏坤泰膠囊中、低（4、2 g/kg）劑量組子宮內(nèi)膜厚度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01）；補佳樂組子宮內(nèi)膜面積及厚度顯著增加（P＜0.01）。結果見表4。

表3　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮肌層面積和厚度的影響（±s）Tab.3　Effects of Heyan Kuntai capsules on myometrium area and thickness of ovariectomized rats（±s）

表3　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮肌層面積和厚度的影響（±s）Tab.3　Effects of Heyan Kuntai capsules on myometrium area and thickness of ovariectomized rats（±s）

注：與正常組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別動物數(shù)劑量（g/kg）正常組假手術組模型組補佳樂組莉芙敏組和顏坤泰高劑量組和顏坤泰中劑量組和顏坤泰低劑量組8 8 8 8 8 8 8 8子宮肌層厚度（μm）－36 392.38±5 423.62107.40±8.07－27 547.92±5 414.3093.30±9.02－11 567.18±2 745.56##60.34±7.17##0.2×10－325 712.21±4 195.52**90.22±7.69** 0.0614 175.54±3 717.4366.71±8.80 812 634.52±959.8863.39±2.41 413 789.07±4 090.8765.72±9.27* 217 361.99±1 961.95*74.25±4.41**子宮肌層面積（μm2）

表4　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮內(nèi)膜面積及厚度的影響（±s）Tab.4　Effects of Heyan Kuntai capsules on endometrium area and thickness of ovariectomized rats（±s）

表4　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮內(nèi)膜面積及厚度的影響（±s）Tab.4　Effects of Heyan Kuntai capsules on endometrium area and thickness of ovariectomized rats（±s）

注：與正常組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別動物數(shù)劑量（g/kg）正常組假手術組模型組補佳樂組莉芙敏組和顏坤泰高劑量組和顏坤泰中劑量組和顏坤泰低劑量組8 8 8 8 8 8 8 8子宮內(nèi)膜厚度（μm）－147.73±13.856.85±0.32－129.31±8.166.41±0.20－75.34±8.82##4.89±0.29##0.2×10－3121.69±13.48**6.22±0.34** 0.0683.07±9.285.14±0.28 878.94±3.105.01±0.10 485.81±7.545.22±0.23* 290.38±4.84**5.36±0.14**子宮內(nèi)膜面積（μm2）

3.4和顏坤泰膠囊對子宮上皮厚度和腺體數(shù)的影響給藥8周后，與正常組相比，模型組大鼠子宮上皮厚度和腺體數(shù)顯著減?。≒＜0.01）；與模型組相比，和顏坤泰膠囊中、低（4、2 g/kg）劑量組子宮上皮厚度顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），和顏坤泰膠囊低劑量組（2 g/kg）子宮腺體數(shù)顯著增加（P＜0.05）；補佳樂組子宮上皮厚度顯著增加（P＜0.01），腺體數(shù)顯著增加（P＜0.05）。結果見表5，圖1。

3.5和顏坤泰膠囊對子宮細胞凋亡的影響給藥8周后，與正常組相比，模型組大鼠子宮細胞凋亡率顯著上升（P＜0.01），Bcl－2陽性面積百分比顯著下降（P＜0.01），Bax陽性面積百分比顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，和顏坤泰膠囊中、低（4、2 g/kg）劑量組細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05，P＜0.01），Bcl－2陽性面積百分比顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Bax陽性面積百分比顯著下降（P＜0.05，P＜0.01）；補佳樂組子宮細胞凋亡率顯著下降（P＜0.01），Bcl－2陽性面積百分比顯著上升（P＜0.01），Bax陽性面積百分比顯著下降（P＜0.01）；莉芙敏組子宮細胞凋亡率顯著下降（P＜0.05），Bcl－2陽性面積百分比顯著上升（P＜0.05），Bax陽性面積百分比顯著下降（P＜0.05）。結果見表6，圖2－4。

表5　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮上皮厚度和腺體數(shù)的影響（±s）Tab.5　Effects of Heyan Kuntai capsules on epithelial thickness and the number of gland in uterus of ovariectomized rats（±s）

表5　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮上皮厚度和腺體數(shù)的影響（±s）Tab.5　Effects of Heyan Kuntai capsules on epithelial thickness and the number of gland in uterus of ovariectomized rats（±s）

注：與正常組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01。

組別正常組假手術組模型組補佳樂組莉芙敏組和顏坤泰高劑量組和顏坤泰中劑量組和顏坤泰低劑量組動物數(shù)劑量（g/kg）8 8 8 8 8 8 8 8子宮腺體數(shù)（個）－89.22±19.7833.67±10.71－81.65±14.8325.50±9.14－40.96±1.68##12.00±2.68##0.2×10－365.12±8.90**21.17±3.66* 0.0640.80±5.2813.33±7.09 842.67±9.2916.99±4.90 451.41±4.83*17.83±3.76 261.95±5.42**19.17±3.13*子宮上皮厚度（μm）

圖1　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮形態(tài)學的影響（×40）Fig.1　Effects of Heyan Kuntai capsules on uterus morphology of ovariectomized rats（×40）

表6　和顏坤泰膠囊卵巢去勢大鼠對子宮細胞凋亡的影響（±s）Tab.6　Effects of Heyan Kuntai capsules on cell apoptosis in uterus of ovariectomized rats（±s）

表6　和顏坤泰膠囊卵巢去勢大鼠對子宮細胞凋亡的影響（±s）Tab.6　Effects of Heyan Kuntai capsules on cell apoptosis in uterus of ovariectomized rats（±s）

注：與正常組比，##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01。

細胞凋亡率（%）Bcl－2陽性面積百分比（%）Bax陽性面積百分比（%）正常組4.17±0.4824.67±2.327.13±1.29假手術組6.72±0.5618.84±1.6910.72±1.64模型組18.12±1.49##9.60±1.15##16.85±1.00##補佳樂組9.24±1.49**17.84±1.43**11.28±2.13**莉芙敏組13.36±2.26*11.61±1.29*14.61±1.10*和顏坤泰高劑量組16.93±2.0310.52±0.5916.06±1.04和顏坤泰中劑量組14.63±0.77*12.19±2.11*14.50±2.05*和顏坤泰低劑量組10.96±1.15**15.25±2.24**13.53±1.36**組別動物數(shù)劑量（g/kg）8 8 8 8 8 8 8 8－－－0.2×10－30.06 8 4 2

3.6和顏坤泰膠囊對子宮Bcl－2mRNA和BaxmRNA表達的影響給藥8周后，與正常組相比，模型組大鼠子宮Bcl－2 mRNA表達顯著降低（P＜0.01），BaxmRNA表達顯著上升（P＜0.01）；與模型組相比，和顏坤泰膠囊中、低（4、2 g/kg）劑量組子宮Bcl－2mRNA表達顯著增加（P＜0.05，P＜0.01），Bax mRNA表達顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。補佳樂組子宮Bcl－2 mRNA表達顯著增加（P＜0.01），Bax mRNA表達顯著降低（P＜0.01）；莉芙敏組子宮Bcl－2 mRNA表達顯著增加（P＜0.05），BaxmRNA表達顯著降低（P＜0.05）。結果見表7。

圖2　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮細胞凋亡的影響（×400）Fig.2　Effects of Heyan Kuntai capsules on cell apoptosis in uterus of ovariectomized rats（×400）

圖3　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮Bcl－2蛋白陽性表達的比較（×400）Fig.3　Effects of Heyan Kuntai capsules on expression of Bcl-2 protein in uterus of ovariectomized rats（×400）

4　討論

子宮是雌性動物生成月經(jīng)和孕育胎兒的場所，是性激素的主要靶器官，由子宮內(nèi)膜、肌層和外膜組成，其中子宮內(nèi)膜由上皮和固有層構成。子宮結構和功能的正常對于女性生殖和全身機能的調(diào)節(jié)具有重要意義。婦女進入更年期后，由于下丘腦－垂體－卵巢軸的衰退，卵巢分泌的雌激素減少，子宮內(nèi)膜逐漸萎縮，細胞凋亡加速，最終導致子宮萎縮，失去其應有的功能[13]。本實驗通過卵巢去勢大鼠模擬人類更年期綜合征，實驗結果顯示：摘除卵巢后大鼠子宮明顯萎縮，橫截面積減小，肌層和內(nèi)膜變薄，腺體減少，內(nèi)膜細胞凋亡率明顯升高，給予和顏坤泰膠囊治療后，去勢大鼠子宮橫截面積增大，子宮內(nèi)膜、肌層增厚，腺體數(shù)增加，推測和顏坤泰膠囊可能直接作用于子宮，促進大鼠子宮上皮生長，提高腺體數(shù)目，改善子宮內(nèi)膜狀態(tài)，緩解子宮萎縮。表明和顏坤泰膠囊具有一定的營養(yǎng)子宮并改善其功能的作用。

圖4　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮Bax蛋白陽性表達的比較（×400）Fig.4　Effects of Heyan Kuntai capsules on expression of Bax protein in uterus of ovariectomized rats（×400）

表7　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達的影響（±s）Tab.7　Effects of Heyan Kuntai capsules on Bcl-2 mRNA and Bax mRNA expression in uterus of ovariectomized rats（±s）

表7　和顏坤泰膠囊對卵巢去勢大鼠子宮Bcl-2 mRNA和Bax mRNA表達的影響（±s）Tab.7　Effects of Heyan Kuntai capsules on Bcl-2 mRNA and Bax mRNA expression in uterus of ovariectomized rats（±s）

注：與正常組比；##P＜0.01；與模型組比，*P＜0.05，**P＜0.01。

Bax mRNA相對含量正常組0.87±0.161.09±0.12假手術組0.68±0.171.15±0.15模型組0.32±0.04##1.65±0.15##補佳樂組0.63±0.14**1.24±0.13**莉芙敏組0.52±0.07*1.42±0.08*和顏坤泰高劑量組0.36±0.081.67±0.11和顏坤泰中劑量組0.50±0.17*1.47±0.11*和顏坤泰低劑量組0.58±0.13**1.30±0.08**組別Bcl－2 mRNA相對含量動物數(shù)劑量（g/kg）8 8 8 8 8 8 8 8－－－0.2×10－30.06 8 4 2

細胞凋亡普遍存在于多種組織和器官，性激素誘導并維持性器官及組織的發(fā)生發(fā)育，其撤退導致相應性腺組織的退行性病變，這是細胞凋亡的一種典型模式[14]。目前公認的參與凋亡的主要通路有線粒體通路和死亡受體通路。Bcl－2蛋白家族在細胞凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用[15]，它們共同構成一個非常復雜的相互作用網(wǎng)絡，調(diào)控細胞凋亡。Bcl－2家族可以分為兩類：一類是抗細胞凋亡基因，其代表是Bcl－2基因，研究已證實Bcl－2基因通過抑制細胞凋亡從而延長多種細胞壽命[16]；另一類是促細胞凋亡基因，其代表是Bax基因，而Bax基因的過量表達，可以加速細胞死亡[17]。Bcl－2家族影響細胞凋亡的途徑比較復雜，有實驗表明，Bcl－2家族成員通過調(diào)節(jié)線粒體外膜的通透性和完整性調(diào)控細胞的凋亡[18－19]。本實驗發(fā)現(xiàn)，摘除卵巢后，大鼠子宮內(nèi)膜細胞凋亡率明顯升高，內(nèi)膜Bax陽性表達上升，而Bcl－2的陽性表達下降，說明雌激素下降后子宮細胞表達趨向凋亡。給予和顏坤泰膠囊治療后抑制了細胞凋亡率，上調(diào)了Bcl－2蛋白的表達，下調(diào)了Bax蛋白的表達，推測和顏坤泰膠囊抑制細胞凋亡的機制可能主要是對Bc1－2表達的上調(diào)作用以及對Bax表達的下調(diào)作用。

綜上，和顏坤泰膠囊能有效的抑制子宮細胞凋亡緩解子宮萎縮，這對于子宮結構衰變的防護及改善有積極的意義。其抑制子宮細胞凋亡的機制可能是通過調(diào)控Bcl－2和Bax的基因與蛋白的表達，然而對其是通過什么途徑來調(diào)控Bcl－2家族蛋白的表達的研究還有待進一步深入。本實驗結果有助于從子宮細胞凋亡方向了解和顏坤泰膠囊治療更年期綜合征的分子基礎，從而為明確其藥理作用和機制提供新的靶標。

[1]Mandal A,Chaudhuri ABD.Anthropometric－h(huán)ormonal correlation:an overview[J].J Life Sci,2010,2(2):65－71.

[2]彭連雙,張志強,孫建輝,等.知柏地黃丸加減治療女性更年期綜合征108例療效觀察[J].中醫(yī)臨床研究,2015,7(16):124－125.

[3]劉惠玉.知柏地黃丸治療女性更年期綜合征105例[J].中醫(yī)臨床研究,2015,7(17):118.

[4]李晨晨,孫立軍.更年期方治療圍絕經(jīng)期心腎不交型失眠50例總結[J].湖南中醫(yī)雜志,2015,31(11):79－80.

[5]姜巖.加味逍遙丸聯(lián)合烏雞白鳳丸治療更年期綜合征療效觀察[J].中國冶金工業(yè)醫(yī)學雜志,2015,32(6):674.

[6]王燁,徐蓮薇,朱芝玲.調(diào)更湯對圍絕經(jīng)期雌性大鼠生殖內(nèi)分泌影響的實驗研究[J].上海中醫(yī)藥雜志,2014,48(12):72－74.

[7]蔡熙,黃暉,王嵐.圍絕經(jīng)期動物模型的研究進展[J].中國實驗方劑學雜志,2007,10:71－73.

[8]吳瓊.坤泰膠囊改善圍絕經(jīng)期綜合征的療效分析[J].實用婦科內(nèi)分泌雜志,2015,2(6):47－49.

[9]關素珍,蔣赟.坤泰膠囊對更年期綜合征患者性激素及血脂的影響[J].實驗方劑學雜志,2014,20(20):218－221.

[10]張紹芬,劉旸,謝倩,等.坤泰膠囊(更年寧心膠囊)對更年期大鼠卵巢及子宮內(nèi)膜組織形態(tài)的影響[J].中華老年醫(yī)學,2004,23 (9):648－652.

[11]段燕康,李芳,李進東,等.坤泰膠囊對更年期雌鼠激素水平及圍絕經(jīng)期綜合征的影響[J].中國醫(yī)院藥學,2014,34(6):432－435.

[12]陳奇.中藥藥效研究思路與方法[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2005:949.

[13]徐睿來.清熱更年方對更年期模型大鼠作用的實驗研究[J].現(xiàn)代預防醫(yī)學,2011,38(5):866－868.

[14]薛曉鷗,牛建昭,王繼峰,等.大豆異黃酮對去卵巢大鼠子宮細胞凋亡影響的研究[J].中日友好醫(yī)院學報,2005,19(1):28－31.

[15]Ouyang YB,Giffard RG.Cellular neuroprotective mechanisms in cerebral ischemia:Bcl－2 family proteins and protection of mitochondrial function[J].Cell Calcium,2004,36(3/4):303－311.

[16]Zhang H,Li Q,Li Z,et al,The protection of Bcl－2 over expression on rat cortical neuronal injury caused by analogous ischemia/reperfusion in vitro[J].Neurosci Res,2008,62(2):140－146.

[17]刁振奇,柳璐,李云濤,等.細胞凋亡機制的研究進展[J].鄭州鐵路職業(yè)技術學院學報,2010,22(3):37－40.

[18]Lin HH,Chen JH,Huang CC,et al.Apoptotic effect of3,4－dihydroxybenzoic acid on human gastric carcinoma cells involving JNK/ p38MAPK signaling activation[J].Int J Cancer,2007,120(11):156－161.

[19]Brajuskovicg,R iickisv,Cer vics,et al.BCL－2 and Bax protein interaction in B－lymphoeytes of peripheral blood in patients with chroni lymphocytic leukemia[J].Vojnosanit Pregl,2005,62(5):357－363.

（本文編輯：高杉，滕曉東）

Anti-apoptotic and uterotrophic effects of Heyan Kuntai capsules in uterus of ovariectomized rats

HUANG Chun-li,ZHANG De-qin,ZHANG Qing-xia,WEN Jing
（Traditional Chinese Medicine Research Institute of Tianjin University of Triditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China）

[Objective]To investigate the effects of Heyan Kuntai capsules on uterus morphology and apoptosis in ovariectomized rats. [Methods]Female SD rats underwent ovariectomize surgery and were divided into model group,progynova group,Remifemin group and Heyan Kuntai capsule of high,medium and low dose groups(8,4 and 2 g crude drug/kg respectively).The drugs were administered for 8 weeks.This article observed the impacts of drugs on uterus pathology,staining and apoptosis,detected the expression levels of Bcl-2 and Bax mRNAs and proteins.[Results]It was obtained significantly decreased epithelial thickness and reduced myometrium and endometrium cross-sectional area and wall thickness in the model group compared with the control and Heyan Kuntai capsule treated groups（P＜0.01 or P＜0.05）.It was also decreased Bcl-2 and increased Bax mRNAs and proteins expressions（P＜0.01 or P＜0.05）in the model group.Further more,the model group showed increased apoptosis rate（P＜0.01 or P＜0.05）and reduced number of glands（P＜0.01 or P＜0.05）in the uterus.[Conclusion]Heyan Kuntai capsules elicits uterotrophic effect and attenuates apoptosis in the uterus cells by regulating mRNAs and protein expressions of Bcl-2 and Bax.

Heyan Kuntai capsule;uterus morphology;apoptosis;Bcl-2 mRNA and protein;Bax mRNA and protein

R711.75

A

1672-1519（2016）11－0675－07

國家重大新藥創(chuàng)制科技重大專項（2012ZX09304007）。

黃春麗（1990－），女，碩士研究生，從事中藥基本理論及臨床應用研究。

張德芹，E－mail：deqin123@163.com。

（2016-04-21）

10.11656/j.issn.1672－1519.2016.11.12