菌草靈芝多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

劉曉艷，陳藝煊，吳林秀，徐陽陽，童愛均，劉斌

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建　福州350002）

菌草靈芝多糖提取工藝優(yōu)化及抗氧化活性研究

劉曉艷，陳藝煊，吳林秀，徐陽陽，童愛均，*劉斌

（福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，福建福州350002）

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，利用正交試驗對菌草靈芝多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化，同時通過對DPPH自由基、羥自由基的清除能力和還原力對其抗氧化活性進行評價。結(jié)果表明，菌草靈芝多糖的最佳提取工藝條件為提取時間2.5 h，提取溫度95℃，料液比1∶25（g∶g）；在該條件下提取率為1.65%?？寡趸囼灲Y(jié)果表明，菌草靈芝多糖對DPPH自由基和羥自由基有一定的清除能力，且與多糖質(zhì)量濃度存在一定的量效關(guān)系，表明菌草靈芝多糖是一種潛在的抗氧化劑。

菌草靈芝多糖；正交試驗；抗氧化

靈芝性平味甘，是我國傳統(tǒng)的珍貴藥用菌，是古代醫(yī)藥學(xué)中的一種滋補性中藥，在臨床和保健食品方面已得到廣泛的關(guān)注。靈芝多糖是靈芝所含物質(zhì)中生物活性極強的成分之一，其種類較多，目前已經(jīng)分離到的有200多種，主要包括水溶性、堿性和酸性多糖，多糖構(gòu)型以β型葡聚糖為主，還有少數(shù)α型葡聚糖，分子量從數(shù)百到數(shù)十萬不等[1]?，F(xiàn)代研究表明，靈芝多糖具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫力、抗氧化、降血脂和降血糖等多種藥理作用[2-5]。

菌草靈芝是指利用芒萁、類蘆、巨菌草、象草等營養(yǎng)野生草替代闊葉樹栽培的靈芝子實體[6]。菌草靈芝栽培原料來源豐富、價格低廉，大大降低了靈芝的栽培成本，且栽培出的靈芝中氨基酸、脂肪酸和微量元素含量豐富，同時研究表明其粗多糖、三萜類物質(zhì)和孢子油含量均比椴木靈芝高[7-8]。目前，對菌草靈芝的研究主要集中在其栽培上，而對其生物活性物質(zhì)方面的研究較少，尤其對于菌草靈芝多糖的提取率及其活性的研究更少。鑒于此，本研究利用正交試驗對菌草靈芝多糖的提取工藝條件進行了優(yōu)化，同時對其抗氧化活性進行研究，從而進一步為菌草靈芝的開發(fā)利用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1　材料與方法

1.1試驗材料

菌草靈芝，由福建農(nóng)林大學(xué)菌草所（國家菌草工程技術(shù)研究中心）提供。

1.2儀器及試劑

1.2.1化學(xué)試劑

葡萄糖、濃硫酸、苯酚、高氯酸、香草醛、冰醋酸、蘆丁、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、硝酸氯等均為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司提供。

1.2.2主要儀器與設(shè)備

HH-3A型數(shù)顯三用水浴鍋，金壇市精達儀器制造廠產(chǎn)品；SC-3612型低速離心機，科大創(chuàng)新股份有限公司產(chǎn)品；SHB-III型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長城科技工貿(mào)有限公司產(chǎn)品；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀R系列，上海申生科技有限公司產(chǎn)品；7200型紫外可見分光光度計，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；FZ102型微型植物粉碎器，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品。

1.3試驗方法

1.3.1水提提取法

菌草靈芝子實體烘干并粉碎→過篩20目→加入水提取→過濾→濾液濃縮→離心（3 500 r/min，10 min）→上清液→95%乙醇醇沉→離心，收集沉淀→干燥→靈芝水粗提物→水復(fù)溶→測定活性物質(zhì)含量。

1.3.2葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

采用苯酚-硫酸法[9-10]測定，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線：①稱取已恒質(zhì)量的葡萄糖0.100 0 g，加入適量蒸餾水溶解，轉(zhuǎn)移到1000 mL的容量瓶中，定容至刻度，搖勻，備用；②得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，其質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL；③分別吸取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，置于20 mL具塞試管中，加入蒸餾水稀釋至1.0 mL，搖勻；④向其中先后加入5%苯酚溶液1.0 mL，快速垂直加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，靜置10 min；⑤將具塞試管放置在30℃水浴鍋中反應(yīng)25 min，拿出后冷卻至室溫，并于波長490 nm處測其吸光度，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線；⑥得到的回歸方程為：Y=0.879 7X+0.021，相關(guān)系數(shù)R2=0.998 3。

1.3.3多糖含量測定

精密稱取3.0 g靈芝粉末于錐形瓶中，進行上述各提法提取[11-12]，抽濾后將濾液定容至100 mL，加入3倍體積的乙醇，使乙醇含量達到70%，移至4℃冰箱中過夜，以轉(zhuǎn)速3 500 r/min離心6 min，棄上清液，將醇沉所得粗多糖于烘箱內(nèi)烘至恒質(zhì)量，再加入100 mL的蒸餾水溶解離心管內(nèi)物質(zhì)，按苯酚-濃硫酸法顯色測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，由吸光度求出提取液中的多糖質(zhì)量濃度，多糖提取率見公式（1）。

式中：W——多糖提取率，mg/g；

C——多糖質(zhì)量濃度，mg/mL；

V——定容體積，mL；

m——原料質(zhì)量，mg。

1.3.4單因素試驗

精確稱取靈芝粉末3.0 g，以水為提取溶劑，分別研究料液比（1∶15，1∶20，1∶25，1∶30，1∶35）、提取溫度（55，65，75，85，95℃）、提取時間（1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 h）對菌草靈芝多糖得率的影響。（文中所涉及的料液比均為質(zhì)量比。）

1.3.5正交試驗

靈芝的水提物以提取時間、提取溫度、料液比為研究因素，故本試驗采用L9（34）的正交試驗方法，對靈芝水浸提提取工藝條件進行優(yōu)化。

1.3.6抗氧化能力測定

（1）DPPH自由基清除率的測定。根據(jù)文獻[11-12]稱取一定量的DPPH自由基，用無水乙醇配制成0.04 mg/mL的DPPH溶液。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL），加入2 mL DPPH自由基溶液，混合均勻，室溫放置30 min后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心10 min。取上清液于波長517 nm處測吸光度，用抗壞血酸作為陽性對照。DPPH自由基清除率見公式（2）。

（2）羥自由基清除率的測定。羥自由基清除率參照弓曉峰等人[13-14]進行。分別取不同質(zhì)量濃度的樣品（0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mg/mL），依次加入9 mmol/L的FeSO4，9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液各1 mL，最后加入9 mmol/L H2O21 mL啟動反應(yīng)。在37℃水浴下反應(yīng)30 min，于波長510 nm處測定各個樣品質(zhì)量濃度的吸光度。以樣液1 mL，F(xiàn)eSO4溶液1 mL，水楊酸-乙醇溶液1 mL，及蒸餾水1 mL作為樣品對照液和空白對照。羥自由基清除率見公式（3）。

（3）還原力的測定。還原力的測定根據(jù)文獻[15-16]進行。在試管中加入0.2 mol/L pH值6.6的磷酸緩沖液2.5 mL和不同質(zhì)量濃度的待測樣品溶液1 mL，加入0.1%的鐵氰化鉀2.5 mL，混勻后，放置在50℃的水中反應(yīng)25 min。再加入2.5 mL 10%三氯乙酸終止反應(yīng)，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心15 min。取上清液2.5 mL和0.5%三氯化鐵溶液0.5 mL混合靜置，于波長700 nm處測定吸光度。還原力的測定見公式（4）。

2　結(jié)果與討論

2.1靈芝水提單因素試驗

2.1.1料液比對菌草靈芝多糖提取率的影響

按不同的料液比，提取時間為2 h，提取溫度為65℃，用水為提取劑進行浸提。

料液比對菌草靈芝多糖提取率的影響見圖1。

圖1　料液比對菌草靈芝多糖提取率的影響

由圖1可知，隨著料液比增大，菌草靈芝多糖的提取率不斷提高；但當(dāng)料液比大于1∶25時，菌草靈芝多糖提取率在1∶25后趨于穩(wěn)定，出于成本的考慮，選取料液比為1∶25為宜。

2.1.2提取時間對菌草靈芝多糖提取率的影響

按不同的提取時間，提取溫度75℃，料液比1∶30，以水為提取劑進行浸提。

提取時間對菌草靈芝多糖提取率的影響見圖2。

圖2　提取時間對菌草靈芝多糖提取率的影響

由圖2可知，隨著提取時間的延長，菌草靈芝多糖的提取率逐漸增高，而在2.5 h后提取率的增速開始變得緩慢，故試驗選取提取時間為2.5 h。

2.1.3提取溫度對菌草靈芝多糖提取率的影響

按不同的提取溫度，提取時間2.5 h，料液比1∶30，以水為提取劑進行浸提。

提取溫度對菌草靈芝多糖提取率的影響見圖3。

圖3　提取溫度對菌草靈芝多糖提取率的影響

由圖3可知，菌草靈芝多糖的提取率隨著提取溫度的升高而不斷增加，說明提取溫度的升高對多糖的提取有促進作用。因此，提取溫度選取95℃。

2.2靈芝水提正交試驗結(jié)果

正交試驗的因素與水平設(shè)計見表1，正交試驗結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表1　正交試驗的因素與水平設(shè)計

表2　正交試驗結(jié)果與分析

表3　方差分析

由表1～表2可知，提取溫度、提取時間、料液比對菌草靈芝多糖的提取均有不同程度的影響。由于各因素間的相互作用比較復(fù)雜，因此本研究以提取率為指標(biāo)，采用正交試驗設(shè)計對提取工藝進行優(yōu)化。從正交試驗極差分析可以判斷出，影響提取率諸因素的主次關(guān)系依次為提取時間（C）＞提取溫度（B）＞料液比（A），最佳組合為C3B3A2。由表3可知，提取時間和提取溫度對提取率具有顯著性影響（p＜0.05），各因素對多糖提取率的影響主次關(guān)系與極差分析結(jié)果一致。

2.3菌草靈芝水提驗證試驗結(jié)果

為了檢驗?zāi)Ｐ偷臏?zhǔn)確性，在最佳提取工藝條件下，即提取時間2.5 h，提取溫度95℃，料液比1∶25，進行3次平行驗證試驗，測得多糖提取率分別為1.65%，1.71%和1.59%，平均提取率為1.65%。

2.4抗氧化試驗結(jié)果

2.4.1菌草靈芝多糖對DPPH自由基清除作用

菌草靈芝多糖對DPPH自由基的清除作用見圖4。

由圖4可知，菌草靈芝粗多糖對DPPH自由基清除率隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高，在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，清除率達到最高；然而，當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時，清除率未發(fā)生顯著性改變（p＞0.05）。與陽性對照組抗壞血酸相比，在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)菌草靈芝多糖對DPPH自由基清除效果沒有抗壞血酸強，但菌草靈芝多糖在質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時，對DPPH自由基的清除率可達到73.26%，表明菌草靈芝多糖具有一定的抗氧化能力。

圖4　菌草靈芝多糖對DPPH自由基的清除作用

2.4.2菌草靈芝多糖對羥自由基清除作用

菌草靈芝多糖對羥自由基的清除能力見圖5。

圖5　菌草靈芝多糖對羥自由基的清除能力

人體的免疫反應(yīng)可能伴隨著羥自由基的產(chǎn)生，該自由基能夠破壞多種大分子物質(zhì)，如碳水化合物、核酸和氨基酸等。因此，清除體內(nèi)多余的羥自由基對人體的健康非常重要[17-19]。由圖5可知，菌草靈芝多糖對羥自由基的清除能力隨著多糖質(zhì)量濃度的增加而緩慢增加，但在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對羥自由基的清除能力在菌草靈芝多糖質(zhì)量濃度4.8 mg/mL時達到最大值56.21%。與陽性對照組抗壞血酸對比可知，在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，菌草靈芝多糖對羥自由基的清除能力較弱。

2.4.3菌草靈芝多糖的還原力

菌草靈芝多糖的還原力見圖6。

圖6　菌草靈芝多糖的還原力

由圖6可知，菌草靈芝多糖的還原力同樣呈現(xiàn)大致相同的趨勢，即隨著質(zhì)量濃度的增加，還原力逐漸增強。在試驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，開始隨著質(zhì)量濃度的增加，還原力增大速度較慢；而當(dāng)質(zhì)量濃度繼續(xù)增加時，還原力的增大速度越來越快；在菌草靈芝多糖質(zhì)量濃度為4.8 mg/mL時，還原力達到最大為1.32。雖然還是比抗壞血酸弱，但其有還原力的存在，說明菌草靈芝多糖具有一定的抗氧化潛能。

3　結(jié)論

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過正交試驗對菌草靈芝多糖的提取工藝條件進行優(yōu)化。結(jié)果顯示，在提取時間2.5 h，提取溫度95℃，料液比1∶25的條件下，菌草靈芝多糖提取率最高。進一步的抗氧化活性試驗顯示，菌草靈芝多糖質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL時對DPPH自由基的清除率達到73.26%，在質(zhì)量濃度為4.8 mg/mL時，對羥自由基的清除能力達到最大值56.21%，在質(zhì)量濃度為4.8 mg/mL時，還原力達到最大值1.32。雖然本試驗中菌草靈芝多糖對羥自由基的清除能力低于張志軍等人[20]的57.6%（2.5 mg/mL），但菌草靈芝多糖在還原力上與其研究結(jié)果大致相同，甚至略高。由此可見，菌草靈芝多糖具有一定的抗氧化能力。

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[20]張志軍，李淑芳，魏雪生.靈芝多糖清除自由基活性的研究[J].食品研究與開發(fā)，2012（3）：167-170.◇

Optimization of Polysaccharides Extraction from Juncao Ganoderma Lucidum and its Antioxidant Activities

LIU Xiaoyan，CHEN Yixuan，WU Linxiu，XU Yangyang，TONG Aijun，*LIU Bin
（Food Science College，F(xiàn)ujian Agriculture and Foresly University，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350002，China）

Based on the single factor experiments，orthogonal experiments are used to optimize the polysaccharides extraction conditions from Juncao Ganoderma Lucidum.In addition，the antioxidant activities of Juncao Ganoderma Lucidum polysaccharides are investigated by the reducing power and the scavenging activity on DPPH·and hydroxyl radicals.The results show that the optimal extraction conditions are as follows：extraction time 2.5 h，extraction temperature 95℃and solid to liquid ratio 1∶25（g∶g），under these optimal conditions the extraction yield of polysaccharides is 1.65%.The antioxidant activities experiments show that the polysaccharides from Juncao Ganoderma Lucidum possess the scavenging abilities on DPPH·and hydroxyl radicals，and increased with the concentration increased，which indicated that the Juncao Ganoderma Lucidum polysaccharides is the potential resource of antioxidant.

Juncao Ganoderma Lucidum polysaccharides；orthogonal experiments；antioxidant activities

TS201.2

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2016.10.041

2016-08-31

福建省科技重大專項“菌草食藥用菌產(chǎn)業(yè)化關(guān)鍵技術(shù)研究與示范”（2014NZ2002-1）；國家科技支撐計劃子課題“中輕度侵蝕區(qū)菌草特色生態(tài)循環(huán)產(chǎn)業(yè)集成與示范”（2014BAD15B01-6）。

劉曉艷（1981—），女，博士，助理實驗師，研究方向為食品營養(yǎng)。

劉斌（1969—），男，博士，教授，研究方向為食品生物技術(shù)。

1671-9646（2016）10b-0048-03

1671-9646（2016）10b-0045-03