應(yīng)用DNA復(fù)合條形碼技術(shù)研究秦嶺水生動(dòng)物多樣性

李 杰, 楊 婧，黃 原

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710062

?

應(yīng)用DNA復(fù)合條形碼技術(shù)研究秦嶺水生動(dòng)物多樣性

李 杰, 楊 婧，黃 原*

陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 西安 710062

基于新一代測(cè)序技術(shù)的DNA復(fù)合條形碼技術(shù),以其簡(jiǎn)便快捷和省時(shí)省力的特點(diǎn),已經(jīng)成為監(jiān)測(cè)生物多樣性的主要方法。采用這一技術(shù),選取COⅠ和18S rRNA兩個(gè)條形碼標(biāo)記,對(duì)秦嶺5個(gè)淡水水域內(nèi),不同生境下10個(gè)樣品的水生動(dòng)物多樣性進(jìn)行了初步調(diào)查。區(qū)系組成結(jié)果顯示：18S rRNA基因鑒定了9門42綱52目,COⅠ基因鑒定了5門11綱36目,而兩個(gè)條形碼標(biāo)記共鑒定了10門48綱89目。群落組成分析結(jié)果顯示：COⅠ分析得到樣本中含量相對(duì)較高的類群是雙翅目、毛翅目、基眼目、鞘翅目、蜉蝣目等；而18S rRNA分析得到樣本中主要有節(jié)肢動(dòng)物門、軟體動(dòng)物門和扁形動(dòng)物門三個(gè)大門。此外,兩者的分析結(jié)果也表明所選樣地下游的類群數(shù)要高于上游。α多樣性分析結(jié)果顯示：金龍峽、灃峪口和石砭峪3個(gè)受人類影響較大樣地的群落豐富度和群落多樣性相對(duì)較高,而五臺(tái)山和子午峪兩個(gè)自然樣地的物種豐富度和群落多樣性相對(duì)較低,表明一定程度的外來干擾會(huì)對(duì)一個(gè)地方的水生生物多樣性有明顯的提高。β多樣性分析結(jié)果顯示,不同環(huán)境因素下樣品的群落結(jié)構(gòu)差異性較大,而相似環(huán)境因素下樣品的群落結(jié)構(gòu)差異性則相對(duì)較小。此外,在聚類分析時(shí),環(huán)境相似性較高的樣品首先聚集在一起,而且群落相似性也相對(duì)較高。

DNA復(fù)合條形碼；秦嶺；水生動(dòng)物；生物多樣性

DNA復(fù)合條形碼技術(shù)(DNA metabarcoding)是在DNA條形碼基礎(chǔ)上結(jié)合高通量測(cè)序技術(shù)和分子分類學(xué)技術(shù)興起的一種用于生物多樣性檢測(cè)的方法。該技術(shù)既可以在短時(shí)間內(nèi)對(duì)大量樣本的物種組成進(jìn)行識(shí)別,也可以對(duì)大批量的多物種混合環(huán)境樣本進(jìn)行快速的DNA條形碼鑒定,避免了單物種DNA條形碼鑒定的低效率[1- 3]。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步、條形碼參考數(shù)據(jù)庫的完善和分析軟件的開發(fā),DNA復(fù)合條形碼技術(shù)已經(jīng)成為生物多樣性檢測(cè)最常用的方法。

復(fù)合條形碼技術(shù)從誕生以來廣泛應(yīng)用于多方面的研究,如Yang等采用18S rDNA作為標(biāo)記基因分析了土壤小型動(dòng)物的多樣性[4]；Hajibabaei等對(duì)格蘭德河水生生物多樣性進(jìn)行了研究[5]；Nolte等比較了奧地利一個(gè)湖中不同季節(jié)原生動(dòng)物多樣性[6]；Porazinska等比較了哥斯達(dá)黎加不同熱帶雨林微生境中線蟲類的生物多樣性[7]。此外,DNA復(fù)合條形碼在微生物和真菌多樣性[8- 9]、動(dòng)物排泄物以及食性結(jié)構(gòu)[10]和古細(xì)菌[11]的研究上都有很廣泛的應(yīng)用。

自然界內(nèi)江河、湖泊、水庫眾多,水生生物種類繁多,其中水生動(dòng)物是最主要的類群,包括浮游動(dòng)物和底棲動(dòng)物。浮游動(dòng)物包括原生動(dòng)物、輪蟲、枝角類和橈足類等,底棲動(dòng)物包括扁形動(dòng)物門、環(huán)節(jié)動(dòng)物門、節(jié)肢動(dòng)物門等[12]。由于廣泛的水域面積和復(fù)雜的水生環(huán)境,關(guān)于水生動(dòng)物多樣性的研究,雖然有很多發(fā)現(xiàn),但仍然有一些科學(xué)問題亟待解決。秦嶺是橫亙于我國中部東西走向的巨大山脈,是我國的南北分界線[13]。其內(nèi)部山谷眾多,大小溪流貫穿其中,水生生態(tài)環(huán)境復(fù)雜,但目前還缺乏對(duì)水生動(dòng)物區(qū)系和群落的研究。因此,本文選取COⅠ和18S rRNA基因作為條形碼標(biāo)記,用DNA復(fù)合條形碼技術(shù)對(duì)秦嶺水生動(dòng)物區(qū)系組成和群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行了初步研究,同時(shí)用α和β多樣性以及聚類分析來比較不同生境和取樣環(huán)境下,水生動(dòng)物多樣性組成的差別,為秦嶺生物多樣性的保護(hù)和研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與準(zhǔn)備

從秦嶺中選擇金龍峽、石砭峪、五臺(tái)山、子午峪和灃峪口5個(gè)淡水水域,分上下游取樣,在上下游分別設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn),每個(gè)采樣點(diǎn)用50mL凍存管取30mL水樣,同時(shí)用毛筆和鑷子在采樣點(diǎn)的石頭上或底層采集肉眼可見底棲動(dòng)物,放入50mL凍存管中。采樣地點(diǎn)和環(huán)境如表1所示。

將采得的水樣帶回實(shí)驗(yàn)室用真空抽濾機(jī)濃縮,一個(gè)樣地3個(gè)取樣點(diǎn)的水樣濃縮為一個(gè)浮游動(dòng)物水樣。然后將濃縮水樣和底棲動(dòng)物用100%乙醇保存,放入-20℃的冰箱,用于提取總DNA。

1.2 總DNA的提取

將濃縮水樣和底棲動(dòng)物,混合放入一個(gè)經(jīng)高壓滅菌的1.5mL離心管中,用DNeasy Tissue and blood kit(Qiagen Inc)試劑盒提取總DNA,得到10個(gè)DNA樣品,編號(hào)如表1所示。

表1 樣品采集的地點(diǎn)及環(huán)境

1.3 PCR擴(kuò)增以及測(cè)序

根據(jù)Hajibabaei等[5]和Nolte等[6]類似研究采用的引物,實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增COⅠ序列的正向引物為L(zhǎng)epF1：5′-ATTCAACCAATCATAAAGATATTGG- 3′,反向引物為EPT-long-univR： 5′-AARAAAATYATAAYAAANGCGTGN ANNGT- 3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度約為130bp；擴(kuò)增18S rRNA序列的正向引物為fw：5′-ATTAGGGTTCGATTCCGGAGAGG- 3′,反向引物為rv：5′-CTGGAATTACCGCGGSTGCTG- 3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度約為180- 200bp。為了能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品進(jìn)行測(cè)序,以及在后續(xù)分析中區(qū)分每個(gè)樣品序列,在每個(gè)樣品的5′端都加了一個(gè)7bp的標(biāo)簽序列。

實(shí)驗(yàn)中PCR體系為25μL,包括12.5μL 的2×Taq PCR StarMix with Loading Dye,1.0μL的DNA模版,上游引物(10μmol/L)和下游引物(10μmol/L)各1μL,9.5μL的雙蒸水。COⅠ基因的擴(kuò)增循環(huán)程序是：95℃ 5min預(yù)熱,35個(gè)循環(huán)：95℃ 40s,43.5℃ 1min,72℃ 30s,72℃ 5min延伸,4℃保溫；18S rRNA基因的擴(kuò)增循環(huán)程序是：98℃ 2min預(yù)熱,35個(gè)循環(huán)：98℃ 30s,65℃ 45s,72℃ 90s,72℃ 7min延伸,4℃保溫。

PCR產(chǎn)物送往上海派森諾生物科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序,采用Illumina MiSeq平臺(tái),進(jìn)行雙末端測(cè)序。最后將得到的測(cè)序數(shù)據(jù)返回,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和生物多樣性分析。

2 數(shù)據(jù)處理和分析

2.1 原始序列處理：質(zhì)量過濾和嵌合體的去除

首先,將返回的雙末端Fataq序列用fastqc軟件對(duì)序列文件進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)；然后用trimmomatic 0.33軟件進(jìn)行質(zhì)量過濾,要求步長(zhǎng)為1的5bp窗口從第1個(gè)堿基開始移動(dòng),窗口中堿基的平均質(zhì)量≥Q20(即堿基準(zhǔn)確率為99%),從第1個(gè)低于Q20處截?cái)嘈蛄?最終要求序列長(zhǎng)度≥150bp,且不容許有模糊堿基；然后利用Flash軟件對(duì)質(zhì)量過濾的序列進(jìn)行拼接,要求兩個(gè)序列數(shù)據(jù)的最大重疊片段≥10bp,且不容許有堿基錯(cuò)配。

由于PCR擴(kuò)增可能會(huì)產(chǎn)生嵌合體,測(cè)序過程中會(huì)產(chǎn)生點(diǎn)突變等測(cè)序錯(cuò)誤,因此還要對(duì)拼接后的序列進(jìn)一步的過濾和去除嵌合體。實(shí)驗(yàn)用Qiime[14]軟件進(jìn)行序列過濾,用mothur[15]軟件去除嵌合體序列。

2.2 OTU分類和注釋

實(shí)驗(yàn)用Qiime軟件中的uclust[16]對(duì)所得到的優(yōu)質(zhì)序列按照0.97的相似度進(jìn)行OTU聚類,選取每個(gè)OTU中最長(zhǎng)序列為代表序列；用Qiime軟件中的blast,將得到的代表序列與數(shù)據(jù)庫比對(duì),獲得OTU分類學(xué)信息。其中18S rRNA基因與Silva[17]數(shù)據(jù)庫比對(duì),COⅠ基因與BOLD數(shù)據(jù)庫比對(duì)。

然后,根據(jù)注釋得到的精簡(jiǎn)OTU列表,用excel和mothur軟件做目水平上的群落組成圖和樣品間venn圖。

2.3 群落多樣性分析

根據(jù)物種豐度,用mothur軟件中的summary.single命令,求出每個(gè)樣品的Chao,ACE,Shannon和Simpson指數(shù)。其中Chao和ACE指數(shù)是群落豐富度(Community richness)指數(shù),二者的值越大,說明群落豐富度越高；Shannon和Simpson指數(shù)是群落多樣性(Community diversity)指數(shù),Simpson指數(shù)越大,說明群落多樣性越低,Shannon指數(shù)越大,說明群落多樣性越高。

用Qiime軟件,根據(jù)各樣品的物種進(jìn)化和豐度信息,進(jìn)行Unifrac分析[18- 19],得到樣品間差異距離矩陣,然后進(jìn)行PCoA分析。

2.4 聚類分析

根據(jù)精簡(jiǎn)后的OTU列表,用R軟件中的pheatmap程序包進(jìn)行屬水平上的聚類分析,并繪制出heatmap[20- 21]圖。

3 結(jié)果

3.1 測(cè)序結(jié)果

原始序列經(jīng)過濾和嵌合體的去除,兩個(gè)標(biāo)記基因共得到1120240條有效序列,971319條優(yōu)質(zhì)序列,其中18S rRNA的有效序列有767441條,優(yōu)質(zhì)序列有640700條,而COⅠ的有效序列有352799條,優(yōu)質(zhì)序列有330619條,它們的優(yōu)質(zhì)序列所占比例分別為：83.49%和93.71%。

3.2 區(qū)系組成和群落結(jié)構(gòu)

將優(yōu)質(zhì)序列與數(shù)據(jù)庫比對(duì),共得到水生動(dòng)物10門48綱89目,其中18S rRNA鑒定了9門42綱52目,COⅠ鑒定了5門11綱36目。其中18S rRNA鑒定的各樣品組成情況是：J1包含31目55科,J2包含23目41科,D1包含28目49科,D2包含24目44科,W1包含27目45科,W2包含25目41科,Z1包含23目47科,Z2包含20目46科,F1包含20目35科,F2包含19目30科。

圖1 COⅠ基因在種水平上的venn圖(圖中1和2分別代表所有取樣點(diǎn)的下游和上游)Fig.1 The venn diagram for COⅠ gene in the species level (1 and 2 represents the downstream and upstream of all the sample plots, respectively)

根據(jù)OTU列表做venn圖,如圖1和圖2所示,COⅠ鑒定得到：J1與J2的共有物種數(shù)是218,特有物種數(shù)分別為212和152；D1與D2的共有物種數(shù)是236,特有物種數(shù)分別為95和116；W1與W2的共有物種數(shù)是88,特有物種數(shù)分別為214和170；Z1與Z2的共有物種數(shù)是122,特有物種數(shù)分別為153和208；F1與F2的共有物種數(shù)是265,特有物種數(shù)分別為80和123；所有取樣點(diǎn)下游與上游的共有物種數(shù)是628,特有物種數(shù)分別是272和155；D、F、J、W和Z的總物種數(shù)分別是：683、733、800、560和605；18S rRNA鑒定得到：J1與J2的共有物種數(shù)是154,特有物種數(shù)分別為65和47；D1與D2的共有物種數(shù)是158,特有物種數(shù)分別為74和28；W1與W2的共有物種數(shù)是131,特有物種數(shù)分別為56和67；Z1與Z2的共有物種數(shù)是160,特有物種數(shù)分別為49和68；F1與F2的共有物種數(shù)是139,特有物種數(shù)分別為43和53；所有取樣點(diǎn)下游與上游的共有物種數(shù)是305,特有物種數(shù)分別是11和10；J、D、W、Z和F的共有物種數(shù)是140,特有物種數(shù)分別為3、2、9、2和0,D、F、J、W和Z的總物種數(shù)分別是：418、374、420、375和437。

圖2 18S rRNA基因在種水平上的venn圖Fig.2 The venn diagram for 18S rRNA gene in the species level圖中1和2分別代表所有取樣點(diǎn)的下游和上游,J、D、W、Z和F分別代表每個(gè)取樣地上游和下游的總和

根據(jù)OTU列表,可以用樣品在各分類水平(門、綱、目、科、屬)上的物種組成比例情況,來反應(yīng)樣品在不同分類水平上的群落結(jié)構(gòu)。COⅠ從目水平上分析結(jié)果如圖3所示：D1、D2、F1、F2、J1、J2和W1中雙翅目的含量相對(duì)較高,所占比例分別為45.2%、46.3%、46.9%、27.1%、83.1%、53.9%和48.9%；W2中毛翅目的含量較高,所占比例為56.6%；Z1中基眼目的含量較高,所占比例為29.3%；Z2中鞘翅目的含量相對(duì)較高,所占比例為45.3%。18S rRNA從門水平上分析結(jié)果如圖4所示：D1、D2、J1、J2、W1、Z1和Z2中節(jié)肢動(dòng)物門的含量相對(duì)較高,所占比例分別為59.2%、84.5%、92.7%、65.8%、91.6%、53.5%和66.9%；F1和F2中軟體動(dòng)物門的含量相對(duì)較高,所占比例分別為55.2和58.6%；W2中扁形動(dòng)物門的含量相對(duì)較高,所占比例為54.5%?？梢?COⅠ調(diào)查表明：樣本中含量相對(duì)較高的類群是雙翅目、毛翅目、基眼目、鞘翅目、蜉蝣目等；而18S rRNA調(diào)查表明：樣本中主要有節(jié)肢動(dòng)物門、軟體動(dòng)物門和扁形動(dòng)物門三個(gè)大門。

圖3 COⅠ基因目水平上群落組成圖Fig.3 The community composition diagram for COⅠ gene on the order level

圖4 18S rRNA基因門水平上群落組成圖Fig.4 The community composition diagram for 18S rRNA gene on the phyla level

3.3 α多樣性分析

COⅠ基因的Chao和ACE指數(shù)表明J1、J2和F2的群落豐富度相對(duì)較高,Z1、W2和Z2的則相對(duì)較低；Simpson和Shannon指數(shù)表明J1、Z2和F2的群落多樣性相對(duì)較高,而J2、D1和W2的則相對(duì)較低。18S rRNA基因的Chao和ACE指數(shù)表明J1、D1和J2的群落豐富度相對(duì)較高,而F1、F2和W1的則相對(duì)較低,Simpson和Shannon指數(shù)表明J1、Z1和W2的群落多樣性相對(duì)較高,而F2、F1、和D2的則相對(duì)較低。整體來看,J、F、D的群落豐富度和群落多樣性相對(duì)較高, Z、W的則相對(duì)較低。

3.4 β多樣性分析

用樣品間物種進(jìn)化和豐度信息,進(jìn)行Unifrac分析,得到樣品間差異距離矩陣,然后用差異距離矩陣進(jìn)行PCoA分析,得到PCoA圖,如圖5所示,圖中兩點(diǎn)之間的距離越近說明兩者之間的生物群落差異性越小。18S rRNA基因的PCoA圖顯示：Z1、D2和J1,J2和D1之間的生物群落結(jié)構(gòu)差異性較小；COⅠ基因的PCoA圖顯示：D1、Z1、D2和J2,Z2和W2之間的生物群落差異性較小。

圖5 各樣品在對(duì)群落結(jié)構(gòu)影響最大兩因素下的PCoA圖Fig.5 The PCoA diagram for each sample in the two most important factors that affect the community structure

3.5 聚類分析

18S rRNA基因的聚類情況顯示Z2、J2和D2,F2和F1,W1和W2,Z1和D1在屬水平上群落相似性相對(duì)較高(圖6)；COⅠ基因的聚類情況顯示J2、D2、D1和Z2,J1和W1,F1和F2,Z1和W2在屬水平上的群落相似性相對(duì)較高(圖7)。

圖6 18S rRNA基因在屬水平上的Heatmap圖Fig.6 The heatmap diagram for 18S rRNA gene on the genus level

圖7 各樣品COⅠ基因在屬水平上的Heatmap圖 Fig.7 The heatmap diagram for COⅠ gene on the genus level

4 分析與討論

4.1 環(huán)境因素與結(jié)果討論

由于水環(huán)境的復(fù)雜性和多變性,使得水生生物多樣性受多方面影響,其可以分為自然因素和人為因素兩個(gè)方面[12]。自然因素主要包含上下游、水體深淺以及流動(dòng)性等,而人為因素主要是指人類活動(dòng)對(duì)生物多樣性的影響。本文主要從以上這些方面對(duì)秦嶺水域的水生動(dòng)物多樣性做了初步調(diào)查。

對(duì)于水流來說,水的流動(dòng)性會(huì)讓上游的營養(yǎng)物質(zhì)向下游流動(dòng),使得下游的營養(yǎng)高于上游,從而導(dǎo)致下游的物種豐富度高于上游[22]。從venn圖可以看到,各樣地下游的物種豐度普遍高于上游；群落結(jié)構(gòu)圖顯示,各樣地下游的群落結(jié)構(gòu)比上游的復(fù)雜,并且下游群落結(jié)構(gòu)中優(yōu)勢(shì)物種的含量也高于上游；從α多樣性指數(shù)可以看到,雖然個(gè)別樣品上游的群落豐富度和群落多樣性較下游的高,但絕大多數(shù)樣品下游的群落豐富度和群落多樣性還是較上游的高?？梢?本次調(diào)查也表明下游的物種豐富度要高于上游。

實(shí)驗(yàn)選擇了秦嶺中5個(gè)淡水水域：灃峪口、五臺(tái)山、子午峪、金龍峽和石砭峪,其中灃峪口,金龍峽和石砭峪在景區(qū)內(nèi),人為干擾較大,而子午峪和五臺(tái)山相對(duì)來說人為干擾較小,基本上處于自然狀態(tài)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出各樣地之間的不同：如各樣地物種豐度的大小順序是：W

對(duì)一個(gè)生態(tài)系統(tǒng)來說,影響生物多樣性的因素是多方面的,除了前面所述的上下游和人為活動(dòng)的影響外,本實(shí)驗(yàn)還關(guān)注了水的深淺、流動(dòng)性以及陽光的有無對(duì)生物多樣性的影響。如取自深水的D2和F1樣品與取自淺水的D1和F2樣品,跟其他都取自淺水的樣品相比,有相對(duì)較多的共有物種； PCoA圖分析表明不同環(huán)境因素下樣品的群落結(jié)構(gòu)差異性較大,而相似環(huán)境因素下樣品的群落結(jié)構(gòu)差異性則相對(duì)較小,如J2和D2都是取自較陰暗的上游流動(dòng)水,取樣環(huán)境相似,因此它們之間的群落結(jié)構(gòu)差異性相對(duì)較小。此外,Heatmap圖也顯示,環(huán)境相似性較高的樣品首先聚集在一起,并且群落相似性相對(duì)較高,如Z1和D1都是取自較淺的下游靜水,取樣環(huán)境相似,因此它們首先聚類在一起,表明它們之間的群落相似性相對(duì)較高。

4.2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,兩個(gè)分子標(biāo)記所得的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致。這主要是由于每個(gè)基因的通用引物在不同類群中的擴(kuò)增能力和在數(shù)據(jù)庫中的覆蓋范圍不同導(dǎo)致的。對(duì)基于高通量測(cè)序的復(fù)合條形碼技術(shù)來說,由于樣品的復(fù)雜性和多重性,在研究時(shí)如果選擇多個(gè)分子標(biāo)記基因可能會(huì)得到更全面的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,如本論文中18S rRNA基因鑒定了9門42綱52目,COⅠ基因鑒定了5門11綱36目,而兩個(gè)分子標(biāo)記基因共同鑒定了10門48綱89目。Carew[25]等人的研究結(jié)果也表明,使用兩個(gè)或兩個(gè)以上的分子標(biāo)記可以更全面的鑒定到樣本中所包含的物種。這使得一些依賴于類群數(shù)計(jì)算的各種生物多樣性指數(shù),將變得更加準(zhǔn)確。但是在使用多個(gè)分子標(biāo)記進(jìn)行分析時(shí),由于每個(gè)分子標(biāo)記在進(jìn)化速率和單獨(dú)鑒定的類群上不同,可能使得構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹之間有區(qū)別,從而影響了依賴于系統(tǒng)發(fā)育樹計(jì)算的unifrac分析結(jié)果。

目前,應(yīng)用DNA復(fù)合條形碼技術(shù)對(duì)生物多樣性的研究越來越多,但是關(guān)于復(fù)合條形碼技術(shù)的一些本質(zhì)問題仍然沒有得到很好的解決。其中一個(gè)最主要的問題就是：復(fù)合條形碼技術(shù)只能做定性分析,而不能很準(zhǔn)確的進(jìn)行定量分析。在研究中,一直用序列數(shù)的多少來表示物種個(gè)體數(shù)量的多少,雖然有些研究認(rèn)為序列數(shù)與物種的個(gè)體數(shù)之間存在相關(guān)性,但也僅僅是它們的變化趨勢(shì)相對(duì)一致,而并不是很完美的契合。因此,在分析的過程中,只能用序列數(shù)大致的估計(jì)物種的個(gè)體數(shù),而不能完全用序列數(shù)來代替物種的個(gè)體數(shù)。Piol[26]等人的研究也表明復(fù)合條形碼技術(shù)的定量研究能力有限,只有定性分析的結(jié)果才是可靠的。對(duì)于本研究來說,有些分析會(huì)不可避免的應(yīng)用到物種個(gè)體數(shù)的多少,如群落結(jié)構(gòu)圖中各樣本中類群的含量,以及α多樣性中的Shannon指數(shù)等,所以對(duì)于這些結(jié)果,只能定性來看,如果想要得到更加精確的結(jié)果,還須進(jìn)一步的驗(yàn)證。當(dāng)然,在本實(shí)驗(yàn)中也避免了一些用物種個(gè)體數(shù)的分析,如沒有使用Bray-Curis指數(shù)進(jìn)行β多樣性的分析,而是使用了依賴于物種數(shù)和進(jìn)化信息的jaccard和unweighted_unifrac指數(shù)進(jìn)行β多樣性和后續(xù)的分析。但是,生態(tài)學(xué)研究中的群落組成和群落結(jié)構(gòu)以及群落之間的關(guān)系,都是依賴于物種的個(gè)體數(shù)量,所以DNA復(fù)合條形碼技術(shù)還不能很準(zhǔn)確的應(yīng)用到生態(tài)學(xué)研究中的每一個(gè)方面。

雖然復(fù)合條形碼技術(shù)還不能更精確的進(jìn)行生物多樣性研究,但相比于傳統(tǒng)耗時(shí)耗力以及單一的物種鑒定和生物多樣性研究,復(fù)合條形碼技術(shù)有明顯的優(yōu)勢(shì)：它能在短時(shí)間對(duì)大量復(fù)合樣本進(jìn)行物種鑒定和生物多樣性研究,既省時(shí)又省力。隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步和提高,條形碼數(shù)據(jù)庫的全面和完善,生物信息學(xué)軟件的開發(fā)和使用,復(fù)合條形碼技術(shù)將會(huì)成為生物多樣性研究的主要方法,并且準(zhǔn)確性也會(huì)大幅度提高,更重要的是它將能夠進(jìn)行更大尺度和更大規(guī)模的生物多樣性研究。

[1] Taberlet P, Coissac E, Pompanon F, Brochmann C, Willerslev E. Towards next-generation biodiversity assessment using DNA metabarcoding. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 2045- 2050.

[2] Ji Y Q, Ashton L, Pedley S M, Edwards D P, Tang Y, Nakamura A, Kitching R, Dolman P M, Woodcock P, Edwards F A, Larsen T H, Hsu W W, Benedick S, Hamer K C, Wilcove D S, Bruce C, Wang X Y, Levi T, Lott M, Emerson B C, Yu D W. Reliable, verifiable and efficient monitoring of biodiversity via metabarcoding. Ecology Letters, 2013, 16(10): 1245- 1257.

[3] Coissac E, Riaz T, Puillandre N. Bioinformatic challenges for DNA metabarcoding of plants and animals. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 1834- 1847.

[4] Yang C X, Ji Y Q, Wang X Y, Yang C Y, Yu D W. Testing three pipelines for 18S rDNA-based metabarcoding of soil faunal diversity. Science China Life Sciences, 2013, 56(1): 73- 81.

[5] Hajibabaei M, Shokralla S, Zhou X, Singer G A C, Baird D J. Environmental barcoding: A next-generation sequencing approach for biomonitoring applications using river benthos. PLoS One, 2011, 6(4): e17497.

[6] Nolte V, Pandey R V, Jost S, Medinger R, Ottenw?lder B, Boenigk J, Schl?tterer C. Contrasting seasonal niche separation between rare and abundant taxa conceals the extent of protist diversity. Molecular Ecology, 2010, 19(14): 2908- 2915.

[7] Poretsky R S, Hewson I, Sun S L, Allen A E, Zehr J P, Moran M A. Comparative day/night metatranscriptomic analysis of microbial communities in the North Pacific subtropical gyre. Environmental Microbiology, 2009, 11(6): 1358- 1375.

[8] Schmidt PA, Bálint M, Greshake B, Bandow C, R?mbke J, Schmitt I. Illumina metabarcoding of a soil fungal community. Soil Biology & Biochemistry, 2013, 65: 128- 132.

[9] Bálint M, Schmidt P A, Sharma R, Thines M, Schmitt I. An Illumina metabarcoding pipeline for fungi. Ecology and Evolution, 2014, 4(13): 2642- 2653.

[10] Soininen E M, Zinger L, Gielly L, Bellemain E, Brathen K A, Br?chmann C, Epp L S, Gussarova G, Hassel K, Henden J A, Killengreen S T, R?m? T, Sten?ien H K, Yoccoz N G, Ims R A. Shedding new light on the diet of Norwegian lemmings: DNA metabarcoding of stomach content. Polar Biology, 2013, 36(7): 1069- 1076.

[11] J?rgensen T, Kjer K H, Haile J, Rasmussen M, Boessenkool S, Andersen K, Coissac E, Taberlet P, Brochmann C, Orlando L, Gilbert M T P, Willerslev E. Islands in the ice: detecting past vegetation on Greenlandic nunataks using historical records and sedimentary ancient DNA Meta-barcoding. Molecular Ecology, 2012, 21(8): 1980- 1988.

[12] 章繼華, 何永進(jìn). 我國水生生物多樣性及其研究進(jìn)展. 南方水產(chǎn), 2005, 1(3): 69- 72.

[13] 劉曉清, 張霞, 王亞萍, 成西娟. 秦嶺地區(qū)生物多樣性及其保護(hù)對(duì)策. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(12): 7365- 7367, 7496.

[14] Caporaso J G, Kuczynski J, Stombauqh J, Bittinger K, Bushman F D, Costello E K, Fierer N, Pea A G, Goodrich J K, Gordon J I, Huttley G A, Kelley S T, Knights D, Koenig J E, Ley R E, Lozupone C A, McDonald D, Muegge B D, Pirrung M, Reeder J, Sevinsky J R, Turnbaugh P J, Walters W A, Widmann J, Yatsunenko T, Zaneveld J, Knight R. QIIME allows analysis of high-throughput community sequencing data, Nature Methods, 2010, 7(5): 335- 336.

[15] Schloss P D, Westcott S L, Ryabin T, Hall J R, Hartmann M, Hollister E B, Lesniewski R A, Oakley B B, Parks D H, Robinson C J, Robinson C J, Sahl J W, Stres B, Thallinger G G, Van Horn D J, Weber C E. Introducing mothur: open-source, platform-independent, community-supported software for describing and comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(23): 7537- 7541.

[16] Edqar R C. Search and clustering orders of magnitude faster than BLAST. Bioinformatics, 2010, 26(19): 2460- 2461.

[17] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, Gerken J, Schweer T, Yarza P, Peplies J, Gl?ckner F O. The SILVA ribosomal RNA gene database project: improved data processing and web-based tools. Nucleic Acids Research, 2013, 41(D1): D590- 596.

[18] Lozupone C, Knight R. Unifrac: a new phylogenetic method for comparing microbial communities. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(12): 8228- 8235.

[19] Lozupone C, Hamady M, Knight R. Unifrac-An online tool for comparing microbial community diversity in a phylogenetic context. BMC Bioinformatics, 2006, 7:371.

[21] Deng W K, Wang Y B, Liu Z X, Cheng H, Xue Y. HemI: A Toolkit for Illustrating Heatmaps. PLoS One, 2014, 9(11): e111988.

[22] 周桔, 雷霆. 土壤微生物多樣性影響因素及研究方法的現(xiàn)狀與展望. 生物多樣性, 2007, 15(3): 306- 311.

[23] 羅天相, 劉莎. 中度放牧干擾對(duì)草地生物多樣性影響的思考. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(21): 6567- 6568, 6612.

[24] 何飛, 何亞平, 黃登才, 劉興良, 費(fèi)世民, 慕長(zhǎng)龍, 蔣俊明, 陳秀明, 隆廷倫, 張旭東. 放牧的環(huán)境效應(yīng)及其對(duì)環(huán)境保護(hù)的負(fù)面影響. 四川林業(yè)科技, 2009, 30(3): 43- 54.

[25] Crarew M E, Pettigrove V J, Metzeling L, Hoffmann A A. Environmental monitoring using next generation sequencing: rapid identification of macroinvertebrate bioindicator species. Frontiers in Zoology, 2013, 10(1): 45.

Characterizing the aquatic biodiversity of the Qinling Mountains using DNA metabarcoding approach

LI Jie, YANG Jing, HUANG Yuan*

CollegeofLifeSciences,ShaanxiNormalUniversity,Xi′an710062,China

DNA metabarcoding, a technique based on next-generation genetic sequencing, enables the rapid characterization of species composition in bulk biodiversity samples or when analyzing environmental DNA, and thus facilitates comprehensive, large-scale biodiversity assessments and monitoring. The Qinling Mountain range, extending in an east-west direction across central China, includes a series of valleys traversed by mountain streams of various sizes. Although these streams potentially contain an array of aquatic organisms, the complexity of the environment and the presence of small, cryptic, rare, or poorly characterized species makes studying the aquatic biodiversity of these streams a challenge. The goal of this study was to use DNA metabarcoding to examine the composition of both the aquatic fauna and of the aquatic communities as a whole in the Qinling Mountain streams, employing alpha diversity, beta diversity and cluster analyses to evaluate differences in biodiversity from samples collected from different locations. For this purpose, 10 samples containing both zooplankton and zoobenthos were collected from downstream and upstream locations of five streams (Jin Longxia, Shi Bianyu, Feng Yukou, Wutai Mountain and Meridian Valley) in the Qinling Mountains. The cytochromecoxidase subunit Ⅰ (COⅠ) and 18S ribosomal RNA (18S rRNA) genes were selected as barcoding sequences. Following DNA extraction and PCR amplification using degenerate primers, the amplicons were sequenced on an Illumina MiSeq platform, and Qiime and Mothur software were used to analyze the raw data and to obtain an operational taxonomic unit (OTU) list. Ecological analysis was subsequently performed using Excel, R, and Qiime software. Analysis of the fauna composition revealed that a total of 89 orders, from 48 classes, and 10 phyla were identifiable in the total group of samples using the two gene markers. Individually, 52 orders, from 42 classes, and 9 phyla were identified using the 18S rRNA sequences, and 36 orders, from 11 classes, and 5 phyla were identified using the COⅠ sequences, demonstrating that the two gene markers together resulted in a higher rate of identification than either marker alone. With regard to community composition, analysis of COⅠ gene sequences revealed that the Arthropod orders Diptera, Trichoptera, Ephemeroptera and Coleoptera were the most common taxa, with lower occurrences of Protozoa and Rotifera. Analysis of community composition using the 18S rRNA gene sequences, on the other hand, indicated three main groups in the samples, namely the Arthropda, Mollusca and Platyhelminthes. Both the fauna composition and community composition analyses showed that the number of groups in the downstream samples was higher than that in the upstream samples. Moreover, alpha diversity analysis revealed that the three sampling plots (Jin Longxia, Shi Bianyu and Feng Yukou) most intensively affected by human activities had relatively high values of community richness and diversity compared with the two more natural sampling plots (Wutai Mountain and Meridian Valley), suggesting that aquatic biodiversity may be improved if a location has a certain degree of external interference. Finally, beta diversity analysis demonstrated that, although community variations may be very obvious when samples collected from different environments are compared, such variations may not be so obvious in samples collected from similar environments, with cluster analysis showing that community similarity values in such samples are relatively high.

DNA metabarcoding; Qinling Mountains; aquatic animal; biodiversity

國家自然科學(xué)基金(31372192)

2015- 05- 13;

2016- 03- 21

10.5846/stxb201505130981

*通訊作者Corresponding author.E-mail: yuanh@snnu.edu.cn

李杰, 楊婧，黃原.應(yīng)用DNA復(fù)合條形碼技術(shù)研究秦嶺水生動(dòng)物多樣性.生態(tài)學(xué)報(bào),2016,36(19):6103- 6112.

Li J, Yang J, Huang Y.Characterizing the aquatic biodiversity of the Qinling Mountains using DNA metabarcoding approach.Acta Ecologica Sinica,2016,36(19):6103- 6112.