腸炎清對(duì)ICUC大鼠結(jié)腸組織TLR4、NF—κB蛋白表達(dá)、TLR4mRNA的影響

黃亦彤+鐘志勇+呂永慧+藍(lán)天美+潘競(jìng)鏘+武昕

摘要：目的通過觀察腸炎清對(duì)免疫復(fù)合潰瘍型結(jié)腸炎模型（ICUC）大鼠結(jié)腸組織Toll樣受體4（TLR 4）和核因子-κB（NF-κB）表達(dá)的影響，探討腸炎清治療IBD的作用機(jī)制。方法采用三硝基苯磺酸（TNBS）加免疫復(fù)合法造模。將大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、腸炎清低、中、高劑量組（833、1667、3333mL/kg）、柳氮磺吡啶（SASP）組（05g/kg）。造模后第2 d，用藥組分別給予相應(yīng)藥物灌胃7d，給藥7天后麻醉處死大鼠，取新鮮結(jié)腸標(biāo)本，采用免疫組化法檢測(cè)TLR 4、NF-κBp65的表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR法（qRT-PCR）檢測(cè)TLR 4mRNA的表達(dá)。結(jié)果免疫組化結(jié)果：NF-κBp65和TLR4在各組各只動(dòng)物均可見陽性表達(dá)，其中腸炎清高劑量組及SASP組可顯著下調(diào)NF-κBp65的表達(dá)，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<005）。TLR4在各給藥組與模型組比較未見顯著差異（P>005）。PCR結(jié)果：與模型對(duì)照組相比，各給藥組大鼠結(jié)腸組織TLR4表達(dá)均為陽性，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。結(jié)論下調(diào)TLR4、NF-κBp65的表達(dá)，是腸炎清治療IBD的作用機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：腸炎清；潰瘍性結(jié)腸炎；ICUC大鼠；TLR4；NF-κBp65

中圖分類號(hào)：R2855文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1007-2349（2016）09-0072-04

【Abstract】Objective： To observe the effect of Changyanqing on the colon tissue Toll-like receptor 4 （TLR 4） and nuclear factorκB （NF-κB） expression of immune complexes ulcerative colitis （ICUC） rats and explore its mechanism to treat IBD. Methods： Trinitrobenzene sulfonic acid （TNBS） plus immune complex was used to make models. Rats were randomly divided into a control group， a model control group， Changyanqing groups with low， medium and high dose （833， 1667， 3333mL/kg） and sulfasalazine （SASP） group （0.5g/kg）. In the following the day after modeling， the treatment groups were administered with corresponding drugs for 7 days， and the rats were sacrificed 7 days later to take their fresh colonic samples. Immunohistochemistry was used to detect TLR 4 and NF-κBp65 expression， and RT-PCR method to detect TLR 4mRNA expression. Results： Immunohistochemical results： NF-κBp65 and TLR4 in each group can be seen positive expression， among which the expression of NF-κBp65 of Changyanqing group with high dose and SASP group could be significantly down-regulated， and there are significant differences （P<005）. TLR4 in each treatment group and the model group showed no significant difference （P>005）. PCR Results， compared with the model group， TLR4 expressions of the colon tissue of each administration group were positive， but there was no significant difference （P>005）. Conclusion： Changyanqing can down-regulate TLR4， NF-κBp65 expression， and its mechanism may be related to the regulation of TLR4 / NF-κB signal pathway.

【Key words】Changyanqing， ulcerative colitis， ICUC rats， TLR4， NF-κBp65

屬非特異性的自發(fā)免疫性疾病，病變主要累及結(jié)腸黏膜和黏膜下層，臨床主要表現(xiàn)為反復(fù)腹痛、腹瀉、黏液血便等。其病因和發(fā)病機(jī)理至今仍不清楚，既往研究認(rèn)為，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的失衡在IBD的發(fā)生發(fā)展中占有極其重要的地位。近年來不少研究發(fā)現(xiàn)，炎癥介質(zhì)及細(xì)胞因子可導(dǎo)致機(jī)體多條信號(hào)通路活化，直接或間接地影響炎癥介質(zhì)的表達(dá)，導(dǎo)致腸黏膜受損產(chǎn)生。

腸炎清是由我院自行研制的純中藥制劑，臨床用于口服和灌腸治療IBD、慢性腹瀉、結(jié)腸息肉電切術(shù)后致腸黏膜受損、腸道菌群失調(diào)及腸功能障礙等。該藥主治以濕熱內(nèi)蘊(yùn)型為多見的腸炎，或兼有脾胃虛弱、氣滯血淤，對(duì)受損腸黏膜有顯著的治療作用。腸炎清[1]經(jīng)結(jié)腸途徑治療，對(duì)UC尤其是輕到中度UC 能夠顯著縮短療程，減少或避免使用激素及SASP，減輕病人的痛苦。腸炎清在動(dòng)物炎癥模型中表現(xiàn)出良好的抗炎效應(yīng)[2-3]。

本研究采用免疫復(fù)合潰瘍型結(jié)腸炎（ICUC）大鼠模型，通過觀察腸炎清對(duì)ICUC大鼠TLR4、NF-κBp65表達(dá)的影響，探討腸炎清的作用機(jī)制。

1材料與方法

11材料

111實(shí)驗(yàn)藥物腸炎清：廣州市中醫(yī)醫(yī)院自制，2～8℃保存，批號(hào)：151128。柳氮磺吡啶腸溶片：上海信誼天平藥業(yè)有限公司，批號(hào)：09141109生產(chǎn)日期：20141024；有效期至：201610。

112動(dòng)物SD大鼠48只，雌性180～200g；SPF級(jí)；新西蘭兔，雄性3kg左右；普通級(jí)，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)44007200024500，兔實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證明編號(hào)44411600001758、44411600001799。

113試劑石蠟：茂名市大川特種蠟廠有限公司。環(huán)保透明劑：上海宏茲實(shí)業(yè)有限公司。無水乙醇、95%乙醇、曙紅（水溶）：廣州中南化學(xué)試劑有限公司。蘇木素：GEMADA，Biological Stain Commission，Inc。PBS緩沖液：pH72～76、枸櫞酸鹽緩沖液：pH60，武漢博士德生物工程有限公司。

NF-κB p65 抗體：Arigo Biolaboratories集團(tuán)公司，TLR4 抗體：羅福斯生物制劑公司，GTVisionTM Ⅲ檢測(cè)系統(tǒng)/Mo&Rb：基因技術(shù)（上海）公司，正常山羊血清：Jackson ImmunoResearch實(shí)驗(yàn)公司，定量PCR用的SYBR Green qPCR SuperMix購自Invitrogen公司，

114儀器TS-12C型生物組織全自動(dòng)脫水機(jī)：湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。EG1150型生物組織包埋機(jī)：LEICA，德國。RM2235型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)：LEICA，德國。CS-VI型攤片烤片機(jī)：湖北孝感醫(yī)用儀器有限公司。BX43型生物顯微鏡：OLYMPUS，日本。定量PCR儀：ABI PRISM 7500 Sequence Detection System。

CellSens Standard顯微圖像軟件：OLYMPUS，日本。Image-Pro Plus version 60圖像分析軟件：Image-Pro 美國。

12方法

121模型建立健康SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后建模，造模前禁食24h。：取50g/L TNBS溶液與50%乙醇溶液以體積比1∶1混合配成25g/L三硝基苯磺酸（TNBS）乙醇溶液；刮取新西蘭兔結(jié)腸黏膜制成組織勻漿，以3000r/min速度離心30min，取上清液，檢測(cè)其蛋白含量并調(diào)節(jié)至20g/L，與等量完全弗氏佐劑混合配成抗原乳化液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

動(dòng)物免疫：模型組大鼠全部于第1天、第14天在大鼠頸、背部注射抗原乳化液（體積為08mL/只動(dòng)物，含抗原8mg）。第21天，所有大鼠禁食不禁水24h，第22天，各組大鼠TNBS乙醇溶液灌腸造模。

造模方法：大鼠戊巴比妥鈉麻醉，將一直徑20 mm、長(zhǎng)約12 cm的塑膠管由肛門輕緩插入大鼠體內(nèi)深約8cm，按照TNBS 75mg/kg的劑量，03mL/100g體重的給藥體積緩慢注入25g/LTNBS乙醇溶液，然后注入約01mL的空氣，將留在塑膠管內(nèi)的藥物排入腸內(nèi)。給藥完畢，緩慢拔出塑膠管，用手捏住肛門，提起大鼠尾部，持續(xù)倒置1min，使造模劑充分滲入大鼠腸腔內(nèi)?？瞻讓?duì)照組注入等量的生理鹽水。驗(yàn)證模型：造模后第2天隨機(jī)選取4只模型組大鼠麻醉后放血處死，剖腹取直腸和結(jié)腸，生理鹽水清洗后肉眼觀察結(jié)腸充血水腫情況，驗(yàn)證模型。

122動(dòng)物分組及給藥選取40只成模大鼠，隨機(jī)分為5組。造模后第3天各組開始灌胃給藥：腸炎清低、中、高劑量組按照833、1667、3333mL/kg（按照人臨床用量的5、10、20倍折算）；SASP組按05g/kg；給藥體積17mL/100g體重，2次/d，連續(xù)7天；空白對(duì)照組和模型對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。

123標(biāo)本處理末次給藥后24h，戊巴比妥鈉麻醉、放血處死大鼠，開腹，取自肛門向上約10cm結(jié)腸段，沿腸系膜縱軸剪開，生理鹽水沖洗，取一半用4%中性甲醛固定，用于組織病理和免疫組化檢查，另一半液氮速凍，用于PCR檢測(cè)。

124觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1241免疫組化法檢測(cè)TLR4和NF-κBp65表達(dá)組織標(biāo)本經(jīng)取材、固定、修切、流水沖洗、脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、石蠟切片（防脫）、脫蠟至水、抗原修復(fù)（微波法）、封閉內(nèi)源性過氧化物酶、血清封閉、一抗孵育、二抗孵育、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水透明、封片。

每張切片放大400倍隨機(jī)選取3個(gè)視野觀察，細(xì)胞呈棕黃色為陽性，定位以細(xì)胞核為主。用圖像分析軟件分別測(cè)定各個(gè)視野的平均光密度值，取均值作為每張切片的平均光密度值。

1242qRT-PCR法檢測(cè)TLR4mRNA表達(dá)[4]Trizol 法提取結(jié)腸組織RNA進(jìn)行qRT-PCR擴(kuò)增。樣品1μl，1%瓊脂糖凝膠電泳80V×20min，用凝膠成像系統(tǒng)觀察總RNA的5s rRNA，18s rRNA和28s rRNA條帶，三條條帶完整可證明RNA抽提比較完整。

逆轉(zhuǎn)錄：RNase free的PCR管中配置溶液Total RNA10μg+H2O總體積12μl，將溶液吹打均勻，置85℃保溫5min，使RNA變性。隨后立即冰上致冷，以防止RNA復(fù)性；在該P(yáng)CR管中加入下列試劑Oligo（dT）15 05μl、Random primer（6-mer）05μl、二者濃度都是10uM、dNTP20μl、RNase inhibitor 05μl、5 x buffer 40μl、M-MLV 05μl總體積80μl。將上述20μl反應(yīng)溶液30℃保溫10min；42℃保溫60min；85℃保溫10min。

定量PCR：檢測(cè)序列片段。內(nèi)參片段：GAPDH-200bp，目的片段：TLR4-386bp

引物序列見表1。

并列表說明，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示（x±s），采用SPSS210統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料數(shù)據(jù)若方差齊，則采用單因素方差分析，組間比較用LSD法，若方差不齊，數(shù)據(jù)經(jīng)轉(zhuǎn)換后方差仍不齊，采用秩和檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2結(jié)果）PCR表達(dá)結(jié)果（x±s，n=8）：空白對(duì)照組：（274±164）；模型對(duì)照組：（311±199）；腸炎清低劑量組：（249±156）；腸炎清中劑量組：（318±185）；腸炎清高劑量組：（359±173）；SASP組：（362±236）。

與空白對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)有所增加，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。與模型對(duì)照組相比，各給藥組大鼠結(jié)腸組織TLR4的表達(dá)均有不同程度的降低，但未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>005）。

3小結(jié)

免疫組化法結(jié)果顯示：NF-κB和TLR4在各組各只動(dòng)物均可見陽性表達(dá)，具體情況如下：

NF-κB：主要表達(dá)部位為黏膜層頂端上皮細(xì)胞胞漿、腸腺近腸腔側(cè)上皮細(xì)胞胞漿、黏膜固有層及黏膜下層結(jié)締組織以及炎性細(xì)胞胞漿。模型對(duì)照組表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組。各給藥組較模型對(duì)照組NF-κB表達(dá)下調(diào)，腸炎清高劑量組及SASP組NF-κB表達(dá)量顯著低于模型對(duì)照組。

TLR4：主要表達(dá)部位與NFκB的表達(dá)部位一致，模型對(duì)照組表達(dá)量顯著高于空白對(duì)照組，各給藥組較模型對(duì)照組表達(dá)下調(diào)，但未見顯著差異。

qRT-PCR結(jié)果顯示：造模后動(dòng)物結(jié)腸組織TLR4mRNA的表達(dá)量有所升高，但未見顯著差異。與模型組相較，各給藥組TLR4mRNA表達(dá)均有不同程度的下調(diào)，但未見顯著差異。

4討論

TLR4是人類發(fā)現(xiàn)的第一個(gè)TLR相關(guān)蛋白，主要表達(dá)在參與宿主防御功能的細(xì)胞上。TLR4最突出的生物學(xué)功能是促進(jìn)細(xì)胞因子的合成與釋放，引發(fā)炎癥反應(yīng)。其介導(dǎo)炎癥發(fā)生的相關(guān)機(jī)制目前已經(jīng)研究得比較透徹，TLR4識(shí)別病原相關(guān)分子模式（pathogen-associated molecule pattern，PAMPS）并與之結(jié)合，經(jīng)下游的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路最終導(dǎo)致 NF-κB 的激活，引發(fā)白 細(xì) 胞 介 素-1（IL -1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等炎性因子的釋放，介導(dǎo)炎癥的發(fā)生。

TLR4通過兩條經(jīng)典的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活 NF-κB：My D88 依賴性和My D88 非依賴性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑。MyD88 是含有TLR 結(jié)構(gòu)域的接頭蛋白，是TLR 信號(hào)通路的下游信號(hào)因子，在TLR 信號(hào)通路中有關(guān)鍵性的作用[5-6]。其結(jié)構(gòu)上有3 個(gè)功能區(qū)域：N 端的死亡區(qū)（deathdomain，DD）；與Toll 樣受體同源結(jié)構(gòu)域結(jié)合的羧基末端及C 端的類似于IL-1 受體胞質(zhì)區(qū)的Toll 區(qū)。DD與白細(xì)胞介素-1 受體相關(guān)激酶（interleukon-1 receptorassociated kinase，IRAK）的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并引起IRAK 的自身磷酸化，再經(jīng)過一系列的激活反應(yīng)，最終引起I-κB 的活化，導(dǎo)致NF-κB 的激活和轉(zhuǎn)位，造成炎性細(xì)胞因子的合成與釋放，從而誘發(fā)機(jī)體本身的炎癥反應(yīng)過程。

NF-κB在UC的發(fā)生、發(fā)展中是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，是多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，在調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)的基因中起關(guān)鍵作用[7]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)各種與UC相關(guān)的細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8可通過啟動(dòng)NF-κB等轉(zhuǎn)錄因子誘發(fā)或加劇機(jī)體的炎癥反應(yīng)[8]。NF-κB的激活導(dǎo)致TNF-α、IL-1β轉(zhuǎn)錄增加，而TNF-α、IL-1β的釋放又進(jìn)一步激活NF-κB。后者通過正反饋進(jìn)一步增加TNF-α、IL-1β的分泌，同時(shí)使IL-6和IL-8等的表達(dá)亦增加。由此產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使炎癥不斷放大，形成“瀑布效應(yīng)”。有研究表明[9]應(yīng)用NF-κB抑制劑能改變患者的炎癥狀態(tài)。

本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，腸炎清對(duì)TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)、TLR4mRNA表達(dá)出現(xiàn)不同程度下調(diào)，其中，腸炎清高劑量組與SASP組顯著下調(diào)NF-κBp65表達(dá)，證明腸炎清高劑量組與SASP組一樣，對(duì)ICUC大鼠可以抑制炎癥反應(yīng)，減少結(jié)腸黏膜損傷。

由此判斷，下調(diào)TLR4、NF-κBp65蛋白表達(dá)、TLR4mRNA表達(dá)，是腸炎清的作用機(jī)制之一。但要明確腸炎清治療IBD的作用靶點(diǎn)，還需要做更為深入和全面的研究。

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